閆肅,李慧敏,張曉冬,王新南,何嵐,楊麗紅,王家林,林存智,劉全蘭*

1 (青島科技大學(xué) 海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島, 266042) 2 (山東省農(nóng)作物種質(zhì)資源中心,山東 濟(jì)南, 25000) 3 (青島大學(xué) 附屬醫(yī)院呼吸科，山東 青島, 266003)

乳酸細(xì)菌(lactic acid bacteria, LAB)代表著一類可通過同型或異型發(fā)酵把碳水化合物發(fā)酵分解為以乳酸為主要產(chǎn)物的細(xì)菌群，是一類不產(chǎn)孢子、接觸酶陰性、缺乏細(xì)胞色素、耐氧和耐酸的革蘭氏陽性桿菌或球菌，它們通常生活在無氧但營養(yǎng)豐富的環(huán)境中[1-2]。LAB在食品和飼草的發(fā)酵中有安全使用的悠久歷史，它們通過發(fā)酵酸化和酶學(xué)過程保障了發(fā)酵品的關(guān)鍵味道和質(zhì)地并保鮮其品質(zhì)，是公認(rèn)的安全添加劑和合格的安全推定劑。乳酸乳球菌(Lactococcuslactissubsp.lactis)、乳酸乳球菌雙乙酰變種(L.lactissubsp.lactisvar.diacetylactis)等LAB菌株已用于制備硬奶酪、黃油、奶油、酸奶、開菲爾等奶制品[2-3]，米酒乳桿菌(Lactobacillussakei)和彎曲乳桿菌(Lb.curvatus)等已用于發(fā)酵腸的制備[4-5]，酒明串珠菌(Oenococcusoeni)用于酒的發(fā)酵[6]，植物乳桿菌(Lb.plantarum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)等用于制備酸菜、腌菜、發(fā)酵橄欖等蔬菜制品[2,7]，舊金山乳桿菌(Lb.sanfransiscensis)、香腸乳桿菌(Lb.farciminis)等用于發(fā)酵面團(tuán)[2,8]，植物乳桿菌(Lb.plantarum)、乳酸乳球菌(L.lactissubsp.lactis)等已用于苜蓿、農(nóng)作物藤蔓等青貯飼草的制備[2,9]。有些LAB菌株，如乳桿菌(Lactobacilli)的菌株，在人體和動物的胃腸道占有重要生態(tài)位，它們對維護(hù)胃腸道內(nèi)正常微生物群發(fā)揮著積極作用，可競爭性地排除病原微生物，還提高胃腸道粘膜免疫性能[1-2,10]。不僅如此，LAB表現(xiàn)出的酸耐受力、胃腸道存活能力和安全使用記錄等特征已預(yù)示著LAB將是非常有前景的口服藥載體[1-2,10]。這些研究結(jié)果表明LAB在食品、農(nóng)業(yè)、生物加工過程、醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。

盡管LAB已長期應(yīng)用于各種食品和飼草的制備，但它們也被鑒定為是許多發(fā)酵品的主要變質(zhì)劑。有些LAB菌株可使豬肉產(chǎn)生黏滑液和腐爛味道[11]，有些菌株可使發(fā)酵品變成含生物胺的致敏性產(chǎn)品[12]，有些菌株可使發(fā)酵品具有抗生素特性[13-14]。王然然等[12]對來自黃酒的乳酸菌進(jìn)行生物胺的安全性評價，結(jié)果表明在82株乳酸菌中有11株產(chǎn)組胺；楊埔等[14]對來自奶制品和乳酸菌藥片的乳酸菌進(jìn)行抗生素和生物胺的評價，結(jié)果表明36株LAB中有14株菌對抗生素為多抗，有3株菌產(chǎn)組胺；王雪芹等[15]對2株糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)KLDS6.0610和KLDS6.0611進(jìn)行安全性評價，結(jié)果表明這2株菌具有高安全性，它們表現(xiàn)出對常見抗生素敏感、不產(chǎn)生物胺和不溶血等特征。可見，LAB的安全性在不同菌株間存有差異，其評價要先于實(shí)際應(yīng)用前。本研究對一批篩選自不同食物L(fēng)AB菌株的生物胺、溶明膠、溶血、L-乳酸光學(xué)純度等代謝產(chǎn)物進(jìn)行安全評價，并對菌株的抗生素敏感性、抑菌能力和葡萄糖利用率等進(jìn)行了評價，從而獲得食用安全而具有工業(yè)化前景的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實(shí)驗(yàn)菌株：LAB菌株為本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的48株LAB菌株(編號自QKL 1至QKL 48，表1)。

