楊弘 李煌 林露敏 曾建偉 ，3 魏麗慧 ， 彭軍， 林久茂，3#

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州350122；2福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 福州350122；3福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室 福州350122）

大腸癌作為世界上一種常見的惡性消化道腫瘤，其發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重危害人類健康[1]。據(jù)統(tǒng)計在惡性腫瘤中，我國大腸癌患者每年的病死率居第三位[2]。目前臨床上大腸癌的主要治療方法是以手術(shù)切除為主結(jié)合放療、化療等綜合治療，但經(jīng)綜合治療后仍有50%以上的患者在5年后發(fā)生復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。同時，以5-FU為基礎(chǔ)的化療能夠有效控制大腸癌的發(fā)展，但化療所產(chǎn)生的毒副反應(yīng)及多藥耐藥嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量及預(yù)后，這成為亟待解決的臨床難題[3]。而中醫(yī)藥治療大腸癌等多種腫瘤療效確切，它具有整體調(diào)節(jié)作用，且毒副作用小，受到廣大醫(yī)療科研工作者的青睞。清解扶正顆粒（Qingjiefuzheng Granules，QFG）是由白花蛇舌草、半枝蓮、炙黃芪、炒麥芽等組成，具有清熱解毒、益氣健脾消食等功效的中成藥顆粒劑，臨床輔助化療藥物治療大腸癌等惡性腫瘤，具有改善患者的生活質(zhì)量、減輕胃腸不良反應(yīng)等作用，但其抑制大腸癌細胞的作用機制尚不清楚。為探討QFG對大腸癌的抑制作用機制，本研究通過體外細胞實驗觀察QFG對大腸癌HCT-116和HCT-8細胞增殖和凋亡的影響。現(xiàn)報告如下：

1 材料與方法

1.1 藥物與細胞株 清解扶正顆粒由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑室提供，用磷酸鹽緩沖液（PBS）配成200 mg/ml儲存溶液，超聲30 min助溶，用0.45 μm過濾器過濾，再用培養(yǎng)基配成所需要的濃度（對照組為 0 mg/ml，實驗組分別為 0.5、1、2 mg/ml）。大腸癌細胞株（HCT-116、HCT-8）購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。

1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、雙抗（青霉素-鏈霉素）、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶（Trypsin）、二甲亞砜（DMSO）均購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）干粉購自北京索萊寶科技有限公司；PBS購自美國Hyclone公司；細胞周期試劑盒、Annexin V/PI染色試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司。1.3 儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱、－80℃超低溫冰箱（美國Thermo公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica儀器有限公司）；形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)LAS V4.1、Countes全自動細胞計數(shù)儀（美國Life公司）。

1.4 細胞培養(yǎng) 將大腸癌細胞株HCT-116、HCT-8分別培養(yǎng)于含10%FBS、1%雙抗（含100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素）的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，并于37℃、5%CO2和飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞單層貼壁生長至匯合度為80%～90%時，加入1 ml的胰蛋白酶消化1～3 min，隨后加入2 ml完全培養(yǎng)基終止消化，于離心機中1 000 r/min離心3 min后，吸棄上清并收集沉淀細胞用于后續(xù)實驗。

1.5 MTT法檢測細胞增殖 收集HCT-116、HCT-8細胞，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為1×105個/ml的細胞懸液，并按100 μl/孔的原則均勻地接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)每孔細胞的匯合度達到50%～60%時，輕輕吸走原孔中培養(yǎng)基，隨后每孔分別加入100 μl不同濃度QFG（終濃度分別為 0 mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml），干預(yù)24 h或48 h后再次吸走原孔中溶液，并加入等體積的 MTT 溶液（100 μl/孔，0.5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后吸棄各孔中的液體，每孔加入等體積DMSO并振蕩混勻，于酶標(biāo)儀570 nm波長處測定各孔吸光度值（A值），計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率（%）=（1－實驗組A值/對照組A值）×100%。

1.6 細胞形態(tài)觀察 收集HCT-116、HCT-8細胞，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為2.0×105個/ml的細胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于6孔板中，培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)箱，待每孔細胞匯合度達到50%～60%時，吸棄孔中原培養(yǎng)基，并重新加入等體積不同濃度的 QFG（0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml）干預(yù)24 h，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，拍照記錄。

