侯艷茹，馬曉冰，蘇 琳，趙雅娟，羅玉龍，趙麗華，靳 燁*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

蘇尼特羊是內(nèi)蒙古地區(qū)優(yōu)秀的肉羊種群，其肉質(zhì)具有細嫩、味美多汁、易消化等特點，受到廣大消費者的喜愛[1]。飼養(yǎng)方式是影響肉品品質(zhì)的重要因素，F(xiàn)luharty等[2]的研究表明，合理的舍飼育肥能夠提高動物的生長育肥性能，還可以改善肉質(zhì)。本團隊研究發(fā)現(xiàn)，放牧條件下蘇尼特羊肉的色澤和嫩度都優(yōu)于圈養(yǎng)條件，且營養(yǎng)成分更豐富[3-4]，這說明飼養(yǎng)方式對肉品品質(zhì)有所影響。一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是蛋白激酶級聯(lián)的下游組件，屬于代謝敏感的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其主要功能是根據(jù)機體的能量需求調(diào)節(jié)整個機體的能量平衡[5-6]。AMPK能夠調(diào)節(jié)機體的糖代謝，糖酵解是引起動物宰后肌肉pH值下降的主要原因，而動物宰后的pH值變化速度與幅度可以影響肌肉的色澤、嫩度、系水力、蒸煮損失等品質(zhì)指標[7-9]，所以動物宰后糖酵解的程度直接影響肉質(zhì)的好壞。飼養(yǎng)方式會對肉品品質(zhì)產(chǎn)生影響，而AMPK能夠通過調(diào)節(jié)動物宰后糖酵解的程度而影響肉質(zhì)。所以，研究飼養(yǎng)方式對動物宰后AMPK活性以及糖酵解指標的影響，通過調(diào)控AMPK的活性來改變糖酵解的進程進而影響肉質(zhì)，無疑是改善肉品品質(zhì)的新思路。

本研究以不同飼養(yǎng)條件下（放牧和圈養(yǎng)）12 月齡蘇尼特羊背最長肌為實驗材料，對AMPK活力、AMPK基因mRNA相對表達量以及糖酵解指標進行測定，并分析了AMPK與糖酵解指標之間的相關性，旨在為通過調(diào)控AMPK活性改善宰后肉品品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取來自內(nèi)蒙古巴彥淖爾市海流圖鎮(zhèn)12 月齡蘇尼特羊放牧和圈養(yǎng)各10 只，其中每種飼養(yǎng)方式公母各半，體質(zhì)量（43.56±6.24）kg，胴體質(zhì)量（21.29±4.69）kg。宰后1 h內(nèi)取背最長肌，切成100 mg小塊，立即放入無酶無菌凍存管中，投入液氮中冷凍保存，然后置于-80 ℃冰箱中，作為實驗用材料。

RNAiso Plus RNA提取裂解液、PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM實時熒光定量試劑盒 大連寶生物工程有限公司；DNase/RNase-free無菌水 北京天根生物技術有限責任公司；綿羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒、己糖激酶測定試劑盒、乳酸測定試劑盒、肌/肝糖原測定試劑盒、總蛋白定量測定試劑盒（二喹啉甲酸比色法） 南京建成生物工程研究所；Tris-HCl緩沖液、D-甘露醇 美國Amresco公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid，EGTA） 美國Sigma公司；二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT） 德國Merck公司；氟化鈉、焦磷酸鈉 天津永大化學試劑廠；濃硫酸、氯化鈉國藥集團化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

pH-STAR型胴體pH值直測儀 德國Matthaus公司；TC-P2A全自動測色色差計 上海生物生化實驗儀器公司；CL-M嫩度儀 上海精密科學儀器有限公司；5417R低溫臺式冷凍離心機 德國Eppendorf生物公司；CFX96TM實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；BG-power 3500型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、水平電泳槽北京百晶生物技術有限公司；PCR擴增儀 北京北方華奧貿(mào)易有限責任公司；TU-1810紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱上海一恒科學儀器有限公司；XHF-DY高速分散器寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AMPK的活力測定

取保存于-80 ℃冰箱的樣品約0.3 g，按照1∶5（m/V）的比例加入保存于4 ℃冰箱的冷凍勻漿液（0.25 mol/L的D-甘露糖、5 mmol/L的焦磷酸鈉、0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.4）、1 mmol/L的DTT、1 mmol/L的EGTA、1 mmol/L的EDTA、50 mmol/L的氟化鈉），在3 000 r/min的條件下冰浴勻漿。4 ℃、10 000 r/min冷凍離心5 min，取上清液用于AMPK活力的測定。AMPK活力的測定步驟以及計算參照綿羊p-AMPK酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書進行。

