茍安娜，潘新雨，柏丁丁，鐘 凱，冉 云，黃毅娜,*，高 鴻

（1.四川大學輕紡與食品學院，四川 成都 610065；2.四川大學華西公共衛(wèi)生學院，四川 成都 610041）

野陽合（Habenaria ciliolaris Kranzl）又名毛葶玉風花，屬于雙子葉蘭科植物，分布于我國長江流域及以南的湖南、四川等地區(qū)，其含蛋白質、糖類、維生素及礦物質等多種營養(yǎng)成分，深受當地居民的青睞。據《新華本草綱要》記載，野陽合具有滋陰補腎、消炎消腫等藥用功效，對便秘、糖尿病等的治療有輔助作用。然而，目前關于野陽合生物活性方面的研究較少。

花色苷是花青素與糖以糖苷鍵結合而成的一類化合物，是植物中色素最適宜的存在形式[1]，具有類黃酮物質的典型結構[2-3]。它不僅能賦予植物色彩[4-5]，還是非常有效的天然抗氧化劑[6-8]，其清除自由基的能力是VC的20 倍[9]。除此之外，花色苷還具有預防心血管疾病[10]、抗腫瘤[11]、調節(jié)血糖血脂[12]、抑菌[13]和抗炎[14]等多種生理功能。因而，花色苷在醫(yī)療、食品和化妝品等領域極具應用前景。

近年來，對花色苷的研究主要集中于對富含花色苷植物中花色苷種類的定性定量分析、提取方式的優(yōu)化以及花色苷生理功能的研究，但常見富含花色苷的藍莓、黑加侖等植物價格較昂貴，因此含花色苷的平價植物逐漸走進研究視野。野陽合多作為地方野菜，價格低廉，含多種營養(yǎng)成分，其顏色呈紫色，推測其含有花色苷，但目前鮮有對野陽合花色苷的研究。本研究采用酸化乙醇提取野陽合花色苷，測定花色苷含量并定性分析花色苷的組成，測定野陽合花色苷提取物（anthocyanins extract of H. ciliolaris Kranzl，HAE）對2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除能力，通過測定細胞存活率、細胞膜脂質過氧化程度及細胞內活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的水平，研究HAE對過氧化氫（H2O2）誘導的中國倉鼠肺細胞（V79-4細胞）氧化損傷的保護作用，為野陽合的進一步開發(fā)利用提供實驗數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用野陽合采自四川雅安，由四川農業(yè)大學徐正君教授鑒定。于-20 ℃冷凍貯藏。

V79-4細胞 中國科學院上海生命科學院細胞資源中心；DMEM（Dulbecco’s modified Eagle medium）細胞培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；沒食子酸、福林-酚（Folin-Ciocalteu）試劑 成都科龍化工試劑廠；ABTS大連美侖生物技術有限公司；DPPH 上海晶純生化科技股份有限公司；水溶性VE（Trolox）、噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、十二烷基硫酸鈉、硫代巴比妥酸、2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA） 美國Sigma公司；乙醇、濃鹽酸、亞硝酸鈉、碳酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、雙氧水等（均為分析純） 成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

LC-6AD高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng) 日本島津公司；色譜柱（SB-C18，250 mm×4.6 mm ，5 μm） 美國安捷倫公司；SPECTRA MAX190酶標儀 美國Molecular Devices公司；LGJ-50F冷凍干燥機 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；MCO-15AC細胞培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；API 3200電噴霧質譜 德國姆施塔特應用生物系統(tǒng)公司；Varioskan Flash熒光酶標儀美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 HAE的制備

挑選野陽合凍果，解凍后除去雜質與葉梗，稱取10 g磨碎，采用0.1 mol/L鹽酸與無水乙醇（40∶60，V/V）以固液比1∶20（m/V）、浸提溫度20 ℃及浸提時間120 min的條件避光提取，溶液過濾并定容至200 mL，得到野陽合花色苷提取液，避光保存，備用。將提取液冷凍干燥后得到HAE，避光保存，備用。

