黎恒，張琳，陳紅爽，張孟陽，黃娟，張嵐，王德培

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457）

N-乙酰-D-氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，NAG）是氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）的乙?；苌铮巧锛毎麅仍S多重要多糖的基本組成單位，其在治療關節(jié)炎、抑制腫瘤和抗氧化等方面有明顯效果，被廣泛應用于醫(yī)療、化妝品以及食品行業(yè)[1-3]，市場需求巨大。目前生產NAG的方法主要是甲殼素酸水解法[4]和化學合成法[5]，但因環(huán)境污染巨大以及存在過敏風險等因素，安全環(huán)保且生產周期短的微生物發(fā)酵法開始被關注和研究。而采用微生物發(fā)酵法生產NAG，關鍵在于菌株，目前國內外研究方向主要是一些霉菌、大腸桿菌及芽孢桿菌，其發(fā)酵產量均不太理想[6-8]，因此通過分子改造或誘變選育來篩選高產菌株具有非常重要的意義。

等離子體誘變是近年來發(fā)展迅速的一種物理誘變手段，由自由基、帶電粒子、中性粒子、光子等多種離子組成的等離子束作用于目標菌株，具有高突變率和突變株遺傳穩(wěn)定性良好的特點，被廣泛地應用于菌種誘變[9]。與分子手段相比，等離子體誘變育種具有操作簡便、安全無毒、低成本的優(yōu)點[10]。多功能等離子體誘變 系 統(tǒng) （multifunction plasma mutagenesis system，MPMS）作為一種新一代微生物誘變平臺，以等離子體誘變?yōu)橹?，可與紫外、化學誘變等多種手段結合，又再次提高了突變率和突變類型[11]。本試驗首次采用等離子體-紫外復合誘變，對解淀粉芽孢桿菌BI2進行誘變，通過對復合誘變條件的探究，以期來提高BI2產NAG的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌BI2（Bacillus amyloliquefaciens BI2）由天津科技大學生化過程與技術研究室自秸稈飼料中分離得到，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號：CGMCC No.3413。

1.1.2 試劑

無水葡萄糖、氯化鈉、（NH4）2SO4、K2HPO4·3H2O、KH2PO4（分析純）：博歐特（天津）化工貿易有限公司；酵母粉、蛋白胨、瓊脂、甘油（分析純）：北京奧博星生物科技有限公司；谷氨酸鈉（純度≥99%）：天津市紅玫瑰食品有限公司；NAG標品（純度≥99%）：美國Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

細菌基礎培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂 1.5%；pH7.0～7.2；滅菌121℃，15min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉20 g/L，氯化鈉 5 g/L；pH 7.0～7.2；滅菌 115 ℃，20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，氯化鈉 5 g/L，（NH4）2SO45 g/L，谷氨酸鈉 20 g/L，K2HPO4·3H2O 10 g/L，KH2PO45 g/L；pH7.5；滅菌 115 ℃，20 min。

葡萄糖篩選培養(yǎng)基：葡萄糖300g/L，蛋白胨0.5g/L，酵母粉 0.5 g/L，氯化鈉 5 g/L，瓊脂 1.5%；pH 7.0～7.2；滅菌115℃，20 min。

1.2 儀器與設備

Mandela型多功能等離子體誘變系統(tǒng)（MPMS）：北京艾德豪克儀器生物有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；TU-1810紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；三層立式多功能搖床：上海旻泉儀器有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：從斜面/平板挑取一環(huán)單菌落菌體接種到含有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于搖床中250 r/min，34℃培養(yǎng)16 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將活化好的種子液，以4%（體積分數(shù)）的接種量接種到含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于搖床中200 r/min，37℃發(fā)酵48 h。

誘變前菌體培養(yǎng)：取活化好的種子液，以4%（體積分數(shù)）的接種量接種到含有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于搖床中250 r/min，34℃培養(yǎng)10 h，使菌體處于對數(shù)生長的中期，鏡檢無芽孢。

1.3.2 菌株的誘變

菌懸液的制備：取1 mL誘變前菌體培養(yǎng)液12 000 r/min離心2 min，收集菌體，然后用無菌生理鹽水洗滌3次，最后將菌體重懸于無菌生理鹽水中，稀釋100倍，使細胞的終濃度為1×107個/mL。

等離子體誘變：取上述菌懸液10 μL均勻的涂布于誘變杯中，晾干后將其置于多功能等離子體誘變系統(tǒng)（multifunction plasma mutagenesis system，MPMS）中進行等離子體誘變，以99%的氮氣作為工作氣體，輸入功率120 W，間距10 mm，氣流量10 L/min，分別誘變時長 5、7、10、15、20、30、50 s來考察致死率及正突變率。