1.3.2 AMPK基因相對表達量的測定

1.3.2.1 總RNA的提取及檢測

依據(jù)RNAiso Plus試劑盒的說明書對肌肉中總RNA進行提取[10]。將提取的總RNA置于核酸蛋白分析儀上檢測其質(zhì)量濃度和純度（A260nm/A280nm）。并用1%（質(zhì)量分數(shù)，下同）的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總RNA的完整性。

1.3.2.2 反轉(zhuǎn)錄

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄操作，將合成的cDNA質(zhì)量濃度稀釋至50 ng/μL。將反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹11]。

1.3.2.3 引物序列來源及合成

PRKAA1、PRKAA2、PRKAG3以及GAPDH（內(nèi)參基因）基因引物序列參照馬曉冰的設計[12]，由華大科技基因有限公司合成（表1）。

表1 實時熒光PCR引物序列Table 1 Primers used for real-time PCR

1.3.2.4 實時熒光PCR擴增

本實驗按照CFX96TM實時熒光PCR檢測系統(tǒng)的二步法進行操作。以1.3.2.2節(jié)所合成的cDNA為模板，使用實時熒光定量試劑盒進行實時熒光PCR擴增[11]。反應體系為：SYBR Premix Ex Taq II（2×）12.5 μL；上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL；DNA模板（50 ng/μL）2.0 μL；dH2O 8.5 μL；共25.0 μL。實時熒光PCR條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10min。產(chǎn)物保存于4 ℃冰箱。

1.3.2.5 實時熒光PCR產(chǎn)物檢測

使用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在120 V的電壓下進行電泳檢測，使用凝膠成像儀拍照分析。

1.3.2.6 基因相對表達量的計算

本實驗采用2?ΔΔCt計算法對實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)進行處理和分析，2?ΔΔCt為相對表達量，ΔΔCt＝（處理組目的基因Ct值-處理組內(nèi)參基因Ct值）-（未處理組目的基因Ct值-未處理組內(nèi)參基因Ct值）[13]。

1.3.3 糖酵解指標的測定

己糖激酶活力的測定按照己糖激酶測定試劑盒的說明書進行操作；乳酸含量的測定按照乳酸測定試劑盒的說明書進行操作；肌糖原含量測定按照肝/肌糖原測定試劑盒的說明書進行操作。

1.3.4 肉品品質(zhì)相關指標的測定

1.3.4.1 pH值的測定

在屠宰后45 min時，使用胴體直測式pH計測胴體初pH值，記為pH1；靜置排酸24 h后測胴體最終pH值，記為pH24。

1.3.4.2 色澤的測定

使用TC-P2A全自動色差儀對肉色進行測定，L*值表示亮度，b*值為黃度，a*值表示紅度。每個樣品選取3 個位置，重復測定后取平均值。

1.3.4.3 嫩度的測定

沿肌肉方向取2.5 cm×3.0 cm×5.0 cm的肌肉塊，用自封袋密封后水浴加熱（75 ℃、45 min），冷卻至室溫后沿著肌纖維的方向?qū)⑷鈮K切成3 cm×1 cm×1 cm的條狀，使用CLM-3型嫩度儀對剪切力值進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)值以表示。以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼養(yǎng)方式對肉質(zhì)指標的影響

表2 不同飼養(yǎng)方式下的肉質(zhì)指標（n＝10）Table 2 Meat traits under different feeding conditions (n= 10)

由表2可知，放牧條件下蘇尼特羊背最長肌的剪切力值顯著大于圈養(yǎng)條件（P＜0.05），這可能與不同飼養(yǎng)方式下骨骼肌肌纖維的發(fā)育、肌肉脂肪的含量以及水分含量有關[3,14]。放牧條件下蘇尼特羊背最長肌的L*值、a*值以及b*值均大于圈養(yǎng)條件，其中L*值和b*值差異顯著（P＜0.05）。兩種飼養(yǎng)方式的pH1值和pH24值差異不顯著（P＞0.05），研究表明不同飼養(yǎng)方式下18 月齡衛(wèi)山羊羯羊的pH24值差異不顯著[15]，與本實驗結(jié)果一致，這可能是因為pH值還受到其他因素的共同影響。

2.2 飼養(yǎng)方式對蘇尼特羊AMPK活力和基因相對表達量的影響

2.2.1 飼養(yǎng)方式對AMPK活力的影響

本實驗用AMPK磷酸化水平代表AMPK活力，不同飼養(yǎng)方式12 月齡蘇尼特羊背最長肌的AMPK活力分別為：放牧條件（8.83±1.07）ng/mL、圈養(yǎng)條件（9.51±1.30）ng/mL。結(jié)果表明，放牧條件下蘇尼特羊AMPK活力低于圈養(yǎng)條件下，但兩種飼養(yǎng)方式差異不顯著。AMPK活力會受到運動、缺氧、缺血、應激等多種因素的影響[16-18]，圈養(yǎng)條件下，蘇尼特羊背最長肌AMPK活力高于放牧條件，推測原因可能是由于圈養(yǎng)的羊和放牧的羊相比，宰前應激反應比較大，導致AMPK的活力升高。但兩種飼養(yǎng)方式AMPK活力差異不顯著（P＞0.05），說明飼養(yǎng)方式對AMPK活力影響較小。

