韓靜文姜啟興許艷順于沛沛夏文水

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3. 江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

魚糜制品是以新鮮魚肉或者冷凍魚糜為原料，加入食鹽和其他配料，經(jīng)過斬拌、擂潰、加熱成型等工藝流程制成的一種凝膠態(tài)食品[1]。它是中國重要的水產(chǎn)加工產(chǎn)品之一，因其高蛋白質(zhì)、低脂肪，開袋即食，在全世界范圍內(nèi)深受消費(fèi)者歡迎[2]。傳統(tǒng)的魚糜制品主要以海洋魚類為原料，但近年來，淡水魚產(chǎn)量迅速增長，且價(jià)格相對(duì)低廉，在水產(chǎn)加工行業(yè)具有良好的發(fā)展前景。目前，市場(chǎng)上銷售的魚糜制品以冷藏或凍藏的方式為主，存在貨架期短、運(yùn)輸和貯藏成本高等問題。魚糜制品經(jīng)過高溫滅菌(121.1 ℃)處理后可達(dá)到商業(yè)無菌，實(shí)現(xiàn)常溫流通和銷售[3]。但是高強(qiáng)度的熱處理(≥100 ℃)會(huì)導(dǎo)致魚糜制品蛋白質(zhì)的三、四級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，蛋白質(zhì)因共價(jià)結(jié)合而發(fā)生聚集現(xiàn)象，網(wǎng)狀骨架結(jié)構(gòu)變得脆弱，孔隙變大，從而使凝膠強(qiáng)度、硬度等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)顯著下降[4]。尤其是對(duì)淡水魚糜而言，產(chǎn)品凝膠性能本身就比海水魚糜的差，因此，如何提高高溫殺菌的淡水魚糜制品的凝膠性能成為了近年來的研究熱點(diǎn)。

可得然膠是一種新型的具有獨(dú)特性質(zhì)的微生物胞外多糖，由葡萄糖單體通過線性β-(1,3)糖苷鍵鏈接而成，具有高穩(wěn)定性和水不溶性的特點(diǎn)?？傻萌荒z能夠根據(jù)不同的熱處理?xiàng)l件形成質(zhì)地不同、物理性穩(wěn)定和持水性的凝膠[5]。在55～80 ℃加熱處理時(shí)，可得然膠的中性水溶液可形成熱可逆凝膠；當(dāng)加熱溫度高于80 ℃時(shí)，可形成高強(qiáng)度熱不可逆凝膠，因此在食品加工行業(yè)具有廣泛和不可替代的應(yīng)用價(jià)值[6-7]。劉文娟等[8]發(fā)現(xiàn)一定量的可得然膠能夠顯著改善帶魚肌肉蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性，使得微觀結(jié)構(gòu)變得更加致密均勻。李丹辰等[9]發(fā)現(xiàn)在冷凍魚漿中添加0.6%可得然膠可以顯著提高魚丸品質(zhì)，提高魚丸的亮度、持水性能和凝膠特性。馬瑤蘭等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在3種不同加熱模式下，可得然膠的添加可以改善經(jīng)過高溫處理的白鰱魚糜的質(zhì)構(gòu)特性，其影響主要與凝膠骨架結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變以及親水膠體-魚糜蛋白弱鍵相互作用有關(guān)。

但是，目前關(guān)于可得然膠在高溫殺菌魚糜中的應(yīng)用研究主要是圍繞改善魚糜質(zhì)構(gòu)特性展開的[8-10]，而關(guān)于其改善的作用機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究擬以冷凍白鰱魚糜為原料，在研究可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜制品凝膠特性影響的同時(shí)，通過對(duì)魚糜凝膠儲(chǔ)能模量G′分析，并結(jié)合SDS-PAGE電泳及TCA溶解肽分析，對(duì)其改善魚糜凝膠品質(zhì)的機(jī)理進(jìn)行深入探討，以便更好地設(shè)計(jì)配方方案，為提高高溫殺菌魚糜凝膠制品的品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

冷凍白鰱魚糜：AAA級(jí)，水分含量(77.0±0.5)%，pH 6.8～7.4，白度50～53，凝膠強(qiáng)度400～550 g·cm，湖北省洪湖市井力水產(chǎn)食品有限公司，-18 ℃凍藏備用；

