甄井龍，初曉麗，叢 莎，張 濤，遲曉星,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163000）

卵泡的發(fā)育及成熟是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，在此過(guò)程中，生物活性物質(zhì)對(duì)雄激素生成關(guān)鍵酶的影響是一個(gè)重要的方面。類(lèi)固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）是在膽固醇轉(zhuǎn)化類(lèi)固醇代謝中起到運(yùn)輸作用的一種重要蛋白，膽固醇在膽固醇側(cè)鏈裂解酶（side-chain cleavage enzyme，P450scc）的作用下合成孕烯醇酮，此步驟是類(lèi)固醇合成的限速步驟，而類(lèi)固醇激素在細(xì)胞色素P450芳香化酶（cytochrome P450 aromatase，CYP19）、細(xì)胞色素P450 17等相關(guān)酶的作用下合成雌二醇；因此，在合成途徑中任何酶的異常都可導(dǎo)致相應(yīng)激素合成障礙和合成激素的前體物質(zhì)積聚，造成性激素分泌紊亂[1-5]。

金雀異黃素（genistein，GEN）是大豆異黃酮的主要活性成分[6]，存在于富含豆肽的多種天然植物中，其分子結(jié)構(gòu)與人體自身雌激素相同。進(jìn)入人體后，GEN可完全與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮雌激素的作用，被認(rèn)為是雌激素的天然替代品[7-8]。GEN像其他的植物雌激素一樣，顯示出同雌激素受體更大的信號(hào)親和力，因此，GEN被認(rèn)為是人類(lèi)飲食中一種重要的環(huán)境雌激素[9-10]。本課題組已通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)GEN能調(diào)節(jié)青年雌性大鼠卵巢中激素水平，對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞中的相關(guān)蛋白和基因如bcl-2、bax、P450 mRNA等具有調(diào)節(jié)作用[11-13]。在此基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步研究GEN對(duì)青年雌性大鼠卵巢功能的調(diào)節(jié)作用和機(jī)制，選擇了影響卵泡發(fā)育過(guò)程的雄激素生成關(guān)鍵酶作為研究目標(biāo)，采用Western blot和實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)GEN對(duì)青年雌性大鼠卵巢組織中雄激素生成關(guān)鍵酶StAR、P450scc、CYP19蛋白及mRNA表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步探討GEN調(diào)節(jié)卵巢功能的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GEN（純度99.82%） 上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；己烯雌酚（純度99.4%） 西安天正藥用輔料有限公司；花生油 山東魯花集團(tuán)有限公司；基礎(chǔ)飼料配方：每100 g中含玉米面30.56 g、小麥粉27.27 g、魚(yú)粉（60%蛋白）10 g、粗小麥10 g、酪蛋白7 g、脫脂奶5 g、玉米蛋白（6%）3 g、維生素預(yù)混物0.05 g、氯化膽堿（60%活性）、玉米油2 g、酵母2 g（富含GEN和紫花苜蓿的成分由玉米、小麥和酪蛋白代替，以突出處理因素GEN對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響）。

蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑（苯甲基磺酰氟）上海碧云天生物技術(shù)有限公司；羊抗小鼠抗體、羊抗兔抗體 美國(guó)Cell Signaling公司；鼠抗β-肌動(dòng)蛋白抗體美國(guó)Sigma公司；電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）化學(xué)顯色液、SYBR Green PCR試劑盒、蛋白用BCA蛋白定量試劑盒、TRIzol試劑盒 美國(guó)賽默飛世爾公司；6×loading buffer 天根生化科技（北京）有限公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）美國(guó)Millipore公司；Ezna FFPE RNA 試劑盒 廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司；PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 加拿大Fermentas公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒 上海熠晨生物科技有限公司；蘇木精、伊紅 上海多烯生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

10×TBS緩沖液：Tris 24.2 g、NaCl 80.0 g，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.6，室溫保存；1×TBST緩沖液：10×TBS緩沖液100 mL、蒸餾水900 mL、吐溫20 1 mL。封閉液/抗體稀釋液（5%脫脂牛奶）：1×TBST緩沖液95～100 mL、脫脂奶粉5 g，溶解后4 ℃保存。