表1 48株乳酸菌形成有害代謝產(chǎn)物的評價Table 1 Assessment of harmful metabolites produced by 48 LAB strains

續(xù)表1

菌株名生物胺的形成酪胺精胺/亞精胺腐胺尸胺組胺溶蛋白性溶血性L-乳酸光學(xué)純度/%QKL 46++57QKL 47+++59QKL 48+++54

注：表中空位表示沒有相應(yīng)的檢測特征；“+”表示有相應(yīng)的檢測特征，如，生物胺形成中的“+”表示有相應(yīng)生物胺的形成；溶蛋白中的“+”表示明膠固化面被液化的高度為2 cm，“++” 表示明膠固化面被液化的高度為4 cm；溶血中的“+”表示羊血有被輕微溶解的透明圈，“++” 表示羊血有被溶解的透明圈。

1.1.2 培養(yǎng)基組成

LAB菌株的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基[12]，發(fā)酵培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行；明膠液化培養(yǎng)基用于測定菌株的溶蛋白性[17]，羊血培養(yǎng)基用于測定菌株的溶血性[17]，Bover-Cid & Holzapfel改進(jìn)的培養(yǎng)基用于測定菌株的生物胺[18]，PY培養(yǎng)基用于測定菌株對葡萄糖的理論利用率[16]。指示菌大腸桿菌的LB培養(yǎng)基和酵母的PDA培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行。培養(yǎng)基121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

葡萄糖、牛肉浸膏、明膠、酵母粉和蛋白胨購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，檸檬酸氫二銨、 MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、K2HPO4、CH3COONa·3H2O、MgSO4·7H2O、DL乳酸、Tween-80、CuSO4,天津市巴斯夫化工有限公司(均為分析純)；L-乳酸(99.9%),Sigma-Aldrich； 5-磷酸吡哆醛、氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、碘硝基四唑紫、D-乳酸脫氫酶(D-LDH)、心肌黃酶，生工生物工程(上海)股份有限公司；無菌脫纖維綿羊血，南京茂捷微生物科技有限公司；L-鳥氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸和L-酪氨酸，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；VB1、阿莫西林、頭孢拉定、羅紅霉素、鏈霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星，辰欣藥業(yè)股份有限公司。

1.2 菌株有害代謝產(chǎn)物的評價

取-20 ℃保存的菌株于MRS固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)16 h后，挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h(37 ℃)以獲得活化待用的菌液。

1.2.1 生物胺的評價

將活化的菌株繼續(xù)接種于MRS液體培養(yǎng)基，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的每一種前體氨基酸與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%的5-磷酸吡哆醛，誘導(dǎo)菌體的脫羧酶活性。如此活化6次后，將菌株按10%的量分別接種于含酪氨酸、組氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸的Bover-Cid & Holzapfel改進(jìn)的培養(yǎng)基[18]，并在表面加入1 mL的滅菌石蠟油密封，于37 ℃溫箱培養(yǎng)3～4 d，觀察顯色反應(yīng)。若有淡藍(lán)色或紫色的顏色特征則表示菌株形成相應(yīng)氨基酸的生物胺。

1.2.2 溶明膠的評價

將活化菌株接種于明膠培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)48 h后，取出置于4 ℃冰箱中以使明膠完全凝固；凝固后再取出并在室溫放置，觀察接菌管與無菌對照管的融化速度；明膠融化明顯加快的判定為溶明膠的陽性反應(yīng)。

1.2.3 溶血的評價

將活化的菌株劃線接種于含有體積分?jǐn)?shù)為5%脫纖維綿羊血的血瓊脂平板上，倒置培養(yǎng)48 h，觀察記錄菌落周圍是否有溶血的透明圈。如果菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化或有淡淡的環(huán)，則表示培養(yǎng)基中的紅細(xì)胞沒有被溶解，預(yù)示著乳酸菌具有相對安全性；若菌落周圍形成一個完全清晰透明的溶血環(huán)，則表示該菌株產(chǎn)生可使紅細(xì)胞完全溶解的溶血素，預(yù)示著該LAB菌株具有危險性而不能應(yīng)用[19]。