食鹽：無錫市歐尚超市；

可得然膠：江蘇一鳴生物股份有限公司；

其它試劑：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

料理機(jī)：JYL-D020型，九陽股份有限公司；

真空料理機(jī)：MSM-898型，中山美仕美電器有限公司；

恒溫水浴鍋：DK-8AXX型，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

雙罐式全自動(dòng)殺菌鍋：700*800型，溫州市龍強(qiáng)輕工機(jī)械有限公司；

物性分析儀：TA.XT2i型，英國Stab. Micro Systems公司；

高精度分光測(cè)色儀：UltraScan Pro1166型，美國Hunterlab公司；

流變儀：DHR-3型，美國TA公司。

1.2 方法

1.2.1 魚糜凝膠的制備 將冷凍魚糜在4 ℃條件下解凍24 h，切成小塊(2 cm×2 cm×2 cm)，置于料理機(jī)中斬拌4 min。加入添加量為總質(zhì)量2.5%的食鹽，斬拌5 min。添加可得然膠(0，2，4，6，8，10 g/kg)，繼續(xù)斬拌5 min。在斬拌過程中不斷加入冰水，使得最終水分含量控制在(78.0±0.5)%。斬拌好的魚糜復(fù)合溶膠放入真空攪拌機(jī)中邊攪拌邊真空脫氣，真空度≥0.08 MPa，脫氣時(shí)間2 min。

(1) 取部分魚糜復(fù)合溶膠在4 ℃下冷藏，用來測(cè)定動(dòng)態(tài)流變性質(zhì)。

(2) 另一部分脫氣后的魚糜灌入直徑為25 mm的塑料腸衣中，打卡封口。先采用兩段式加熱法將其凝膠化，40 ℃水浴加熱30 min后90 ℃水浴加熱30 min，最后120 ℃下高壓殺菌10 min。高溫殺菌完成后，迅速用冰水冷卻，放于4 ℃ 備用待測(cè)。

1.2.2 動(dòng)態(tài)流變性質(zhì)的測(cè)定 采用DHR-3型應(yīng)力控制流變儀進(jìn)行測(cè)定[11]。將制備好的添加物-魚糜復(fù)合溶膠置于流變儀的平臺(tái)上，使用直徑40 mm的平行板壓制，狹縫設(shè)為1 mm，用二甲基硅油進(jìn)行密封，以防止水分揮發(fā)。在線性黏彈區(qū)的范圍內(nèi)，進(jìn)行動(dòng)態(tài)溫度掃描。升溫速率5.0 ℃/min，升溫掃描范圍5～120 ℃，應(yīng)變1%，頻率1 Hz，測(cè)定儲(chǔ)能模量G′的變化曲線。

1.2.3 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定 采用TA.XT Plus型物性分析儀進(jìn)行測(cè)定，將制備好的魚糜凝膠樣品切成2.0 cm長的圓柱體，在室溫(25 ℃)下平衡2 h，每組樣品重復(fù)6次。采用直徑為5.0 mm的P/5s球形探頭穿刺樣品，并記錄破斷強(qiáng)度(g)和破斷力(mm)，兩者乘積表示為凝膠強(qiáng)度(g·cm)。測(cè)試參數(shù)：測(cè)前、測(cè)中和測(cè)后速度均為1 mm/s，壓縮比50%，觸發(fā)力5.0 g。

1.2.4 TPA的測(cè)定 采用TA.XT Plus型物性分析儀進(jìn)行測(cè)定，將制備好的魚糜凝膠樣品切成2.0 cm長的圓柱體，在室溫(25 ℃)下平衡2 h，每組樣品重復(fù)6次。TPA模式下，選取P/36R圓柱形探頭，測(cè)前、測(cè)中和測(cè)后速度均為1 mm/s，壓縮比50%。

1.2.5 白度的測(cè)定 采用UltraScan Pro1166型高精度分光測(cè)色儀進(jìn)行測(cè)定，將制備好的魚糜凝膠樣品切成5 mm厚的圓柱體，裝入自封袋中，測(cè)定樣品的L*、a*、b*值。按式(1)計(jì)算白度值(W)。

(1)

式中：

W——白度值；

L*——亮度；

a*——紅度(+a*表示樣品偏紅，-a*表示樣品偏綠)；

b*——黃度(+b*表示樣品偏黃，-b*表示樣品偏藍(lán))。

1.2.6 持水性的測(cè)定 取10 g左右制備好的魚糜樣品至50 mL 離心管中，準(zhǔn)確稱重為W1，將離心管置于冷凍離心機(jī)中10 000×g離心10 min。取出后將離心管倒置棄去水溶液，用濾紙將殘余水分吸干，準(zhǔn)確稱重，記為W2。離心管重為W0。按式(2)計(jì)算持水性。

WHC=(W2-W0)/(W1-W0)×100%，

(2)