紫外誘變：取上述菌懸液10 μL均勻的涂布于誘變杯中，晾干后將其置于多功能等離子體誘變系統(tǒng)（MPMS）中進行紫外誘變，紫外線燈管功率為20 W（提前預熱 20 min），處理距離 25 mm，處理時間 5、7、10、15、20、30、50 s來考察致死率及正突變率。

等離子體-紫外復合誘變：取上述菌懸液10 μL均勻的涂布于誘變杯中，晾干后將其置于多功能等離子體誘變系統(tǒng)（MPMS），先等離子體誘變處理一定時間，緊接著進行紫外誘變?？疾熘滤缆始罢蛔兟?。

1.3.3 篩選方法

誘變初篩：在誘變處理后的誘變杯中加入1 mL生理鹽水將菌種洗下制成菌懸液。稀釋10倍后，取100 μL均勻涂到高糖篩選培養(yǎng)基表面，37℃靜置培養(yǎng)24 h，挑選菌落直徑≥3 mm的菌株。

誘變復篩：將保藏的初篩菌種接于液體種子培養(yǎng)基中，于搖床中250 r/min，34℃培養(yǎng)16 h，活化2次后以4%（體積比）的接種量接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于搖床中200 r/min，37℃培養(yǎng)48 h，采用高效液相色譜法分析乙酰氨糖產量，將高產菌株保存于20%（體積比）甘油管中-20℃保藏。

1.3.4 分析方法

致死率的計算：對誘變處理過的樣品在適當?shù)南♂尪认峦堪錖B平板，通過菌落形成單位（colonyforming units，CFU）來計算其致死率，并獲得致死率曲線。

致死率/%=（對照板菌落數(shù)-誘變板菌落數(shù)）/對照板菌落數(shù)×100

正突變率的計算：挑取葡萄糖篩選平板上菌落直徑≥3 mm的菌株，進行搖瓶復篩，以NAG產量較出發(fā)菌（BI2）提高20%的菌株統(tǒng)計為正突變株。

正突變率/%=正突變菌落數(shù)/葡萄糖篩選平板總菌數(shù)×100

NAG檢測方法：發(fā)酵液經(jīng)離心、稀釋后由Agilent 1200高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測[12]，色譜柱 HPX-87H（Bio-Rad），流動相5 mmol/L H2SO4，檢測器示差折光檢測器，柱溫 60 ℃，流速 0.6 mL/min，進樣量 10 μL。

2 結果與分析

2.1 初篩方法的建立

本試驗所用菌株BI2在葡萄糖耐受試驗中表現(xiàn)出高耐受性，在300 g/L葡萄糖濃度的平板培養(yǎng)下，依舊保持了30%的存活率，比較適合高糖高滲的工業(yè)化生產。且在高糖平板上其菌落直徑發(fā)生了較大改變，對菌落直徑大小進行統(tǒng)計，如表1所示。

表1 葡萄糖篩選平板菌落大小分布Table 1 The distribution of colony size on glucose screening plate

由表1可知，菌落直徑大小呈正態(tài)分布，菌落直徑≥3 mm的占10%，菌落直徑≤1.5 mm的菌落占20%，1.5 mm～3 mm的菌落占70%。對不同直徑菌落各取30個進行搖瓶發(fā)酵驗證NAG產量，并與出發(fā)菌株對照，如表2所示。

表2 葡萄糖篩選平板菌落大小與NAG產量Table 2 NAG yeild with different colony sizes of strains on glucose screening plate

由表2可知，發(fā)現(xiàn)在高糖平板上菌落直徑大小與NAG產量呈正相關性，既菌落直徑越大其NAG產量越高，其在300 g/L葡萄糖高滲平板上長勢越好，因為NAG與芽孢菌細胞壁合成有關，NAG產量越高，芽孢菌細胞壁越完整[13]。因此，本試驗選擇了葡萄糖篩選培養(yǎng)基并挑選菌落直徑≥3 mm的菌株，來作為初篩條件快速篩選NAG產量提高菌株。

2.2 等離子體誘變對菌株致死率及正突變率的影響

MPMS產生的等離子體中含有氮正離子（N+）、原子態(tài)氧（O）、OH-自由基等活性成分，可使微生物的細胞壁、細胞膜的結構及通透性改變，并對DNA和蛋白質等生物大分子造成損傷，導致大量細胞死亡。少量存活細胞通過修復機制，產生大量隨機突變[14]。因此，選擇合適的MPMS誘變時間能夠實現(xiàn)微生物的快速誘變育種。