1.3.2 總酚含量的測定

參考文獻[15-16]的方法并稍作修改。將1.3.1節(jié)中制得的25.0 mg HAE溶于1.0 mL甲醇中，取0.1 mL與7.5%（質量分數，下同）的Na2CO3溶液1.5 mL混合，搖勻。靜置2 min后，加入用蒸餾水對倍稀釋（V/V）的Folin-Ciocalteu試劑0.9 mL，充分混合后，加入5.0 mL蒸餾水定容，室溫避光靜置30 min，測定反應液在750 nm波長處的吸光度。以乙醇為空白對照，以沒食子酸當量計算野陽合中的總酚含量?；貧w方程為y＝0.000 8x-0.013 3，R2＝0.999，其中y為吸光度，x為沒食子酸質量濃度/（μg/mL）。

1.3.3 花色苷質量濃度的測定

參考文獻[17]的方法，采用雙波長pH示差法。取1.3.1節(jié)中野陽合花色苷提取液1 mL，分別加入pH 4.5的0.4 mol/L醋酸鈉緩沖液或pH 1.0的0.25 mol/L氯化鉀緩沖液4.0 mL，搖勻，避光靜置120 min，轉入1 cm石英比色皿中，以蒸餾水為空白對照，采用紫外-可見分光光度計分別在520 nm和700 nm波長處測定其吸光度。以矢車菊素-3-葡萄糖苷當量表示花色苷質量濃度，并根據式（1）計算野陽合中的花色苷質量濃度。

式中：A為最終吸光度，A＝（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5；摩爾質量M為449.2 g/mol；摩爾吸光系數ε為26 900 L/（mol·cm）；L為比色皿光路長/cm；n為稀釋倍數。

1.3.4 HAE組成分析

稱取HAE 2.0 mg，溶于1.0 mL乙醇中，過0.22 μm微孔濾膜，得到待測液。參考文獻[18]的方法，采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用（high performance liquid chromatographymass spectrometry，HPLC-MS）進行分析。

HPLC條件：SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長520 nm；進樣量20 μL；梯度洗脫：A相：水（5%甲酸），B相：甲醇。洗脫程序：0～2 min，5% B；2～10 min，5%～20% B；10～15 min，20% B；15～30 min，20%～25% B；30～35 min，25% B；35～50 min，25%～33% B；50～55 min，33% B；55～65 min，33%～36% B；65～70 min，36%～45% B；70～75 min，45%～53% B；75～80 min，53%～55% B；80～84 min，55%～70% B；84～88 min，70%～5% B；88～90 min，5% B。

MS分析條件：光電二極管陣列檢測器掃描范圍為200～800 nm。大氣壓電噴霧離子源，正離子模式，毛細管電壓1.50 kV，錐孔電壓50 V，離子源溫度105 ℃，脫溶劑氣溫度420 ℃，錐孔氣流量45 L/h，脫溶劑氣流量530 L/h。

1.3.5 ABTS+·清除能力測定

參考文獻[19-20]的方法，7.00 mmol/L ABTS水溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀于室溫暗處避光孵育15～18 h，制得ABTS基準液。取適量ABTS基準液，用蒸餾水將其稀釋至A734nm為0.700±0.005，制得工作液。

將不同花色苷質量濃度（28.64、14.32、7.16、3.58、1.79 μg/mL）的HAE溶液50 μL與ABTS工作液200 μL混合，充分振蕩，室溫避光孵育30 min，于波長734 nm處測定吸光度。以VC和Trolox作為陽性對照，按照公式（2）計算ABTS+·的清除率。

式中：A1表示實驗組吸光度；A0表示空白對照組吸光度；AB表示背景吸光度。

1.3.6 DPPH自由基清除能力測定

參考文獻[19-20]的方法，采用乙醇溶液作為溶劑，配制濃度為0.2 mmol/L的DPPH自由基溶液，避光保存。

將不同花色苷質量濃度（28.64、14.32、7.16、3.58、1.79 μg/mL）的HAE溶液100 μL與DPPH自由基溶液100 μL混合，充分振蕩，室溫避光孵育30 min，于波長517 nm處測定吸光度，以VC和Trolox作為陽性對照，按照公式（3）計算DPPH自由基清除率。

式中：A1表示實驗組吸光度；A0表示空白對照組吸光度；AB表示背景吸光度。

1.3.7 細胞培養(yǎng)

選用V79-4細胞，以含10%胎血牛清、100 μg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時小心吹起細胞，并制成單細胞懸液[21]。

