劉曉強(qiáng)，吳華明，謝惠，姚熙四川省資陽市安岳縣人民醫(yī)院骨科，四川資陽 642350

骨肉瘤是一種罕見的原發(fā)性骨腫瘤，在美國占不到1%[1]。然而，它是兒童和年輕人中最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，約占3.4%，占所有兒童癌癥和兒童骨惡性腫瘤的大部分[2]。手術(shù)切除腫瘤是治療的基該組成部分，化療已被證明可以改善骨肉瘤患者的生存[3]。然而，骨肉瘤患者的生存率一直保持在3年前的約60%，復(fù)發(fā)的患者中有85%發(fā)生早期肺部轉(zhuǎn)移[4]。既往文獻(xiàn)顯示，骨肉瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生與 KISS-1/G蛋白偶聯(lián)受體54（GPR54）表達(dá)異常相關(guān)[5]。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因 KISS-1作為腫瘤抑制基因在許多腫瘤中都有被證明，如肝癌[6]、乳腺癌[7]、結(jié)腸及直腸癌[8]。在骨肉瘤體外培養(yǎng)細(xì)胞中，Kiss-1基因表達(dá)對細(xì)胞增殖和侵襲能力呈負(fù)相關(guān)[9]，此外，Kiss-1基因轉(zhuǎn)染和過表達(dá)后，對人骨肉瘤細(xì)胞的增殖和入侵能力可能有所下降。該研究在設(shè)計(jì)時(shí)考慮到這些發(fā)現(xiàn)，該實(shí)驗(yàn)于2016年4月—2017年1月在該院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，應(yīng)用K7M2骨肉瘤細(xì)胞系進(jìn)行研究，分別向其加入KISS1基因表達(dá)物--Kp或抗Kp蛋白，并分別與普通K7M2細(xì)胞體系進(jìn)行比較，了解骨肉瘤細(xì)胞在KISS-1基因表達(dá)物的影響下的增殖、凋亡和自噬作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人骨肉瘤K7M2細(xì)胞，KISS1蛋白--Kp及抗Kp蛋白，流式細(xì)胞儀，cDNA合成試劑盒，RNA提取試劑盒，SYBR Premix EX Taq和定量PCR試劑盒，MTT試劑盒。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h和96 h后，用MTT染色法檢查每個(gè)培養(yǎng)瓶細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞檢測儀分析細(xì)胞凋亡情況。RT-PCR檢測培養(yǎng)72 h后的凋亡標(biāo)記物（P53、CytC）及自噬標(biāo)記物（P62、Beclin1）的 mRNA表達(dá)水平。

1.2.1 分組 對數(shù)生長期的骨肉瘤細(xì)胞K7M2在分別在加入 Kp（100 nmol/L）或者抗 Kp蛋白（100 nmol/L）的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并將其對應(yīng)地分為Kp組及Anti-Kp組，且以普通培養(yǎng)的K7M2細(xì)胞形成控制對照組。

1.2.2 細(xì)胞傳代及培養(yǎng) 加0.25%胰蛋白酶消化后，加入含10%FBS的DMEM懸液細(xì)胞，懸液1 000 rpm×5 min離心，棄上清加入常規(guī)培養(yǎng)液重懸，以1×105/mL接種于新的培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶置入37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以后隔日換液，并適時(shí)拍照記錄。

1.2.3 細(xì)胞增長率檢測 胰蛋白酶消化法收集細(xì)胞，96孔板每孔放置1×106/mL的懸浮細(xì)胞100 μL，細(xì)胞于37℃ 5%CO2分別孵育 24、48、72、96 h 后，分別加入 10 μL的MTT溶液5 mg/mL后繼續(xù)孵育4 h。離心，每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩8 min使結(jié)晶物充分溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490 nm測量各孔的吸光值，重復(fù)3次取平均值。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率檢測 細(xì)胞接種后，于37℃5%CO2分別孵育24、48、72、96 h后，分別收集各時(shí)段細(xì)胞并PBS洗滌一次。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS洗滌，用含0.1%Triton X-100的PBS重懸細(xì)胞，冰育2 min后，再次PBS洗滌1次，加入50 μL的TUNEL檢測液（TdT酶+熒光標(biāo)記液+TUNEL檢測液），37℃避光孵育60 min，PBS懸浮，在細(xì)胞流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.5 P53、CytC和P62、Beclin1的mRNA表達(dá)檢測細(xì)胞接種72 h后，RNA提取試劑盒提取RNA，cDNA第一鏈試劑盒合成cDNA第一鏈。由Takara生物合成各引物（PCR 引物：p53：正向 5'-tacatgtgttaacagttcctgca-3'；反向引物 5'-ttctgacaacgatcggagga-3'；溫度 55℃；CytC：正向引物 5'-GATTGACCAGGAAGCTGCAG-3'，反向引物5'-CCACCAAAATCTCCTGCGTT-3'；溫度55℃；P62正向引物 5'-GACTACGACTTGTGTAGCGTC-3'，反向引物 5'-AGTGTCCGTGTTTCACCTTCC-3'；Beclin1：正向引物5'-CGGGATCCATGGAAGGGTCTAAGACGTCC-3'，反向引物5'-CGGAATTCTCATTTGTTATAAAATTG TGAGG-3'；溫度 55℃）。 由 2.5 μL 5×緩沖+1.5 μL 氯化鎂+0.5+1 μdNTPμL L GAP-43 的正義和反義引物+0.3 μL Taq 酶+2 μcDNA 模板和水的反應(yīng) 25 μL，條件 95℃ 5 min，95℃ 30 s、62℃ 30 s、72℃ 30 s， 重復(fù)循環(huán)35次，最終以72℃10 min延伸。后行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對電泳條帶進(jìn)行密度掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 24統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析（ANOVA）方法進(jìn)行分析比較，采用LSD-t法進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72、96 h后增殖率的比較