1.7 細胞周期檢測 收集HCT-116、HCT-8細胞，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為2.0×105個/ml的細胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于6孔板中，培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)箱，待每孔細胞匯合度達到50%～60%時，吸棄孔中原培養(yǎng)基，并重新加入等體積不同濃度的 QFG（0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml）干預(yù)24 h后，收集每孔細胞并用PBS清洗2次后，分別加入預(yù)冷的4℃75%酒精固定4 h，PBS清洗3遍后加入PI 500 μl，4℃避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.8 細胞凋亡檢測 收集HCT-116、HCT-8細胞，加入完全培養(yǎng)基，分別制備密度為2.0×105個/ml的細胞懸液，并按2 ml/孔的原則接種于6孔板中，培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)箱，待每孔細胞匯合度達到50%～60%時，吸棄孔中原培養(yǎng)基，并重新加入等體積不同濃度的 QFG（0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml）干預(yù)24 h后，收集每孔細胞并用PBS清洗2次后，分別加入Annexin V/FITC和PI各5 μl，避光染色15 min后，流式細胞儀檢測細胞各時期凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)均用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理。計量資料以（）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料用比率表示，采用卡方檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 QFG對 HCT-116、HCT-8細胞增殖的影響MTT檢測結(jié)果顯示不同濃度的QFG可顯著抑制大腸癌細胞HCT-116和HCT-8的增殖，具有明顯的劑量依賴和時間依賴作用，與對照組（0 mg/ml）比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 QFG對HCT-116、HCT-8細胞抑制率比較（）

表1 QFG對HCT-116、HCT-8細胞抑制率比較（）

注：與對照組比較，△P＜0.05。

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2.2 QFG對 HCT-116、HCT-8細胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示大腸癌細胞HCT-116和HCT-8經(jīng)不同濃度的QFG干預(yù)24 h后，隨著藥物濃度的增加，HCT-116和HCT-8細胞密度逐漸減小，懸浮細胞增多，部分細胞皺縮變圓。該結(jié)果進一步證實QFG對HCT-116和HCT-8細胞生長具有顯著的抑制作用，并呈明顯的劑量效應(yīng)。見圖1。

圖1 QFG干預(yù)HCT-116、HCT-8細胞24 h形態(tài)圖（200×）

2.3 QFG對 HCT-116、HCT-8細胞周期的影響細胞周期分析結(jié)果顯示，與對照組比較，實驗組QFG對大腸癌細胞HCT-116和HCT-8的S期有明顯的抑制作用，G0/G1期細胞比例顯著增多（P＜0.05），說明QFG能阻止大腸癌細胞由G0/G1期向S期的進程，該作用具有明顯的劑量依賴性。該結(jié)果表明QFG可通過調(diào)控大腸癌細胞HCT-116和HCT-8的細胞周期進程而發(fā)揮其抑制大腸癌細胞增殖的作用。見表2。

表2 QFG對HCT-116、HCT-8細胞周期的影響（）

表2 QFG對HCT-116、HCT-8細胞周期的影響（）

注：與對照組比較，△P＜0.05。

組別 n 濃度（mg/ml）HCT-8細胞G0/G1期（%） S期（%）對照組實驗組HCT-116細胞G0/G1期（%） S期（%）3 3 0 0.5 1 2 43.76±3.45 53.36±4.46△73.59±5.13△75.14±4.77△41.71±4.15 33.32±2.93△14.13±3.48△13.16±2.43△34.75±4.14 45.31±2.15△55.15±4.98△65.97±2.42△43.13±2.77 26.93±3.87△26.48±2.07△25.79±1.97△

2.4 QFG對 HCT-116、HCT-8細胞凋亡的影響Annexin V/PI染色結(jié)果顯示，與對照組比較，QFG各劑量組的早期凋亡比例均有明顯增加（P＜0.05），且QFG各劑量組的晚期凋亡比例及總凋亡比例均高于對照組（P＜0.05），凋亡比例隨著QFG濃度增加而逐漸增多，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴作用。該結(jié)果表明QFG具有誘導(dǎo)大腸癌細胞HCT-116和HCT-8凋亡的作用。見表3。

表3 QFC對HCT-116、HCT-8細胞凋亡的影響（）

表3 QFC對HCT-116、HCT-8細胞凋亡的影響（）

HCT-8凋亡率早期（%） 晚期（%） 總凋亡（%）對照組實驗組組別 n 濃度（mg/ml） HCT-116凋亡率早期（%） 晚期（%） 總凋亡（%）3 3 0 0.5 1 2 0.55±0.34 2.42±0.55△1.45±3.11△9.68±2.43△3.52±0.23 9.45±0.37△11.32±0.91△21.45±0.89△4.07±0.45 11.87±0.78△12.77±4.32△31.13±3.03△0.52±1.39 3.71±2.01△10.16±3.63△15.54±2.12△1.71±2.21 5.63±1.17△7.03±2.41△18.39±2.99△2.23±3.25 9.34±3.33△17.19±4.99△33.93±3.01△