2.2.2 AMPK基因相對表達量測定結(jié)果

2.2.2.1 總RNA提取結(jié)果

背最長肌肌肉組織中提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像結(jié)果如圖1所示（以其中3 個樣品為例）。

圖1 總RNA電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA

如圖1所示，提取的總RNA 3 條條帶（28S、18S、5S）完整且清晰明亮，說明所提取的總RNA并無降解。經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測，A260nm/A280nm均在1.8～2.1之間，說明提取的總RNA的純度高，并未被污染，可用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄實驗。

2.2.2.2 實時熒光PCR產(chǎn)物結(jié)果

圖2 各基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of the genes

內(nèi)參基因和各目的基因經(jīng)實時熒光PCR反應后，得到大量擴增產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，凝膠成像結(jié)果如圖2所示。圖中4 個基因的條帶單一且清晰明亮，說明經(jīng)PCR反應后得到的擴增產(chǎn)物單一，沒有引物二聚體和非特異性產(chǎn)物，將目的基因的片段與DL1000 DNA Marker比較，其條帶大小與所設計的引物目的產(chǎn)物片段大小相一致，說明所設計的引物反應性能良好，符合實時熒光PCR實驗要求，經(jīng)實時熒光PCR后的產(chǎn)物為本實驗所需產(chǎn)物。

2.2.2.3 AMPK基因表達規(guī)律

AMPK以異源三聚體的形式存在于生物體中，由α、β、γ3 種亞基構(gòu)成，其中α是催化亞基，β和γ是調(diào)節(jié)亞基[19]。每個亞基又存在不同的亞型，如α1和α2，β1和β2，γ1、γ2和γ3[20]。由于α是催化亞基，所以目前對AMPK α1和α2這兩個亞基的功能等方面的相關研究比較多，因為γ3亞基在骨骼肌中具有高表達[21]，且有研究表明PRKAG3基因與糖代謝有關[22-23]，所以本實驗選擇分別編碼α1、α2和γ3亞基的PRKAA1、PRKAA2和PRKAG3基因來分析AMPK的mRNA相對表達量。不同飼養(yǎng)方式下蘇尼特羊的PRKAA1、PRKAA2以及PRKAG3基因相對表達量如圖3所示。

圖3 AMPK部分亞基基因表達水平Fig. 3 Gene expression of some subunits of AMPK

如圖3所示，不同飼養(yǎng)條件下，蘇尼特羊PRKAA1和PRKAG3基因的相對表達量均為圈養(yǎng)條件高于放牧條件，且差異顯著（P＜0.05），而PRKAA2基因相對表達量為放牧條件顯著大于圈養(yǎng)條件（P＜0.05）。AMPK α1亞基主要在脂肪細胞中表達[24]，由于圈養(yǎng)蘇尼特羊比放牧蘇尼特羊含有更多的脂肪組織，這可能導致編碼AMPK α1亞基的PRKAA1的相對表達量增高。研究表明耐力訓練會導致AMPK α2亞基蛋白和基因相對表達量顯著增加[25]。較圈養(yǎng)羊而言，放牧的蘇尼特羊處于長期運動的生長狀況下，可能會導致編碼AMPK α2亞基的PRKAA2基因相對表達量顯著增加。放牧條件PRKAG3基因相對表達量顯著小于圈養(yǎng)條件，可能是由于PRKAG3基因在ⅡB型肌纖維中表達量較高[26]，而圈養(yǎng)條件下蘇尼特羊背最長肌的ⅡB型肌纖維數(shù)量要高于放牧條件[3]。以上結(jié)果表明，飼養(yǎng)方式對AMPK的基因相對表達量有顯著影響。

2.3 飼養(yǎng)方式對蘇尼特羊宰后糖酵解指標的影響

表3 不同飼養(yǎng)方式糖酵解指標（n＝10）Table 3 Glycolysis indicators under different feeding conditions (n= 10)