在對照組和Anti-Kp組的細(xì)胞增殖率處于增長狀態(tài)，Anti-Kp組的細(xì)胞增殖率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,在控制組和 Kp組比較中，Kp組的細(xì)胞增殖率明顯低于對照組，且隨時(shí)間推移呈現(xiàn)下降趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

表 1 各組細(xì)胞的增殖率[（±s），%]

注：Kp 組與對照組比較，P＜0.05；Anti－Kp 組與對照組比較，P＜0.05。

組別24 h 48 h 72 h 96 h對照組Kp組Anti－Kp 組0.660±0.075 0.530±0.083 0.677±0.093 0.818±0.095 0.468±0.088 0.905±0.121 1.105±0.167 0.377±0.058 1.217±0.142 1.330±0.214 0.328±0.044 1.465±0.194

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 24、48、72、96 h凋亡率的比較

在Kp組的細(xì)胞凋亡率處于上升狀態(tài)，對照組和Anti-Kp組的細(xì)胞凋亡率變化不明顯。Kp組與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，見表 2。

表 2 各組細(xì)胞凋亡率[（±s），%]

表 2 各組細(xì)胞凋亡率[（±s），%]

注：Kp組與對照組比較，P<0.05。

組別24 h 48 h 72 h 96 h對照值Kp值A(chǔ)nti－Kp 值15.89±2.73 24.53±3.65 8.65±1.47 15.67±2.58 27.54±4.65 9.18±1.47 16.28±2.40 35.77±5.03 8.60±1.68 16.53±2.68 39.75±8.32 9.37±1.39

2.3 P53、Cytc、P62、Beclin1 的 mRNA 表達(dá)水平比較

細(xì)胞接種培養(yǎng)72 h后，Kp組的凋亡標(biāo)記物（P53、Cytc）和自噬標(biāo)記物（P62、Beclin1）的 mRNA 表達(dá)明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Anti-Kp組凋亡標(biāo)記物（P53、Cytc ）和自噬標(biāo)記物（P62、Beclin1）的mRNA表達(dá)明顯低于對照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 3。

表 3 P53、P62、Cytc、Beclin1 的 mRNA 表達(dá)水平（±s）

表 3 P53、P62、Cytc、Beclin1 的 mRNA 表達(dá)水平（±s）

注：Kp 組與控制組 P53、P62、Cytc、Beclin1 的 mRNA 表達(dá)的比較，P<0.05；Anti-Kp 組與控制組 P53、P62、Cytc、Beclin1 的 mRNA 表達(dá)的比較，P<0.05。

組別P53CytC P62 Beclin1 Kp值對照值A(chǔ)nti-Kp值0.393±0.107 0.213±0.045 0144±0.044 0.509±0.145 0.220±0.046 0.124±0.048 0.426±0.120 0.169±0.055 0.096±0.018 0.357±0.103 0.120±0.043 0.077±0.019

2.4 方差分析 P53、P62、Cytc、Beclin1 的 mRNA 表達(dá)差異性比較

細(xì)胞接種培養(yǎng)72 h后行（ANOVA）方法進(jìn)行組間比較，在 Kp 組或者 Anti-Kp 組內(nèi) P53、P62、Cytc、Beclin1各自的mRNA表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表4），說明Kp或Anti-Kp對它們的促進(jìn)或者抑制各基因表達(dá)的作用強(qiáng)度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有明顯差異性。

表4 方差分析P53、P62、Cytc、Beclin1的mRNA表達(dá)差異性比較

3 討論

KISS-1基因主要表達(dá)在胎盤組織中，但也可以表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、睪丸、卵巢、胰腺和小腸[10]，近年研究發(fā)現(xiàn)，KISS-1基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用[11]。Kp是GPR54的內(nèi)源性配體，是KISS-1翻譯產(chǎn)物。Kp和GPR54之間的相互作用可以激活受體，通過信號傳導(dǎo)通路在細(xì)胞內(nèi)引起一系列的影響，包括激活磷脂酶，鈣內(nèi)流和膠原酶活性的調(diào)節(jié)，激活PI釋放花生四烯酸，活化的MAPK網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1和2（ERK1和ERK2）[12]。然而，同樣的相互作用，也可以抑制趨化活性[13]?？筀p蛋白具有拮抗Kp的作用，達(dá)到抑制Kp功能的能力。