1.3.8 HAE對H2O2誘導V79-4細胞氧化損傷的影響

參考文獻[22-23]并稍微修改，體外建立H2O2誘導V79-4細胞氧化損傷模型，采用MTT法檢測細胞存活率。取處于對數生長期的V79-4細胞，以1.2×105個/mL接種于96 孔板中；培養(yǎng)16 h后，吸出全部原培養(yǎng)液，正常對照組和H2O2損傷組加入培養(yǎng)基，樣品處理組分別加入劑量為50、100、200 μg/mL的HAE溶液。處理1 h后，正常對照組加入培養(yǎng)基，H2O2損傷組和樣品處理組加入含1 mmol/L H2O2的培養(yǎng)基。在37 ℃下處理20 h后，加入20 μL質量濃度為5 mg/mL的MTT，37 ℃孵育4 h后停止培養(yǎng)，吸出上清液，每孔加入二甲基亞砜，于570 nm波長處測定OD值，計算細胞存活率。每個劑量5 個復孔，重復3 次，另設無細胞空白孔以消除培養(yǎng)基對OD值的影響。

1.3.9 HAE對H2O2誘導V79-4細胞膜脂質過氧化的影響

參考文獻[24]并稍微修改，采用硫代巴比妥酸反應產物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）含量衡量細胞膜脂質過氧化程度。取處于對數生長期的V79-4細胞，以1×105個/mL接種于96孔板中；培養(yǎng)16 h后，吸出全部原培養(yǎng)液，正常對照組和H2O2損傷組加入培養(yǎng)基，樣品處理組分別加入劑量為50、100、200 μg/mL的HAE溶液。處理1 h后，正常對照組加入培養(yǎng)基，H2O2損傷組和樣品處理組加入含1 mmol/L H2O2的培養(yǎng)基。孵育1 h后，細胞用預冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗，均質重懸于預冷的1.15% KCl溶液中。取出100 μL的細胞溶解物，加入8.1%十二烷基硫酸鈉0.2 mL、20%冰醋酸（pH 3.5）1.5 mL和0.8%硫代巴比妥酸1.5 mL，用蒸餾水定容至4 mL，95 ℃加熱2 h。冷卻至室溫后，加入正丁醇與吡啶（15∶1，V/V）的混合液5 mL，搖勻。離心10 min后，吸取上清液在532 nm波長處測定OD值，計算TBARS含量。每個劑量5 個復孔，重復3 次，另設無細胞空白孔以消除培養(yǎng)基對OD值的影響。

1.3.10 HAE對胞內ROS的清除能力

參考文獻[25]，采用熒光探針DCFH-DA檢測胞內胞內ROS水平。取處于對數生長期的V79-4細胞，以2×104個/mL接種于96 孔板中；培養(yǎng)16 h后，吸出全部原培養(yǎng)液，H2O2損傷組加入培養(yǎng)基，樣品處理組分別加入劑量為50、100、200 μg/mL的HAE溶液。處理30 min后，加入含1 mmol/L H2O2的培養(yǎng)基，在37 ℃下孵育30 min后，加入25 mmol/L的DCFH-DA繼續(xù)孵育10 min，收集細胞，PBS沖洗2 次，將各組細胞制成細胞懸液。取細胞懸液，使用熒光酶標儀檢測熒光強度，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長538 nm。以H2O2損傷組熒光強度為100%，其余各組與損傷組相比，計算胞內ROS清除率。每個劑量5 個復孔，重復3 次，另設無細胞空白孔以消除培養(yǎng)基對熒光強度的影響。

1.4 數據統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0軟件對數據進行處理，實驗結果以表示，兩組平均數之間采用t檢驗，以P＜0.05表示差異顯著，以P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 總酚和花色苷含量

總酚含量通常能夠反映物質的潛在生物活性，F(xiàn)olin-Ciocalteu比色法因其方法簡便、結果可靠，常被用于多酚含量的測定。本實驗中，野陽合多酚的含量為（0.65±0.21）g沒食子酸/100 g md。

在不同的pH值條件下，花色苷結構的變化使其色調和色度發(fā)生改變：pH值為1.0時，花色苷以紅色的2-苯基苯并吡喃的形式存在；pH 4.5時花色苷以無色的甲醇假堿的形式存在[26]?；诖嗽聿⒔Y合朗伯-比爾定律可得出，在這兩個不同的pH值下，花色苷結構發(fā)生變化，其溶液吸光度的差值與花色苷的含量成比例。本實驗中，野陽合花色苷的含量經測定為（81.38±1.45）mg矢車菊素-3-葡萄糖苷/100 g md。