1.2 儀器與設(shè)備

TG-16M低溫冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；K30漩渦振蕩器 青浦滬西儀器廠；PRO200電動(dòng)勻漿機(jī) 德國(guó)弗魯克公司公司；Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì) 美國(guó)賽默飛世爾公司；ABI-7300實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)儀 美國(guó)ABI公司；5082酶標(biāo)儀 瑞士TECAN公司；垂直電泳儀 伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；TBST脫色搖床 其林貝爾儀器制造有限公司；ImageQuant LAS 4 000 mini超靈敏化學(xué)發(fā)光成像分析儀 美國(guó)通用電氣公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物與分組

2～3 月齡的雌性SD青年大鼠[14]40 只，體質(zhì)量為（200±20）g，許可證號(hào)：SCXK（黑）203-001。按照體質(zhì)量分為5 組，每組各8 只，分別為（灌胃體積1 mL）：陰性對(duì)照組（NC）：花生油灌胃；GEN低劑量組（L）：GEN 15 mg/kg灌胃；GEN中劑量組（M）：GEN 30 mg/kg灌胃；GEN高劑量組（H）：GEN 60 mg/kg灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組（PC）：己烯雌酚0.5 mg/kg灌胃。每天給予14 h的周期性光照，動(dòng)物室溫度（20±2）℃，相對(duì)濕度（45±10）%。劑量組給予GEN連續(xù)灌胃30 d。

1.3.2 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

給藥30 d后，對(duì)所有大鼠進(jìn)行陰道涂片觀察，挑選出處于動(dòng)情間期的大鼠，禁食不禁水12 h后，采用乙醚麻醉并腹主動(dòng)脈取血，采集卵巢液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)卵巢組織中StAR、P450scc、CYP19 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

按Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系（25 μL）：RNA-Primer Mix 12 μL、5×RT Reaction Buffer 5 μL、25 mmol/L dNTPs 1 μL、25 U/μL RNase Inhibitor 1 μL、200 U/μL M-MLV RTase 1 μL、Oligo(dT)18 1 μL、ddH2O（DNase-free）4 μL。反應(yīng)程序：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min；置于-20 ℃保存。使用NCBI 引物設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增引物，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，具體見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)熒光PCR體系（25 μL）：cDNA模板 2 μL、SYBR Green Mix 12.5 μL、上游引物F 0.5 μL、下游引物R 0.5 μL、ddH2O：9.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，循環(huán)40 次；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s。

分析各基因的Ct值，計(jì)算標(biāo)化后的-△△Ct值。采用2-△△Ct法對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行評(píng)估[6-7]。每個(gè)基因重復(fù)3 次，最后取平均值。數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR引物Table 1 Primers used for real-time PCR

1.3.4 Western blot檢測(cè)卵巢組織內(nèi)StAR、P450scc蛋白相對(duì)表達(dá)量

稱(chēng)取30 mg卵巢組織，每個(gè)樣本加入500 μL蛋白裂解液和5 μL蛋白酶抑制劑（苯甲基磺酰氟），60 Hz勻漿90 s，置于冰上15 min，最后將裂解液轉(zhuǎn)移至新離心管中，14 000×g離心10 min，取上清液。

蛋白變性：用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，酶標(biāo)儀測(cè)定光密度，取等量蛋白加入6×loading buffer，100 ℃孵育10 min。

電泳：利用垂直電泳儀進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白處于濃縮膠時(shí)電壓設(shè)置為80 V，蛋白進(jìn)入分離膠之后電壓120 V，電泳1 h。

轉(zhuǎn)膜：將凝膠玻璃板置于盛有電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的容器中，浸泡15～20 min，裁剪好濾紙（Whatman 3 mm CHR）和PVDF膜，濾紙和膜規(guī)格為83 mm×75 mm，盡量避免污染濾紙和膜，將裁剪好的濾紙和膜浸泡于電泳轉(zhuǎn)移緩沖液中，驅(qū)除留于膜上的氣泡。打開(kāi)轉(zhuǎn)移盒并放置于淺盤(pán)中，用轉(zhuǎn)移緩沖液將海綿墊完全浸透后將其放在轉(zhuǎn)移盒壁上，海綿上再放置一張浸濕的Whatman 3 mm濾紙。小心將凝膠放置于濾紙上，避免氣泡。用去離子水清洗緩沖液槽，在緩沖液槽中放入攪拌子，將另一塊海綿用轉(zhuǎn)移緩沖液浸透后放在凝膠-膜“三明治”上，關(guān)上轉(zhuǎn)移盒并插入轉(zhuǎn)移槽。將冰盒裝入緩沖液槽，注滿4 ℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液。350 mA恒流轉(zhuǎn)膜75 min。電轉(zhuǎn)完畢后，將PVDF膜置于5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的脫脂奶粉（TBST配制）中37 ℃封閉2 h。