該研究結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)96 h后，對照組細(xì)胞增殖率均數(shù)百分比由（0.660±0.075）%變?yōu)椋?.330±0.214）%，Anti-Kp組細(xì)胞增殖率均數(shù)百分比由（0.677±0.093）%變?yōu)椋?.465±0.194）%，而 Kp 組細(xì)胞增殖率均數(shù)百分比由（0.530±0.083）%變?yōu)椋?.328±0.044）%，對照組和Anti-Kp組細(xì)胞增殖率隨時(shí)間延長而增加，而Kp組細(xì)胞增殖率呈下降趨勢。此外，Anti-Kp組細(xì)胞增殖率高于對照組，而Kp組細(xì)胞增殖率最低?；诖耍坪鮇ISS-1表達(dá)物具有抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的作用，可以作為抑癌基因發(fā)揮抑癌作用。KISS-1基因表達(dá)物也顯示在骨肉瘤細(xì)胞凋亡中具有重要作用，對照組隨時(shí)間變化凋亡率無明顯差異，而在Kp組細(xì)胞凋亡率均數(shù)百分比由(24.53±3.65)%變?yōu)?39.75±8.32)%，細(xì)胞凋亡率最高，而在Anti-Kp組凋亡率均數(shù)百分比由(8.65±1.47)%變?yōu)?9.37±1.39)%，變化率最低，故此可以認(rèn)為，Kp蛋白可能具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，也可認(rèn)為KISS-1基因表達(dá)物在骨肉瘤細(xì)胞的凋亡中起著一定的作用，且有利于骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。同理，也就意味著在機(jī)體中，KISS-1基因可能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡作用，進(jìn)而起到減緩骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的能力。

凋亡基因P53和CytC在真核細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞凋亡中起重要的作用，具有決定細(xì)胞凋亡的作用。在該次的研究與對照組相比顯示，細(xì)胞接種培養(yǎng)72 h后，對照組的 P53和 CytC的 mRNA表達(dá)水平均數(shù)為 （0.213±0.045）和（0.220±0.046），Kp 組 P53 和 CytC 的 mRNA 表達(dá)量均數(shù)為（0.393±0.107）和（0.509±0.145），可見對照組P53、CytC基因的相對表達(dá)水平基本保持不變，而Kp組的P53、CytC基因的mRNA表達(dá)水平升高，Anti-Kp組的P53、CytC基因的mRNA表達(dá)水平減低，另外，對照組和Anti-Kp組細(xì)胞凋亡率較低，故此，可以認(rèn)為Kp蛋白具有促進(jìn)凋亡基因P53、CytC表達(dá)的能力，進(jìn)而認(rèn)為KISS-1基因在機(jī)體中的表達(dá)具有促進(jìn)凋亡基因（P53、CytC）表達(dá)，以此來達(dá)到抑制骨肉瘤的發(fā)展。

自噬不同于凋亡，具有典型的自噬體在細(xì)胞內(nèi)形成，Beclin1作為細(xì)胞的自噬基因在細(xì)胞自噬方面發(fā)揮重要的作用[14]。PI3K復(fù)合物III激活自噬體的形成，引導(dǎo)相關(guān)蛋白Beclin1發(fā)生自噬反應(yīng)[15]。P62與Beclin1密切相關(guān)，且同時(shí)作為細(xì)胞自噬標(biāo)記基因[16]。細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，P62和Beclin1在控制組的mRNA表達(dá)量均數(shù)為（0.169±0.055）和（0.120±0.043），而在 Kp 組 P62 和Beclin1mRNA 表達(dá)量均數(shù)為（0.426±0.120）和（0.357±0.103）。相對表達(dá)水平的P62和Beclin1基因在控制組無明顯變化，但在Kp組P62和Beclin1 mRNA表達(dá)水平明顯升高，提示Kp蛋白可能具有促進(jìn)自噬基因（P62、Beclin1）表達(dá)的能力，在培養(yǎng)中具有促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的自噬反應(yīng)。

綜上所述，可以看出KISS-1基因表達(dá)物具有抑制骨肉瘤增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)還能促進(jìn)凋亡基因（P53 和 CytC）和自噬基因（P62、Beclin1）的表達(dá)作用，通過加快凋亡和自噬過程抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。在該研究中發(fā)現(xiàn)，抗Kp蛋白具有拮抗KISS-1基因的表達(dá)蛋白Kp的功能表現(xiàn)，也進(jìn)一步證明KISS-1基因的抑癌作用，其有望成為一個(gè)新的骨肉瘤藥物治療的靶點(diǎn)。

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