式中：

WHC——持水性，%；

W0——離心管質(zhì)量，g；

W1——離心管和魚糜樣品質(zhì)量，g；

W2——離心后的離心管和魚糜樣品質(zhì)量，g。

1.2.7 TCA-可溶性肽含量的測(cè)定 取2 g左右制備好的魚糜樣品至18 mL提前預(yù)冷的5% TCA溶液中，均質(zhì)，置于冷凍離心機(jī)中10 000×g離心15 min。根據(jù)lowry法[12]測(cè)定上清液中的TCA可溶性肽含量，結(jié)果用μmol酪氨酸/g樣品表示。

1.2.8 SDS-PAGE凝膠電泳 根據(jù)文獻(xiàn)[13]。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 11.0(SPSS Inc., Chicago, IL)，多組數(shù)據(jù)差異性分析采用單因素ANOVA兩兩比較的Duncan模型，顯著水平為P<0.05。采用Imagelab對(duì)電泳圖譜中主要條帶灰度進(jìn)行相對(duì)定量分析。圖表均采用OriginPro 8.6繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 可得然膠對(duì)魚糜復(fù)合凝膠流變特性的影響

儲(chǔ)能模量G′能反映黏彈性物質(zhì)的彈性，用來研究對(duì)魚糜凝膠流變特性方面的影響。可得然膠對(duì)魚糜復(fù)合凝膠升溫過程中儲(chǔ)能模量的影響見圖1。

由圖1可知，隨著溫度的升高，可得然膠-魚糜復(fù)合凝膠的G′經(jīng)歷3個(gè)變化階段，總體呈現(xiàn)先緩慢上升后快速下降再逐步上升的趨勢(shì)，這主要與肌原纖維蛋白的不同組分具有不同的變性溫度有關(guān)。在15～25 ℃時(shí)，產(chǎn)生的第一個(gè)峰值是因?yàn)榧∏虻鞍字劓溩冃跃奂苣z體系形成了一個(gè)相對(duì)較弱的凝膠網(wǎng)絡(luò)[14]。隨后由于肌球蛋白輕鏈亞基發(fā)生解離，引起分子黏性增強(qiáng)[15]，導(dǎo)致G′迅速下降，在55～60 ℃時(shí)出現(xiàn)最小值，且可得然膠的添加量越多，峰值出現(xiàn)的越晚，表明蛋白變性溫度越高。當(dāng)溫度超過60 ℃后，G′再次增加，這主要因?yàn)榧∏虻鞍字劓満图?dòng)球蛋白發(fā)生變性交聯(lián)，形成了致密、熱不可逆的凝膠網(wǎng)絡(luò)[16-17]。當(dāng)溫度達(dá)到110 ℃后，空白組因未添加可得然膠，高溫加熱下肌球蛋白聚集，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞[18]，G′迅速減小。添加可得然膠后，形成了可得然膠-魚糜蛋白的交聯(lián)作用，因此G′繼續(xù)升高。綜合來看，可得然膠組的趨勢(shì)和空白組的類似，但G′值都高于空白組，且隨著可得然膠添加量的增加，G′值呈升高的趨勢(shì)，105 ℃后，6 g/kg 的添加量值高于8 g/kg的，表明可得然膠能夠有助于高溫殺菌魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成，提高蛋白熱穩(wěn)定性。

2.2 可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜質(zhì)構(gòu)特性的影響

不同添加量的可得然膠能夠影響魚糜的質(zhì)構(gòu)特性。破斷力、破斷距離、凝膠強(qiáng)度、凝聚性及咀嚼性的結(jié)果見表1。破斷力可反映魚糜凝膠的硬度，破斷距離可反映魚糜凝膠的彈性。凝膠強(qiáng)度是破斷力和破斷距離的乘積，可反映魚糜的凝膠特性。咀嚼性是結(jié)合硬度、凝聚力和彈性的綜合指標(biāo)。凝聚性可反映細(xì)胞間結(jié)合力的大小[19]。一般而言，魚糜制品凝膠強(qiáng)度越大，品質(zhì)越好。

圖1 可得然膠對(duì)魚糜復(fù)合凝膠在升溫過程中儲(chǔ)能模量(G′)的影響

Figure 1 Effects of curdlan on the storage modulus (G′) of surimi gels during increasing temperature