1.2.4 乳酸的旋光性

將活化的菌株按10%接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，取1 mL發(fā)酵液進(jìn)行離心，再加入等體積的 0.01 mol/L的H2SO4溶液進(jìn)行酸解。取0.5 mL酸化后的上清液并加入無菌雙蒸水進(jìn)行梯度稀釋，稀釋液中乳酸的旋光性分別采用酶法[20]和高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)手性柱子測定[21]。

1.3 LAB對抗生素的敏感性

采用平板藥敏紙片擴(kuò)散法對LAB敏感性表型進(jìn)行分析，分別檢測菌株對鏈霉素(streptomycin)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)、慶大霉素(gentamicin)、紅霉素(erythromycin)、阿莫西林(amoxicillin)和頭孢拉定(cefradine)的敏感性。據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道[3,15]，鏈霉素、環(huán)丙沙星和慶大霉素的質(zhì)量濃度梯度設(shè)為80、320和1 280的mg/L，紅霉素、阿莫西林和頭孢拉定的質(zhì)量濃度梯度設(shè)為0.625、20、80和320 mg/L。將藥敏紙片分別在不同濃度的抗生素水溶液中浸泡6 min，然后鋪在均勻涂布了乳酸菌菌株[濃度為(0.6～0.8)×109CFU/mL]的平板上。每種菌的平板鋪浸有3個不同濃度的同種抗生素紙片，同時鋪1個浸有無菌水的紙片作為對照。將培養(yǎng)皿放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌株培養(yǎng)時平板上是否出現(xiàn)透明的圈，記錄能抑制菌株生長的最低抗生素質(zhì)量濃度。

1.4 菌株工業(yè)化前景的評價

1.4.1 LAB的抑菌力

將活化的LAB菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)16 h，離心收集上清液并分成4份；第1份上清液不做任何處理，pH 3.8，主要成分為乳酸等酸性代謝物；第2份中只加入CaCO3以調(diào)節(jié)pH值為6.5，離心以獲得含有細(xì)菌素和H2O2的溶液；第3份是在第2份上清液中加入蛋白酶K于37 ℃溫浴4 h以降解細(xì)菌素或類細(xì)菌素等蛋白類物質(zhì)，則獲得以H2O2為主的溶液；第4份是在第2份上清液中加入H2O2酶于37 ℃溫浴4 h以降解過氧化氫，則獲得以細(xì)菌素為主的溶液。

以大腸桿菌和酵母菌為指示菌，采用雙層平板打孔法進(jìn)行上述4類成分的抑菌實(shí)驗(yàn)。大腸桿菌的培養(yǎng)基為LB，酵母菌的培養(yǎng)基為PDA。MRS固體培養(yǎng)基作為底層培養(yǎng)基，含6 mL指示菌培養(yǎng)液加到100 mL冷卻至45℃的LB或PDA半固體培養(yǎng)基中，制成雙層培養(yǎng)基。該雙層培養(yǎng)基孔中若加入第1份上清液，則底層培養(yǎng)基MRS中不加入CaCO3以防止乳酸等有機(jī)酸的中和；若加入第2、3或4份上清液，則底層培養(yǎng)基MRS中加入CaCO3以防止上清液中含有LAB菌株形成乳酸等有機(jī)酸而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。上述4類培養(yǎng)液各取150 μL，加入孔中；待培養(yǎng)液完全吸收后，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察抑菌情況，記錄抑菌圈。

1.4.2 LAB對葡萄糖的理論利用率

LAB對葡萄糖的利用率是按照LAB的發(fā)酵類型實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。用移液槍分別吸取過夜培養(yǎng)的菌液并加入到融化的含溴甲酚紫指示劑的PY培養(yǎng)基內(nèi)(溫度約50 ℃)[1, 22]，混勻后在其上加蓋1層約3 cm厚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂，置于37 ℃培養(yǎng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 有害代謝產(chǎn)物的評價