本試驗先對出發(fā)菌株BI2進行等離子體單獨誘變。測定其致死率曲線見圖1。

圖1 等離子體誘變對菌株致死率和正突變率的影響Fig.1 The effect of MPMS treatment on lethality rate and positive mutagenesis rate

由圖1可知，多功能等離子體誘變系統(tǒng)對BI2的致死力較強，MPMS處理20 s時致死率達到91%，處理50 s時致死率達到98%。有研究表明，當微生物菌種的致死率為80%～95%時[15]，正突變率最高，但突變本身具有隨機性，其致死率與正突變率之間的關系并不是十分清楚，主要取決于誘變方法和菌株本身的特性。因此選取致死率在79%～96%之間的5個點測定其正突變率，如圖1顯示，結果表明等離子體處理15 s時正突變率最高，為15%，此時致死率為88%。

2.3 紫外誘變對菌株致死率及正突變率的影響

出發(fā)菌株經(jīng)紫外誘變處理不同時間的致死率和正突變率如圖2所示。

圖2 紫外誘變對菌株的致死率和正突變率影響Fig.2 The effect of Ultraviolet treatment on lethality rate and positive mutagenesis rate

由圖2可以看出，出發(fā)菌株對紫外處理也比較敏感，隨著處理時間的延長，致死率逐漸增加。當處理10 s時，致死率為57%，當處理30 s時，致死率為95%，處理50 s時致死率為100%。有文獻表明，紫外處理致死率在70%～80%之間時正突變率較高[16]。因此選取致死率在60%～95%之間的5個點進行正突變率測定。結果顯示，當紫外線處理20 s時，正突變率最高為10%，此時致死率為84%。

2.4 等離子體-紫外復合誘變對菌株致死率和正突變率的影響

復合誘變包括兩種或多種誘變劑的先后使用、同時使用、同一誘變劑的重復使用。普遍認為復合誘變具有協(xié)同效應。單一誘變因子長期使用容易使菌株產生耐受性，兩種或兩種以上誘變劑合理搭配進行復合誘變較單一誘變效果更好[17]。本試驗采用先等離子體后紫外處理的復合誘變順序，主要考慮兩種方法的處理時間對菌株誘變效果的影響。依次選取兩種方法正突變率最高的3個水平設計了全面實驗，探究復合誘變對菌株的致死率及正突變率影響。結果如表3所示。

由表3分析可知，在復合誘變中，隨著復合誘變時間的增加，致死率也隨之增加，但正突變率卻不一定隨之增加，說明兩種誘變因子存在協(xié)同和交互作用。而當致死率過高時，正突變率顯著下降。其中等離子體處理15 s，然后紫外處理15 s時正突變率最高為28%，此時致死率為92%?？梢钥吹綇秃险T變較單因子誘變的正突變率提高明顯，較等離子體單獨處理提高1.86倍，較紫外單獨處理提高2.8倍。

表3 等離子體-紫外復合誘變對菌株的致死率和正突變率影響Table 3 The effect of MPMS-Ultraviolet treatment on lethality rate and positive mutagenesis rate

2.5 等離子體-紫外復合誘變的篩選結果

取等離子體處理15 s和紫外處理15 s的復合誘變后的菌懸液，按照1.3.3的方法進行高濃度葡萄糖平板初篩，統(tǒng)計菌落直徑≥3 mm的占全部菌落的比例達到35%比出發(fā)10%有較大提高。由于在葡萄糖篩選平板上菌落大小與產NAG能力有正相關性，說明經(jīng)復合誘變作用后，突變株的正突變率明顯提高，挑取40株按照1.3.3的方法進行復篩，NAG產量見圖3所示。

由圖3可知，直徑≥3 mm的菌株中，80%的菌株發(fā)生了正突變，證明了初篩方法的有效性。從中篩選出一株NAG產量最高菌BH-7，NAG產量達到1.02 g/L，較出發(fā)菌提高3.4倍。經(jīng)過兩次復合誘變及篩選，分別篩選出 BH-14、BH-2-1、BH-3-2，NAG 產量依次為1.11、1.4、1.23 g/L，較出發(fā)菌分別提高 3.7、4.7、4.1 倍。