由表1可知，隨著可得然膠添加量從0 g/kg增加到6 g/kg 時(shí)，魚糜凝膠的破斷力和凝膠強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，并在添加量為6 g/kg時(shí)達(dá)到最大，分別比空白組提高了34.1%和32.7%。可得然膠分子間和分子內(nèi)能夠形成氫鍵和水合作用[20]，使得破斷力和凝膠強(qiáng)度增大，與Chen等[21]的研究結(jié)果一致，經(jīng)高壓處理的鴨肉凝膠，添加1%可得然膠可改善其凝膠結(jié)構(gòu)和硬度。破斷力和凝膠強(qiáng)度隨后呈現(xiàn)先緩慢降低后繼續(xù)增加的趨勢(shì)，在8 g/kg添加量時(shí)相對(duì)較小，但總體穩(wěn)定，變化不大。有研究[22]指出，可得然膠自身螺旋的分子結(jié)構(gòu)可以吸收100倍于自身質(zhì)量的水分，導(dǎo)致魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性的破壞。破斷距離和凝聚性沒有顯著變化(P>0.05)。咀嚼性變化趨勢(shì)和凝膠強(qiáng)度一致，但10 g/kg添加量的咀嚼性過大，與空白組相比存在顯著性差異(P<0.05)，凝膠質(zhì)構(gòu)過于緊實(shí)，咀嚼困難，導(dǎo)致感官上不易被接受。咀嚼性的數(shù)值越小，咀嚼時(shí)所需作用力越小，產(chǎn)品口感也就越好[23]。因此，添加6 g/kg的可得然膠可解決魚糜經(jīng)高溫殺菌后的質(zhì)構(gòu)軟爛問題，改善凝膠強(qiáng)度。

2.3 可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜色度的影響

色度是魚糜凝膠的重要指標(biāo)之一，影響消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品的喜愛程度[24]。可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜凝膠色度的影響見表2。

由表2可知，可得然膠加入魚糜后，亮度L*和白度W均小于空白組，且相互之間差異不顯著(P>0.05)。隨著添加量的增加亮度L*和白度W呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，可能是可得然膠含有黃色色素的原因。程珍珠等[25]在魚糜中加入膳食纖維，發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)論，表明添加物對(duì)魚糜白度的影響和添加物本身的顏色有關(guān)。同時(shí)，隨著可得然膠含量的增多，魚糜凝膠中越來越多的水與可得然膠結(jié)合，降低了水分的光散射，導(dǎo)致L*值下降。紅度a*值和黃度b*值呈現(xiàn)交替式降低和增加的趨勢(shì)，使可得然膠-魚糜復(fù)合凝膠的色度偏綠偏黃。

表1 可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜質(zhì)構(gòu)特性的影響?

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表2 可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜色度的影響?

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜持水性的影響

持水性可反映魚糜的保水能力，持水性越強(qiáng)，魚糜產(chǎn)品內(nèi)部水分越不容易向外滲出，產(chǎn)品質(zhì)量越好[26]。可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜凝膠持水性的影響見圖2。

由圖2可知，可得然膠能夠改善高溫殺菌魚糜凝膠的持水性能，添加可得然膠后，魚糜的持水性能顯著增加(P<0.05)。當(dāng)可得然膠的添加量為6 g/kg時(shí)，對(duì)持水性的增加效果最好，達(dá)到88.28%，比空白組提高了14.29%，凝膠的持水性改善最佳。蛋白凝膠持水性受到水合作用、氫鍵和疏水相互作用等因素影響，在加熱條件下，可得然膠與魚糜蛋白通過氫鍵和疏水相互作用相互交聯(lián)，形成穩(wěn)定致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能將自由水鎖在凝膠網(wǎng)絡(luò)中，提高魚糜凝膠的持水性能[21,27]。Wei等[28]研究了可得然膠對(duì)高溫殺菌阿拉斯加鱈魚魚糜凝膠的影響，發(fā)現(xiàn)添加可得然膠后，魚糜內(nèi)部的水分由游離水狀態(tài)逐漸向結(jié)合水狀態(tài)轉(zhuǎn)變，從而提高了魚糜的凝膠強(qiáng)度。

2.5 可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜可溶性肽的影響

TCA-可溶性肽含量可以表示凝膠過程中蛋白的降解情況[29]?？傻萌荒z對(duì)高溫殺菌魚糜可溶性肽含量的影響見圖3。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Figure 2 Effects of curdlan on the water-holding capacity of high-temperature sterilization surimi gels (n=3)

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

Figure 3 Effects of curdlan on the TCA-soluble peptide content of high-temperature sterilization surimi gels (n=3)