2.1.1 生物胺的檢測

LAB菌株在Bover-Cid & Holzapfel培養(yǎng)基中生長時，若菌株具有氨基酸脫羧酶，能分解氨基酸使其脫羧生成胺和CO2，使培養(yǎng)基變堿性，滴加指示劑(溴甲酚紫)，呈黃色為陰性，呈淡藍(lán)色或紫色為陽性[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,含酪氨酸、鳥氨酸和賴氨酸的測定管均呈黃色，這說明48株菌株形成腐胺、尸胺和酪胺的結(jié)果為陰性；在含組氨酸的測定管中，只有1株菌QKL39呈現(xiàn)紫色，其余47株菌形成組胺的測定結(jié)果為陰性；在含精氨酸的測定管中，6株菌(QKL41～44、46和48)呈現(xiàn)紫色，其余42株菌形成精胺或亞精胺的測定結(jié)果為陰性(表1)。

2.1.2 溶明膠的檢測

明膠液化實(shí)驗(yàn)常用于衛(wèi)生用品微生物污染檢測，而那些使明膠液化的菌株多有致病性。LAB菌株是不同屬細(xì)菌的統(tǒng)稱，具有廣泛的代謝多樣性，為防止可能的安全隱患，本論文對48株LAB菌株進(jìn)行明膠液化的評價。有7株菌可使明膠固體培養(yǎng)基表面發(fā)生液化，這7個菌株分別是分離自羊奶的QKL9、扇貝的QKL22、牡蠣的QKL29和34、發(fā)酵面團(tuán)的QKL44、47和48(表1)。這7株菌中QKL9和22對明膠表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解力，可溶化明膠固體培養(yǎng)基的高度為4 cm；QKL29、34、44、47和48等5株菌對明膠表現(xiàn)出相對較弱的降解力，可溶化明膠固體培養(yǎng)基的高度為2 cm。本實(shí)驗(yàn)中其他菌株沒有表現(xiàn)出溶解明膠的特征，這說明它們具不溶解明膠的安全性。

2.1.3 溶血的檢測

很多革蘭氏陽性菌和陰性菌都產(chǎn)生溶血素，溶血素可作用于細(xì)胞膜，造成其結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，使大量細(xì)胞內(nèi)的成分泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。早期發(fā)現(xiàn)的溶血素多以希臘字母命名，比如金黃色葡萄球菌按抗原性不同至少可分為α、β、γ、δ、ε五種溶血素。但細(xì)菌產(chǎn)生的α，β，γ等溶血素與血瓊脂平板出現(xiàn)的溶血現(xiàn)象并無關(guān)聯(lián)，只是根據(jù)溶血素不同的特性而劃分的[19]。比如：金黃色葡萄球菌α-溶血素血平板呈現(xiàn)明顯的β溶血現(xiàn)象。大腸桿菌β溶血素均在血平板上形成清晰的溶血環(huán)[23]。

本論文溶血實(shí)驗(yàn)中，完全不對羊血形成溶解圈的菌株有6株，分別是來自酸奶的QKL 6，羊奶的QKL 10，奶酪的QKL 15，扇貝的QKL 19，牡蠣的QKL 30和酸菜的QKL 40。輕微溶解羊血的菌株有30株，分別是來自酸奶的QKL 1、2、4、5和7，羊奶的QKL 8、9、11和12，奶酪的QKL 13、14、16和17，扇貝的QKL 20～22、24和26，牡蠣的QKL 28、31、32、34和35，酸菜的QKL 39，發(fā)酵面團(tuán)的QKL 41～44、46和48。完全溶解羊血的菌株有12株，分別是來自酸奶的QKL 3，扇貝的QKL 18、23、25和27，牡蠣的QKL 29和33，酸菜的QKL 36-38，發(fā)酵面團(tuán)的QKL 45和47(表1)。