一抗孵育：封閉結(jié)束之后，TBST清洗PVDF膜3 遍，分別加入以下一抗4 ℃孵育過(guò)夜：P450scc（1∶1 000，羊抗小鼠抗體）；StAR（1∶1 000，羊抗兔抗體）；β-actin（1∶5 000，羊抗小鼠抗體）。

二抗孵育：一抗孵育結(jié)束后，用TBST洗3 遍，抗鼠/抗兔（1∶2 000）二抗室溫孵育2 h，TBST脫色搖床清洗3 遍。

免疫檢測(cè)：PVDF膜上均勻滴加ECL化學(xué)顯色液，發(fā)光強(qiáng)度用化學(xué)發(fā)光成像檢測(cè)儀檢測(cè)拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0、GraphPad Prism 5.0、Quantity One處理分析，結(jié)果以表示，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)期間雌鼠體質(zhì)量變化

表2 雌鼠體質(zhì)量變化（n＝8）Table 2 Body mass changes of female rats (n= 8)g

表2結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)期間雌鼠的體質(zhì)量與NC組比較沒(méi)有明顯變化（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果與本課題組前期研究中GEN作用于雌鼠體質(zhì)量結(jié)果一致。

2.2 卵巢組織中StAR、P450scc、CYP19 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖1β-actin（a）、StAR（b）、P450scc（c）與CYP19（d）基因?qū)崟r(shí)熒光PCR產(chǎn)物的溶解曲線Fig. 1 Melting curves of real-time PCR products of β-actin (a), StAR (b),P450scc (c) and CYP19 (d) genes

圖2 各組大鼠卵巢組織中StAR（a）、P450scc（b）、CYP19（c）mRNA的相對(duì)表達(dá)量（n＝ 8）Fig. 2 Relative expression levels of StAR (a), P450scc (b) and CYP19 (c) mRNA in rat ovaries（n = 8）

圖2結(jié)果顯示，與NC組比較，各劑量組StAR、P450scc、CYP19 mRNA表達(dá)水平均升高，尤其以GEN的M組（mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.731±1.348、2.691±1.229、3.348±1.715）、GEN H組（mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.410±0.864、3.198±0.859、3.153±1.284）升高明顯，均有顯著性差異（P＜0.05），與PC組效果相似。在GEN的作用下，卵巢內(nèi)起到運(yùn)轉(zhuǎn)作用的StAR mRNA相對(duì)表達(dá)量增加，同時(shí)P450scc mRNA相對(duì)表達(dá)量也顯著提高，作用于下游產(chǎn)物的酶基因CYP19 mRNA相對(duì)表達(dá)量也得到了提高，此過(guò)程沒(méi)有雌雄激素生成相關(guān)基因的異常表達(dá)，推測(cè)GEN可能通過(guò)影響mRNA的表達(dá)來(lái)影響激素合成。

2.3 大鼠卵巢StAR與P450scc蛋白表達(dá)情況

圖1a～d溶解曲線中顯示均僅有一個(gè)特異性峰，引物特異性較好，溶解溫度分別為90、86、86、86 ℃。

圖3 各組雌鼠卵巢StAR、P450scc蛋白灰度檢測(cè)結(jié)果（n＝8）Fig. 3 Relative expression levels of StAR and P450scc proteins in rat ovaries (n = 8)

由圖3可見(jiàn)，各組大鼠卵巢中StAR、P450scc蛋白的相對(duì)表達(dá)量均高于NC組，GEN H組StAR蛋白相對(duì)表達(dá)量（1.024±0.070）增加明顯（P＜0.05）；GEN M組（0.608±0.033）和H組（0.953±0.053）的P450scc蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，與NC組相比差異顯著（P＜0.05）。Western blot蛋白檢測(cè)結(jié)果與mRNA表達(dá)相一致，表明GEN可以通過(guò)影響雄激素生成的關(guān)鍵酶基因及蛋白的表達(dá)來(lái)影響其生成。