不同飼養(yǎng)條件下蘇尼特羊背最長肌宰后糖酵解指標測定結(jié)果如表3所示，蘇尼特羊背最長肌己糖激酶的活力為圈養(yǎng)條件高于放牧條件，但兩種飼養(yǎng)方式差異不顯著（P＞0.05）；乳酸含量也為圈養(yǎng)條件大于放牧條件，且差異顯著（P＜0.05）；放牧條件下肌糖原含量高于圈養(yǎng)條件，但差異不顯著（P＞0.05）。不同飼養(yǎng)方式會對AMPK的活力以及基因相對表達量有所影響，研究表明AMPK活力會進一步影響糖酵解指標[27]，這就造成了糖酵解指標在不同飼養(yǎng)方式下的差異。

2.4 AMPK與糖酵解指標及肉品品質(zhì)的相關性

2.4.1 AMPK活力與糖酵解指標及肉品品質(zhì)的相關性

表4 AMPK活力與糖酵解指標及肉品質(zhì)的相關性Table 4 Correlation coefficients between relative AMPK activity and glycolysis indices and meat quality

由表4可知，AMPK活力與己糖激酶活力以及乳酸含量均呈顯著正相關（P＜0.05），與肌糖原含量相關程度很低（P＞0.05），與剪切力、色澤以及pH值均呈負相關（P＜0.05）。Shen Qingwu W.等[28]向小鼠體內(nèi)腹腔注射AMPK的抑制劑——復合物C，研究顯示復合物C抑制了宰后小鼠背最長肌中AMPK的活力以及糖酵解進程。這說明AMPK可以調(diào)控宰后動物肌肉的糖酵解。

2.4.2 AMPK基因相對表達量與AMPK活力、糖酵解指標以及肉品品質(zhì)的相關性

表5 AMPK基因相對表達量與AMPK活力、糖酵解指標及肉品質(zhì)的相關性Table 5 Correlation coefficients between relative expression of AMPK gene and AMPK activity, glycolysis and meat quality

由表5可知，PRKAA1、PRKAA2和PRKAG3基因相對表達量均與AMPK活力呈正相關，其中PRKAG3基因相對表達量均與AMPK活力呈顯著正相關（P＜0.05），說明這3 個基因的相對表達量與AMPK活力變化趨勢相一致。PRKAA1和PRKAG3基因相對表達量與己糖激酶活力呈正相關，其中PRKAG3基因相對表達量與己糖激酶活力呈顯著正相關（P＜0.05），而PRKAA2基因相對表達量與己糖激酶活力呈負相關，但相關程度較低。PRKAA1和PRKAG3基因相對表達量均與乳酸含量呈顯著正相關（P＜0.05）。3 個基因的相對表達量與肌糖原含量均呈負相關，但相關程度較低。PRKAG3基因相對表達量與剪切力呈顯著負相關（P＜0.05），有研究對PRKAG3基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）關聯(lián)性進行分析，表明T2885C這個SNP與剪切力有密切的聯(lián)系，可以作為未來肉牛選育的輔助標記[29]，這說明PRKAG3基因的相對表達量對肌肉的嫩度有所影響。

以上結(jié)果表明，PRKAA1和PRKAG3基因的相對表達量對糖酵解指標有一定的影響，而PRKAA2基因的相對表達量對糖酵解指標影響較小，即AMPK α1亞基和AMPK γ3亞基在機體內(nèi)相對表達量高時，AMPK活力增加，AMPK活化后促使糖酵解的關鍵酶己糖激酶的活力增加，從而加速動物宰后糖酵解的進程，使得乳酸大量堆積。乳酸是影響動物宰后pH值的重要因素，pH值又是影響肉品品質(zhì)的關鍵指標，這說明AMPK可以通過調(diào)控動物宰后糖酵解的進程從而對肉品品質(zhì)產(chǎn)生影響。也有相關研究表明不同條件下肉質(zhì)會發(fā)生改變，可能是由于AMPK對糖酵解的關鍵酶己糖激酶、果膠酯酶和乳酸脫氫酶活力的調(diào)節(jié)，進而改變了糖酵解的速率和程度，最終對肉品品質(zhì)產(chǎn)生影響[30-31]。

3 結(jié) 論

通過對蘇尼特羊放牧和圈養(yǎng)兩種方式下AMPK活力、AMPK mRNA相對表達量以及糖酵解指標進行測定，發(fā)現(xiàn)圈養(yǎng)條件下PRKAA1以及PRKAG3基因表達均顯著高于放牧條件，并且AMPK的活力、己糖激酶活力和乳酸含量也高于放牧條件。說明PRKAA1以及PRKAG3基因相對表達量升高會使AMPK的活力增加，AMPK被激活后直接磷酸化糖酵解通路中的關鍵酶己糖激酶，使己糖激酶活力增加，從而促進糖酵解進程，產(chǎn)生大量乳酸，導致宰后動物肌肉的pH值下降，對肉品品質(zhì)產(chǎn)生一定影響。因此，未來可通過調(diào)控AMPK的活力以改善不同飼養(yǎng)方式下的肉質(zhì)。

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