2.1.4 乳酸旋光性的檢測

酶法檢測發(fā)酵液中L-乳酸含量具有專一性、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)[20]，本實(shí)驗(yàn)室的酶法鑒定中，發(fā)酵液中若含D-乳酸則顯示為紅色；若沒有D-乳酸則不顯示顏色。本實(shí)驗(yàn)中99.5%光學(xué)純度的L-乳酸為對照樣品，酶法測定結(jié)果顯示其為無色，而有些菌株的發(fā)酵液為紅色，這表明其形成了D-乳酸(表1)。在HPLC測定中，酸奶來源菌株QKL 2和7代謝形成L-乳酸的光學(xué)純度為91%(圖1)，酸奶來源的其他菌株形成L-乳酸的光學(xué)純度為67%～70%；其他來源菌株形成L-乳酸的光學(xué)純度≤60%。

圖1 發(fā)酵液中6 g乳酸的光學(xué)純度測定(HPLC法)Fig.1 Optical purity of lactic acid from 6g fermentation broth detected by HPLC

2.2 菌株對抗生素的敏感性

鏈霉素、環(huán)丙沙星和慶大霉素的測定實(shí)驗(yàn)中，對80 mg/L的3種抗生素均敏感的菌株有5株，它們是：酸奶來源的QKL 3，奶酪來源的QKL 17，扇貝來源的QKL 19，牡蠣來源的QKL 35和發(fā)酵面團(tuán)來源的QKL 48。僅對80 mg/L的環(huán)丙沙星和慶大霉素敏感的菌株有14株，它們是：酸奶來源的QKL 4、5和7，羊奶來源的QKL 12，奶酪來源的QKL 14和15，牡蠣來源的QKL 28、29、31～34，發(fā)酵面團(tuán)來源的QKL 42和47。僅對80 mg/L的慶大霉素敏感的菌株有4株，它們是：酸奶來源的QKL 6，羊奶來源的QKL 9，扇貝來源的QKL 21，酸菜來源的QKL 37。僅對80 mg/L的環(huán)丙沙星敏感的菌株有1株，它是羊奶來源的QKL 12。其余菌株對這3種抗生素表現(xiàn)為中抗或高抗。

阿莫西林、紅霉素和頭孢拉定的的測定中，對0.625 mg/L的阿莫西林敏感的菌株有6株：來自酸奶的QKL 7、來自羊奶的QKL 9、來自牡蠣的QKL 34和35、來自發(fā)酵面團(tuán)的QKL 41和42；對0.625 μg/mL的紅霉素敏感的菌株有3株：來自酸奶的QKL 3、來自牡蠣的QKL 30和33；對這3類抗生素均表現(xiàn)為中抗﹙20或80 mg/L﹚的菌株有21株：來自酸奶的QKL 2和4、來自羊奶的QKL 8和12、來自奶酪的QKL 15和17、來自扇貝的QKL 18-27、來自牡蠣的QKL 28和31、來自發(fā)酵面團(tuán)的QKL 43、46和48。其余菌株對這3種抗生素為高抗(表2)。

2.3 菌株工業(yè)化前景的評價

2.3.1 LAB的抑菌力

LAB菌株代謝形成的活性物質(zhì)可使其具有抑菌功能，這些抑菌物質(zhì)主要是乳酸為主的酸性物質(zhì)、細(xì)菌素為主的活性肽和H2O2等，它們有利于食品和飼料的貯藏。本研究進(jìn)一步檢測了乳酸菌的代謝產(chǎn)物(乳酸為主的酸性代謝物、H2O2和細(xì)菌素等的混合物、H2O2、細(xì)菌素等4類物質(zhì))對大腸桿菌和酵母菌的抑制效果，結(jié)果見表2。

表2 48株乳酸菌抗生素敏感性和工業(yè)化前景評價的評價Table 2 Assessment of antibiotic sensitivity and industrial prospect of 48 LAB strains