3 討 論

類(lèi)固醇激素是在腎上腺、卵巢、睪丸、胎盤(pán)、腦和皮膚的類(lèi)固醇生成細(xì)胞中合成的一類(lèi)重要的調(diào)節(jié)分子，并影響一系列發(fā)育和生理過(guò)程。StAR主要介導(dǎo)類(lèi)固醇生物合成中的限速步驟，即將所有類(lèi)固醇激素、膽固醇的底物從外部線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)部線粒體膜[15]。在內(nèi)膜，細(xì)胞色素P450scc切割膽固醇側(cè)鏈以形成第一類(lèi)固醇——孕烯醇酮，其通過(guò)一系列酶轉(zhuǎn)化成特定組織中的各種類(lèi)固醇激素。維持正常的生殖發(fā)育、功能以及身體內(nèi)穩(wěn)態(tài)取決于類(lèi)固醇激素。睪酮P450scc在哺乳動(dòng)物的卵巢、睪丸等組織中的線粒體內(nèi)有合成，是唯一將膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮的酶。孕烯醇酮是合成黃體酮的重要中間體，在細(xì)胞色素P450 17α羥化酶、CYP19作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榇贫糩16-21]。研究表明，在兔、羊、牛的體內(nèi)黃體中的StAR mRNA的表達(dá)水平與孕酮的變化在短時(shí)間內(nèi)是一致的[22-24]。由先天缺陷或?qū)嶒?yàn)誘導(dǎo)方法敲除線粒體內(nèi)類(lèi)固醇激素合成急性調(diào)控蛋白（即StAR和P450c17）導(dǎo)致的雌性胎仔雄激素合成不足，會(huì)明顯的導(dǎo)致卵巢功能障礙，且雄激素不足會(huì)持續(xù)到出生以后。雄激素基因的過(guò)多表達(dá)在人卵巢顆粒細(xì)胞中的影響尚未明確，在睪酮刺激后的卵巢顆粒細(xì)胞中的StAR的表達(dá)是不穩(wěn)定的，呈現(xiàn)波動(dòng)狀態(tài)[25]。

GEN可以抑制新生鼠卵母細(xì)胞巢的破裂、抑制卵母細(xì)胞凋亡，但對(duì)成年和早期老年大鼠卵巢的作用尚不清楚。相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示[26-28]，GEN對(duì)處于生育期大、小鼠的干預(yù)可能會(huì)導(dǎo)致生育能力降低，甚至造成不育或不孕。綜上所述，有關(guān)GEN對(duì)于青年雌鼠卵巢的作用機(jī)制尚不明確，研究結(jié)果也不盡相同。本研究顯示，15 mg/（kg·d）低劑量的GEN對(duì)青年雌性大鼠卵巢組織中StAR、P450scc、CYP19 mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響；給予30～60 mg/kg的GEN干預(yù)后，各組大鼠卵巢StAR、P450scc、CYP19 mRNA的表達(dá)水平增高，StAR、P450scc蛋白水平也顯著增加，說(shuō)明GEN可增加雄激素生成關(guān)鍵酶的水平，促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化為雄激素，進(jìn)而間接提升青年雌性大鼠體內(nèi)的雌二醇含量，其意義在于補(bǔ)充體內(nèi)雌激素缺少的作用：雌二醇可直接作用于卵巢，刺激卵泡發(fā)育；也可促進(jìn)或抑制促性腺激素的釋放，從而間接影響卵巢功能。而StAR、P450scc的轉(zhuǎn)錄還受鄰苯二甲酸二乙基己基酯、生長(zhǎng)因子、前列腺素、甲狀腺素、類(lèi)固醇等[29-30]多種因素的調(diào)節(jié)，后面的研究中可以考慮對(duì)處于國(guó)內(nèi)外熱門(mén)研究、對(duì)生長(zhǎng)分化及發(fā)育中起重要作用的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1及早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1進(jìn)行研究[31-36]。對(duì)于更加深入的醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)的研究可基于組學(xué)的方法，例如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等方法進(jìn)行研究，有助于更好地理解芳香化和非芳香化雄激素如何調(diào)節(jié)卵巢功能，進(jìn)一步明確GEN對(duì)卵巢功能作用的機(jī)制。

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