由圖3可知，隨著可得然膠添加量的增加，魚糜凝膠的TCA-可溶性肽含量顯著降低(P<0.05)，說明可得然膠可以有效緩解高溫殺菌魚糜的蛋白降解速度，改善高溫殺菌對(duì)魚糜蛋白的破壞情況。添加量為10 g/kg時(shí)，TCA-可溶性肽含量最小，為7.27 μmol酪氨酸/g樣品，比空白組的含量減少了9.8%。而馬瑤蘭等[10]報(bào)道隨著可得然膠添加量的增加，魚糜凝膠的TCA-可溶性肽含量增加，與本研究發(fā)現(xiàn)相反，可能是殺菌模式以及可得然膠的添加量不同導(dǎo)致的。

2.6 可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜蛋白組分的影響

SDS-PAGE凝膠電泳可以對(duì)蛋白質(zhì)組成進(jìn)行分析?？傻萌荒z對(duì)高溫殺菌魚糜凝膠蛋白組成變化的影響見圖4。同時(shí)，為了更直觀地比較可得然膠對(duì)蛋白組成的影響，采用Imagelab分析電泳圖譜中主要條帶的灰度變化(表3)。

蛋白中的肌原纖維蛋白是形成魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要貢獻(xiàn)成分，其中肌球蛋白重鏈(MHC, 200 kDa)和肌動(dòng)蛋白(Actin, 43 kDa)含量最多。有報(bào)道[4]，經(jīng)過高溫加熱處理的魚糜凝膠蛋白MHC條帶逐漸減少至消失，Actin條帶顯著下降。觀察電泳圖，魚糜凝膠樣品的MHC含量明顯降低，肌動(dòng)蛋白無明顯變化，37，75 kDa附近出現(xiàn)明顯條帶。在熱的作用下，蛋白質(zhì)同時(shí)發(fā)生聚集和降解作用，MHC之間相互交聯(lián)，形成了高分子聚集體，聚集在泳道上方。隨著可得然膠添加量的增多，魚糜凝膠中可得然膠和水分比重增大，魚糜蛋白比重相應(yīng)減小，條帶顏色逐漸變淡。由表3可知，隨著可得然膠的添加，魚糜凝膠肌球蛋白重鏈含量輕微增加，說明其對(duì)肌球蛋白降解具有一定的保護(hù)作用，但從統(tǒng)計(jì)學(xué)分析角度看，蛋白的組成沒有顯著性差異(P>0.05)。SDS-PAGE凝膠電泳上的最低蛋白分子量>15 kDa，圖3中TCA-可溶性肽的分子量一般小于1 kDa[10]，可能是凝膠電泳圖上未觀察到可得然膠改變魚糜蛋白組成的原因。

MHC. 肌球蛋白重鏈 Actin. 肌動(dòng)蛋白 M. 蛋白質(zhì)標(biāo)品 1～6. 可得然膠添加量分別為0，2，4，6，8，10 g/kg的高溫殺菌魚糜樣品

圖4 可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜蛋白組分的影響

Figure 4 Effects of curdlan on the SDS-PAGE patterns of high-temperature sterilization surimi gels

表3可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜SDS-PAGE圖譜中條帶灰度的影響?

Table 3 Effects of curdlan on the relative quantity of bands on SDS-PAGE pattern of high-temperature sterilization surimi gels

添加量/(g·kg-1)MHCActin0100.00±0.00100.00±0.002100.11±9.28A98.17±6.76A4106.38±3.03A87.04±5.82A6111.63±1.37A99.26±14.71A896.16±2.67A90.63±3.11A10106.86±16.00A99.31±7.07A

? 同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

添加可得然膠能夠改善高溫殺菌魚糜的凝膠特性。可得然膠可提高魚糜凝膠的儲(chǔ)能模量，增強(qiáng)持水性、破斷力、凝膠強(qiáng)度和咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性。而當(dāng)添加量>6 g/kg時(shí)，可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜凝膠特性的影響趨于平緩。綜上，可得然膠添加量為6 g/kg對(duì)高溫殺菌魚糜改善效果最好，可顯著提高魚糜復(fù)合凝膠的質(zhì)構(gòu)特性和熱穩(wěn)定性?？傻萌荒z能顯著降低TCA-可溶性肽含量，減緩高溫對(duì)魚糜蛋白的降解作用，但對(duì)蛋白組成的影響不明顯。本研究為常溫即食魚糜制品的開發(fā)提供了良好的理論依據(jù)。但限于時(shí)間，僅對(duì)質(zhì)構(gòu)特性和流變特性等指標(biāo)進(jìn)行了研究，后續(xù)可通過研究可得然膠-魚糜的蛋白作用力和空間結(jié)構(gòu)變化等進(jìn)一步深入探討可得然膠對(duì)高溫殺菌魚糜凝膠特性變化的機(jī)理。

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