2.2 HAE組成分析

采用HPLC對HAE進行分析，結果見圖1。HAE在520 nm波長處的色譜峰有4 個，保留時間分別為25.9、29.7、41.7、45.8 min。

圖1 HAE的HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram of anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl

為鑒定野陽合中花色苷的成分，采用HPLC-MS對該提取物進行定性分析，花色苷單體的質譜碎片離子結果見表1。圖1中的峰1、2、3、4對應一級質譜離子質荷比（m/z）分別是449、595、463和609，依據保留時間、離子片段大小和文獻[18]的報道，推測這4 種花色苷為矢車菊素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-（6”-香豆酰）葡萄糖苷、芍藥色素-3-葡萄糖苷和芍藥色素-3-（6”-香豆酰）葡萄糖苷。

表1 HAE的組成Table 1 Identification of anthocyanins compositions from H. ciliolaris Kranzl

2.3 HAE清除自由基的能力

2.3.1 ABTS+·清除能力

ABTS法被廣泛用于體外抗氧化活性的測定。在反應體系中，ABTS氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基，與自由基清除劑發(fā)生反應使反應體系褪色，褪色程度能夠反映自由基清除劑清除ABTS+·能力的強弱[27]。

圖2 HAE清除ABTS·的能力Fig. 2 ABTS radical scavenging capacity of anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl

由圖2可知，在0～6.0 μg/mL范圍內，HAE和兩種陽性對照對ABTS+·的清除率隨質量濃度的增加而增大，且呈劑量依賴關系。VC、Trolox和HAE清除ABTS+·的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為（1.76±0.21）、（4.32±0.35）μg/mL和（1.72±0.26）μg/mL，表明HAE對ABTS+·的清除能力與VC相當，優(yōu)于Trolox。

2.3.2 DPPH自由基清除能力

DPPH是目前使用最為廣泛的自由基試劑之一。DPPH自由基在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，當加入自由基清除劑時，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色的DPPH-H非自由基形式，褪色程度能夠反映自由基清除劑清除DPPH自由基能力的強弱[27]。

圖3 HAE清除DPPH自由基的能力Fig. 3 DPPH radical scavenging capacity of anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl

由圖3可知，在0～7.0 μg/mL范圍內，HAE和兩種陽性對照對DPPH自由基的清除率隨質量濃度的增加而增大，且呈劑量依賴關系。VC、Trolox和HAE清除DPPH自由基的IC50分別為（1.78±0.38）、（3.69±0.52）μg/mL和（0.74±0.24）μg/mL，表明HAE對DPPH自由基的清除能力優(yōu)于VC和Trolox。

2.4 HAE對H2O2誘導V79-4細胞氧化損傷的保護作用

圖4 HAE對V79-4細胞存活率的影響Fig. 4 Cell viability of V79-4 cells after treatment with anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl

如圖4所示，正常對照組未受到H2O2誘導氧化損傷和樣品處理，細胞存活率為100%。V79-4細胞經不同劑量（50、100、200 μg/mL）的HAE溶液處理后，細胞存活率分別為（98.2±0.8）%、（96.3±1.6）%、（96.0±2.4）%，表明HAE溶液對細胞沒有顯著性的損傷作用。因此，實驗中選用50～200 μg/mL的HAE用于后續(xù)抑制H2O2誘導V79-4細胞氧化損傷的實驗。

圖5 HAE對H2O2誘導V79-4細胞氧化損傷的保護作用Fig. 5 Protection of anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl against H2O2-induced oxidative damage in V79-4 cells

由圖5可知，損傷組細胞受到H2O2誘導的氧化損傷，部分細胞生長受阻或凋亡，細胞存活率下降至（51.6±2.1）%。經不同劑量（50、100、200 μg/mL）HAE溶液預處理后，各實驗組V79-4細胞存活率分別為（58.7±0.7）%、（68.2±1.2）%、（88.2±1.1）%。同H2O2損傷組相比，經不同劑量HAE樣品預處理，V79-4細胞對H2O2誘導的氧化損傷抵抗力逐漸增強，細胞存活率逐漸升高。

2.5 HAE對H2O2誘導V79-4細胞膜脂質過氧化的影響

TBARS是氧化的脂質生成的丙二醛及其他一些醛酮類物質與硫代巴比妥酸作用生成的有色化合物，該有色化合物在532 nm波長處有吸收。因此，可通過測定醛酮類物質的含量來評價脂質過氧化程度[28-29]。