續(xù)表2

菌株名菌株對抗生素表現(xiàn)出敏感性的質(zhì)量濃度即被抗生素殺死的質(zhì)量濃度/(mg·L-1)抑菌物對大腸桿菌的抑菌圈直徑/cm抑菌物對酵母的抑菌圈直徑/cm鏈霉素環(huán)丙沙星慶大霉素阿莫西林紅霉素頭孢拉定H2O2+細(xì)菌素細(xì)菌素H2O2乳酸等H2O2+細(xì)菌素細(xì)菌素H2O2乳酸等CO2QKL 121 2808032020208034奶酪來源的乳酸菌QKL 13>1 2803203202080320533714-QKL 141 2808080202032029QKL 15320808020208032.52.5410QKL 16>1 280320128020320802.51.51.538QKL 17808080202080610扇貝來源的乳酸菌QKL 18>1 280>1280320202080815QKL 19808080202080132258QKL 20>1 280>128012802020801012QKL 211 2803208020208073316QKL 22>1 280>1 280320202080322763211QKL 23>1 2801 2803202020320322532213QKL 24>1 280>1 280128020203203292214QKL 25>1 280>1 280128020208033873315QKL 26>1 280>1 2803202020320713QKL 27>1 280>1 280320202080682513牡蠣來源的乳酸菌QKL 2832080802020203331473519QKL 323208080202032044413101018++QKL 333208080200.6258043313111019.5QKL 3432080800.6252080533134415++QKL 358080800.6252020137715++酸菜來源的乳酸菌QKL 36>1 280>1 28012802080>3203654QKL 371 2801 2808020203203654-QKL 38>1 280>1 2803208020320711QKL 39>1 280>1 280128020203201311++QKL 40>1 280>1 28012802020320331412發(fā)酵面團(tuán)來源的乳酸菌QKL 41>1 2801 2801 2800.625>8080976210QKL 421 28080800.6252080223338++QKL 43>1 280>1 280320202080062214QKL 44>1 2801 280320202032073315QKL 45>1 280>1 2803202080>32098QKL 46>1 280>1 2801 28020208054++QKL 4732080802020>320222414769QKL 4880808020202045

注：空位表示沒有相應(yīng)的檢測特征；“+”表示有相應(yīng)的檢測特征，如，產(chǎn)CO2產(chǎn)中的“+”表示CO2形成的氣柱高度為1.5 cm，“++” 表示氣柱高度為3 cm，以此類推；“-”表示沒有進(jìn)行相應(yīng)的檢測。

本實(shí)驗(yàn)檢測的48株LAB菌中有47株的乳酸等酸性代謝產(chǎn)物對酵母菌的抑菌力要遠(yuǎn)高于其細(xì)菌素和H2O2的抑菌力，僅菌株QKL 47的細(xì)菌素和H2O2的混合物對酵母菌的抑菌力要高于其乳酸等酸性代謝產(chǎn)物的抑菌力；有45株LAB的乳酸等酸性代謝產(chǎn)物對大腸桿菌的抑菌力要遠(yuǎn)高于其細(xì)菌素和H2O2的抑菌力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明同一抑菌物在不同菌株間可產(chǎn)生不同的抑菌力，如菌株QKL 7的乳酸等酸性代謝產(chǎn)物對大腸桿菌和酵母菌的抑菌力要高于QKL 2的乳酸等酸性代謝產(chǎn)物(表2)；另一方面，同一菌株的不同抑菌物在抑菌能力上有不同，菌株QKL 27的乳酸等酸性代謝產(chǎn)物對酵母菌的抑菌圈為13 cm，但其H2O2和細(xì)菌素的混合物對酵母菌的抑菌圈為8 cm。