2.6 突變菌的遺傳穩(wěn)定性研究

為考察突變株的遺傳穩(wěn)定性，將經(jīng)過篩選到的四株產量提高菌（BH-7、BH-14、BH-2-1、BH-3-2）在 LB平板培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)10代，并將各代菌體分別經(jīng)種子活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，通過高效液相色譜法測定NAG產量，如圖4所示。

由圖4可知，菌株BH-7、BH-14、BH-2-1在傳代后NAG產量下降明顯，遺傳不穩(wěn)定。菌株BH-3-2在第3、4代產量略有下降，很快產量回復且遺傳比較穩(wěn)定。

圖3 復合誘變突變株NAG產量Fig.3 NAG production of the mutants on MPMS-Ultraviolet treatment

圖4 突變株的遺傳穩(wěn)定性實驗Fig.4 Genetic stability experiment of the mutant strains

3 結論

本文研究了等離子體、紫外以及等離子體-紫外復合誘變對芽孢菌致死率及正突變率的影響，對結果進行分析表明，等離子體誘變15 s時正突變率最高為15%，紫外誘變20 s時正突變率最高為10%，而在等離子體15 s和紫外15 s的復合誘變條件下，正突變率達到最高為28%，較單因子誘變效果提高明顯，可以作為誘變育種的首選方法。在該復合誘變條件下，通過初篩復篩，篩選出一株產量提高菌株BH-3-2。與出發(fā)菌株BI2相比，NAG產量從0.3 g/L提高到1.23 g/L，提高了4.1倍，傳代10次發(fā)現(xiàn)遺傳穩(wěn)定性良好。

參考文獻：

[1]Towheed T E,Maxwell L,Anastassiades T P,et al.Glucosamine therapy for treating osteoarthritis[J].Cochrane Database of Systematic Reviews,2005,2(2)：29-46

[2]Friedman S J,Skehan P.Membrane-active drugs potentiate the killing of tumor cells by D-glucosamine[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1980,77(2)：1172-1176

[3]Chen J K,Shen C R,Liu C L.N-Acetylglucosamine：Production and Applications[J].Marine Drugs,2010,8(9)：2493

[4]Bohlmann J A,Schisler D O,Hwang K O,et al.N-acetyl-D-glucosamine and process for producing N-acetyl-D-glucosamine：WO,US6693188[P].2004

[5]趙黎明,夏文水.N-乙酰-D-葡糖胺的特性及其在食品中的應用[J].食品科技,2001(6)：31-34

[6]Hsieh J W,Wu H S,Wei Y H,et al.Determination and Kinetics of Producing Glucosamine Using Fungi[J].Biotechnology Progress,2007,23(5)：1009-1016

[7]Deng M D,Severson D K,Grund A D,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for industrial production of glucosamine and N-acetylglucosamine.[J].Metabolic Engineering,2005,7(3)：201-214

[8]Liu Y,Zhu Y,Ma W,et al.Spatial modulation of key pathway enzymes by DNA-guided scaffold system and respiration chain engineering for improved N-acetylglucosamine production by Bacillus subtilis[J].Metabolic Engineering,2014,24(1)：61-69

[9]張雪,張曉菲,王立言,等.常壓室溫等離子體生物誘變育種及其應用研究進展[J].化工學報,2014,65(7)：2676-2684

[10]朱傳合,賀亞男,路福平,等.N～+離子注入阿維拉霉素產生菌誘變效應的研究[J].核技術,2006,29(8)：609-613

[11]石秀峰,紀曾春,常傳友,等.利用多功能等離子體誘變系統(tǒng)快速誘變選育γ-氨基丁酸高產菌株[J].中國釀造,2016,35(4)：127-130

[12]池亞斌,顧洋,劉龍,等.常壓室溫等離子體誘變高通量篩選N-乙酰氨基葡萄糖高產突變株[J].工業(yè)微生物,2016,46(3)：13-19

[13]周德慶.微生物學教程[M].天津：高等教育出版社,2011

[14]Morfill G E,Kong M G,Zimmermann J L.Focus on Plasma Medicine[J].New Journal of Physics,2009,11(11)：115-117

[15]Yu Z L,Qiu L J,Huo Y P.Progress in studies of biological effect and crop breeding induced by ion implantation[J].Journal of Anhui A－gricultural University,1991,24(4)：55-57

[16]何國慶,賈英民,丁立孝.食品微生物學[M].北京：中國農業(yè)大學出版社,2010

[17]蔣汶,張慶慶,湯文晶,等.紫外-等離子體復合誘變紅曲霉產胞外多糖[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2016,42(1)：64-69