圖6 HAE對H2O2誘導V79-4脂質過氧化的抑制作用Fig. 6 Inhibitory effect of anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl on H2O2-induced lipid peroxidation in V79-4 cells

由圖6可知，正常對照組的TBARS含量為（1.7±0.2）μmol/mg，H2O2損傷組的TBARS含量為（3.8±0.3）μmol/mg，表明H2O2可誘導V79-4細胞膜發(fā)生脂質過氧化反應。經不同劑量（50、100、200 μg/mL）HAE溶液處理后，各實驗組TBARS含量分別為（2.9±0.7）、（2.5±0.1）μmol/mg和（2.0±0.2）μmol/mg。同H2O2損傷組相比，預先加入50～200 μg/mL HAE可抑制H2O2誘導的細胞膜脂質過氧化，且呈劑量依賴性。

2.6 HAE對H2O2誘導V79-4細胞內ROS水平的影響

DCFH-DA進入細胞后，被水解生成二氯二氫熒光素，二氯二氫熒光素可與胞內的ROS反應生成具有熒光的二氯熒光素，故二氯熒光素熒光強度可反應細胞內ROS水平[30-31]。正常組細胞內ROS水平較低，熒光強度較弱，H2O2損傷組細胞內ROS水平顯著增加。由圖7可知，經不同劑量（50、100、200 μg/mL）HAE溶液處理后，實驗組V79-4細胞內ROS清除率分別為（40.2±1.7）%、（62.2±2.0）%、（82.4±1.2）%，且清除率隨劑量增加呈增高趨勢。

圖7 HAE對H2O2處理的V79-4細胞內ROS清除率的影響Fig. 7 Effect of anthocyanins extract from H. ciliolaris Kranzl on ROS levels in H2O2-induced V79-4 cells

3 結 論

本實驗中，采用pH示差法測得野陽合花色苷的含量為（81.38±1.45） mg矢車菊素-3-葡萄糖苷/100 g md；采用HPLC-MS分析，發(fā)現(xiàn)HAE中含有4 種花色苷，推測為矢車菊素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-（6”-香豆酰）葡萄糖苷、芍藥色素-3-葡萄糖苷和芍藥色素-3-（6”-香豆酰）葡萄糖苷。

體外自由基清除實驗結果表明，HAE具有良好的自由基清除能力，在實驗范圍內，隨著質量濃度增大，HAE清除ABTS+·和DPPH自由基的能力增強。HAE清除ABTS+·的IC50為（1.72±0.26）μg/mL，清除能力與VC相當；HAE清除DPPH自由基的IC50為（0.74±0.24）μg/mL，清除能力優(yōu)于VC。張楊等[32]報道藍莓果實含11 種花色苷，其清除ABTS+·和DPPH自由基能力均明顯優(yōu)于VC；Hao Jie等[33]報道黑米含9 種花色苷，其清除ABTS+·和DPPH自由基能力與VC相當。綜上，花色苷自由基清除能力不同，推測可能與花色苷的含量、羥基化程度、?；吞擒疹愋陀嘘P[6]。

選用H2O2誘導V79-4細胞建立氧化損傷模型，進一步對HAE抗氧化活性進行研究。實驗表明，經H2O2處理的V79-4細胞會發(fā)生顯著的氧化損傷及脂質過氧化。50～200 μg/mL的HAE對H2O2誘導V79-4細胞氧化損傷具有較為明顯的保護作用，明顯抑制細胞膜脂質過氧化，降低損傷后胞內ROS水平，且呈劑量依賴關系。羅春麗等[34]報道，100～800 μg/mL紫薯花青素對H2O2誘導的HepG2細胞損傷具有較為明顯的保護作用；徐麗萍等[35]報道，1～10 μmol/L藍莓花青素氯化錦葵色素可明顯降低細胞內ROS水平，保護血管內皮細胞免受損傷。本研究與以上文獻的實驗體系存在差異，不能定量分析活性強弱，但均在細胞水平上定性探究了花色苷的抗氧化活性，為深入研究花色苷如何調控細胞凋亡蛋白酶家族蛋白以及對超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等體內抗氧化酶活性的影響提供實驗數據和理論依據。

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