由表2可知，LAB 菌株對大腸桿菌和酵母菌的抑菌物質(zhì)有多樣性的特征，這將為選擇合適的LAB菌株以滿足生產(chǎn)需求而提供機(jī)會。酸奶中的2 株乳酸菌(QKL 1和7)的兩大類代謝產(chǎn)物(乳酸為主酸性代謝物、H2O2和細(xì)菌素等的混合物)均對大腸桿菌和酵母菌有較明顯的抑菌效果，其他菌株主要以乳酸等為抑菌物質(zhì)，但菌株QKL 5的H2O2與細(xì)菌素的代謝產(chǎn)物對大腸桿菌有較明顯的抑菌效果。羊奶中僅1株乳酸菌QKL 11的兩大類代謝產(chǎn)物(乳酸為主酸性代謝物、H2O2和細(xì)菌素等的混合物)均對大腸桿菌和酵母菌有較明顯的抑菌效果，其他菌株主要以乳酸等為抑菌物質(zhì)。奶酪中乳酸菌的H2O2與細(xì)菌素的代謝產(chǎn)物對酵母菌沒有抑制效果，但3株乳酸菌(QKL 13、15和16)的兩大類代謝產(chǎn)物(乳酸為主酸性代謝物、H2O2和細(xì)菌素等的混合物)均對大腸桿菌有較明顯的抑菌效果。同樣，扇貝、牡蠣、酸菜和發(fā)酵面團(tuán)中的乳酸菌的兩大類代謝產(chǎn)物(乳酸為主酸性代謝物、H2O2和細(xì)菌素等的混合物)均對大腸桿菌和酵母菌表現(xiàn)出多樣性的抑菌效果。LAB菌株的乳酸為主酸性代謝物對大腸桿菌形成的抑菌圈≥5 cm的有QKL 1～8、10、11、13、17-30、32、33、34、35、38、39、40、41、43、44、45和46等37株，對酵母菌形成的抑菌圈≥5 cm的有QKL 2、4～11、13～30、32、33、34、35、38～45、47和48等41株，對大腸桿菌和酵母菌均形成的抑菌圈≥5 cm的有QKL 2、4～8、10、11、13、17～30、32、33、34、35、38、39、40、41、43、44、45和46等35株；LAB菌株的H2O2和細(xì)菌素等的代謝物對大腸桿菌形成的抑菌圈≥5 cm的有QKL 1、13、19、30和34等5株，對酵母菌形成的抑菌圈≥5 cm的有QKL 21、25、27、28、30、32、33、35、36、37、41和47等12株，對大腸桿菌和酵母菌均形成≥5 cm抑菌圈的有1株菌QKL 30。

2.3.2 LAB對葡萄糖的理論利用率

實(shí)驗(yàn)菌株所在培養(yǎng)基的軟瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡或?qū)?%瓊脂層向上頂?shù)默F(xiàn)象，表示產(chǎn)氣[1, 22]，表示葡萄糖理論利用率低于100%。菌柱在培養(yǎng)26 h后，開始觀察和記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)。在測定的菌株中，有10個菌株所在試管的瓊脂柱發(fā)生位移。菌株形成的氣體量有差異，形成6 cm高的瓊脂柱的菌株是來自羊奶的QKL 10；形成4.5 cm高的瓊脂柱的菌株是來自酸奶的QKL 7，羊奶的QKL 8和9；形成3 cm高的瓊脂柱的菌株是來自牡蠣的QKL 31、32、34和35，酸菜的QKL 39，發(fā)酵面團(tuán)的QKL 42和46。其余菌株繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，瓊脂柱沒有發(fā)生位移。

3 結(jié)論

食用溶血菌株將對生物體產(chǎn)生巨大的破壞作用，產(chǎn)生物胺的菌株若在食品和飼草中繼續(xù)產(chǎn)生生物胺將對有機(jī)體產(chǎn)生安全隱患，因此，不溶血、不溶明膠和不產(chǎn)生物胺的LAB菌株將為其安全使用而提供保障[3-5, 11-15]。本實(shí)驗(yàn)檢測的48株菌中，滿足不溶或輕微溶血、不溶明膠和不產(chǎn)生物胺等3個條件的菌株共35株。這35株菌中，僅分離自酸奶的QKL2和7代謝形成L-乳酸的光學(xué)純度高于90%。這2株菌對鏈霉素的敏感質(zhì)量濃度是1 280 mg/L，對環(huán)丙沙星、慶大霉素和頭孢拉定的敏感質(zhì)量濃度均是80 mg/L，對紅霉素的敏感質(zhì)量濃度是20 mg/L；但菌株QKL2對阿莫西林的敏感質(zhì)量濃度是20 mg/L，菌株QKL7對阿莫西林的敏感質(zhì)量濃度是0.625 mg/L。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，QKL7對大腸桿菌和酵母菌的抑制活性要高于QKL2；但菌株QKL7對葡萄糖的發(fā)酵將形成CO2，菌株QKL2對葡萄糖擁有100%利用率。因此，本實(shí)驗(yàn)的評價結(jié)果表明菌株QKL2和7具有較強(qiáng)的食用安全性，這2株菌株的后續(xù)馴化和其培養(yǎng)條件的優(yōu)化將為其工業(yè)化應(yīng)用提供更高的價值。

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