3 討論

大腸癌歸屬于中醫(yī)學(xué)“積聚、腸蕈、臟毒”等病范疇。脾虛氣弱是大腸癌的發(fā)病基礎(chǔ)，而瘀毒留滯是引發(fā)本病的重要因素，是腫瘤形成、生長、轉(zhuǎn)移的直接病理基礎(chǔ)[4]。故該病是因虛致積、因積而逾虛的病證。濕熱、火毒、瘀滯是病之標(biāo)，脾虛、腎虧、正氣不足是病之本[5]。因而正虛邪實、脾虛、濕毒、瘀滯是病理關(guān)鍵所在。所以，大腸癌的中醫(yī)治則主要為益氣固本、清熱解毒、補肝益腎。由白花蛇舌草、半枝蓮、炙黃芪、炒麥芽等組成的QFG是經(jīng)復(fù)方白花蛇舌草劑型改制而成，其中白花蛇舌草、半枝蓮歸大腸經(jīng)，具有清熱解毒、消腫化瘀等功效，臨床上常用于治療大腸癌等各種惡性腫瘤且療效確切[6～7]；黃芪歸肺、脾經(jīng)，兼有益氣健脾、托毒生肌等功效，現(xiàn)代研究表明它有顯著的抗腫瘤作用[8]；炒麥芽具有行氣消食、健脾開胃等功效，臨床用于輔助腫瘤術(shù)后化療療效確切[9]。諸藥合用具有清熱解毒、益氣健脾、消食和胃等功效，主要用于濕熱壅盛、脾胃虛弱型大腸癌等消化道腫瘤的治療，臨床療效顯著，但其抗腫瘤的作用機制仍不清楚。為研究QFG的抗腫瘤作用機制，本實驗采用體外培養(yǎng)兩株不同的大腸癌細胞HCT-116和HCT-8，同時探討QFG對大腸癌細胞生長的抑制作用。

腫瘤是由內(nèi)外因素共同作用下，以局部形成瘤塊為特征的系統(tǒng)性疾病，腫瘤細胞的無限增殖和凋亡抵抗，即增殖/凋亡失衡不受控制是其重要特征[10～11]。因此，抑制大腸癌細胞增殖和促進大腸癌細胞凋亡仍是防治大腸癌的主要方式和途徑。本研究MTT結(jié)果顯示，QFG對大腸癌細胞HCT-116和HCT-8的增殖均有顯著的抑制作用；通過細胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)大腸癌細胞經(jīng)QFG干預(yù)后細胞密度明顯減小，并出現(xiàn)細胞變圓、體積縮小和脫落現(xiàn)象，進一步證實了QFG具有顯著抑制大腸癌細胞增殖的作用。此外，采用Annexin V/PI染色，流式細胞檢測分析結(jié)果表明QFG對大腸癌HCT-116和HCT-8細胞均有顯著誘導(dǎo)凋亡的作用。

細胞周期調(diào)節(jié)失控是導(dǎo)致腫瘤細胞過度增殖的重要生物學(xué)特點。細胞生長周期分為G0期、G1期、S期、G2期和M期，其中最重要的是由G1期進入S期這一過程且受G1期限制點（Restrictionpoint）調(diào)控[12]。腫瘤細胞過度增殖與G1期限制點異常調(diào)控關(guān)系密切，通過調(diào)控G1期限制點阻止細胞由G1期進入S期是發(fā)揮藥物抑制腫瘤增殖的重要作用靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，QFG可阻止大腸癌HCT-116和HCT-8細胞由G1期進入S期，初步揭示QFG抑制大腸癌細胞增殖的作用機制。

綜上所述，QFG通過阻止細胞周期進程和誘導(dǎo)細胞凋亡是其抗大腸癌的重要作用機制。但細胞增殖周期和細胞凋亡的調(diào)控是由各種細胞表面受體、細胞內(nèi)信號分子、周期調(diào)控蛋白和細胞凋亡調(diào)控蛋白協(xié)同作用共同完成的，QFG精確的抗腫瘤作用機制仍需進一步深入研究。

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