范倪 陸玉秀 唐艷萍 李科志 何盼 曹驥 陸玉雷 林有智 楊春

機體感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）后可表現(xiàn)為急、慢性肝炎、肝硬化，甚至肝癌，據(jù)統(tǒng)計慢性乙型肝炎感染患者中約15%以上最終發(fā)展為肝癌［1］。本課題組前期建立了實驗室人工繁育樹鼩的基本方法，用培育的圍生期樹鼩接種HBV，逐步證實HBV能在樹鼩體內(nèi)復(fù)制，部分形成慢性HBV感染狀態(tài)并逐步發(fā)生類似人類慢性乙型肝炎的病理改變［2］，對多個可影響樹鼩體內(nèi)感染HBV效率的因素［3］進(jìn)行實驗篩選、優(yōu)化。Toll樣受體（toll-like receptor，TLRs）是重要的天然免疫受體［4］，在機體天然免疫反應(yīng)及誘發(fā)獲得性免疫反應(yīng)中起重要作用。TLR-4是最早發(fā)現(xiàn)能直接介導(dǎo)機體與病原反應(yīng)的Toll樣受體［5］，與其配體結(jié)合后可激活信號傳導(dǎo)途徑，引發(fā)炎性因子IL-6、IL-8、IL-10等釋放，與慢性乙型肝炎發(fā)生密切相關(guān)［6］。也有研究發(fā)現(xiàn)TLR-4基因突變或基因多態(tài)性與肝癌發(fā)生或惡性程度密切相關(guān)［7］。本實驗通過研究新生期樹鼩HBV感染模型體內(nèi)TLR-4及其相關(guān)因子IL-6的動態(tài)變化，初步探討慢性HBV的致病機制。

1 材料與方法

1.1 感染血源的選擇

選用經(jīng)檢測HBsAg、HBeAg和HBcAb 3項指標(biāo)均陽性，HBV-DNA 拷貝數(shù)為 7.53×107copies/mL（HBV基因亞型為C型）的慢性乙型肝炎患者的血清作為感染血源，分離血清，分裝后置-80℃保存。

1.2 主要試劑與儀器

TLR-4、IL-6 ELISA檢測試劑盒均購自深圳雅安達(dá)科技生物有限公司；PCR引物購自上海生物工程有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自TAKARA寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒購自天根生物科技有限公司；Trizol試劑購自Life生物公司；HBsAg檢測試劑盒購自中山生物工程有限公司；HBV-DNA檢測試劑盒購自中山達(dá)安生物技術(shù)有限公司。PCR分析儀（LightCycler480型Ⅱ）購自瑞士Roche公司。

1.3 動物來源

本研究所涉及動物實驗均嚴(yán)格遵循動物保護(hù)法進(jìn)行。實驗所用的31只新生樹鼩（其中雌性16只、雄性15只）均為本實驗室用成年樹鼩（購自昆明動物研究所）雄雌合籠，自然受孕所產(chǎn)出的幼仔（約150 g）。將31只健康新生樹鼩分為實驗組（n=25）和對照組（n=6），實驗組樹鼩分別于出生第1天、第3天經(jīng)雙側(cè)大腿皮下接種300 μL HBV病毒液；對照組不做任何處理。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫25～28℃，濕度60%～80%，每日清潔2 次［8］。

1.4 標(biāo)本采集

血清采集為接種后分別于第8周、第12周、第16周、第20周、第24周經(jīng)樹鼩股靜脈抽血，采血0.8～1.0 mL，室溫下靜置2～3h后分離血清，4℃、4000 r/min離心15 min，置于凍存管，-80℃保存。肝組織采集為接種后第12周開始，每間隔3～6個月定期對樹鼩行麻醉后肝活檢術(shù)，術(shù)前經(jīng)臀大肌注射氯胺酮（濃度0.1 mL/100g）和腹腔皮下注射0.1%戊巴比妥鈉（濃度0.3 mL/100g）全身麻醉后，剖腹切取肝組織約100 mg，一半置于液氮中速凍，1 h后轉(zhuǎn)-80℃凍存，用于提取DNA與RNA進(jìn)行分子生物學(xué)檢測；另一半置入10%中性福爾馬林液固定，用于病理組織學(xué)檢查。

1.5 樹鼩血清HBsAg和HBV-DNA病毒載量檢測

1.5.1 酶聯(lián)吸附反應(yīng)（ELISA）檢測樹鼩血清HbsAg

-80℃冰箱取出血清，平衡至室溫后設(shè)置樣本陰性、陽性、空白對照孔，依次加入各樣本血清及各對照血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟進(jìn)行，用酶標(biāo)儀450 mm測取各孔吸光度，根據(jù)公式Cut-off值=2.1×陰性對照的均值（N）計算臨界值，判斷HbsAg陽性動物。

1.5.2 RT-PCR熒光探針法檢測樹鼩血清HBV-DNA病毒載量 提取血清DNA，向HBV反應(yīng)管中各加入待檢測DNA樣本、HBV陽性質(zhì)控品、HBV陰性質(zhì)控品及陽性定量參考品，上機，PCR反應(yīng)程序條件：93℃反應(yīng)2 min，93℃保溫45 s，55℃ 60 s，共10個循環(huán)；93℃30 s到55℃45 s退火，共30個循環(huán)。RCR分析儀計算HBV-DNA定量值。操作步驟嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

根據(jù)血清HBsAg和HBV-DNA病毒載量將實驗組分為慢性感染組（血清HBsAg或HBV-DNA持續(xù)陽性時間達(dá)24周）和疑似慢性感染組（血清HBsAg或HBV-DNA不連續(xù)出現(xiàn)2次或2次以上陽性）。

1.6 雙抗體夾心法檢測樹鼩外周血TLR-4、IL-6蛋白表達(dá)水平

-80℃冰箱取出血清，平衡至室溫后，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本反應(yīng)孔，加樣后嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。在酶標(biāo)儀450 mm波長測量各孔吸光度；計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計算對應(yīng)樣品濃度，以pg/mL為單位。嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.7 RT-PCR法檢測樹鼩肝組織TLR-4、IL-6 mRNA的表達(dá)水平

-80℃冰箱取出冰凍肝組織，Trizol提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模版，進(jìn)行 RT-PCR，采用 2-△△Ct法計算肝組織中 TLR-4、IL-6 mRNA的相對表達(dá)量。引物序列信息見表1。PCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq II（2×）10 μL，PCR上、下游引物（10 μM）各 0.4 μL，DNA 模板 2.0 μL，ddH2O 6.2 μL，總反應(yīng)體系 20 μL。兩步法 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火34 s，共40個循環(huán)，95℃延伸15 s。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，若整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步的兩兩比較使用LSD檢驗。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樹鼩血清HBsAg和HBV DNA病毒載量檢測結(jié)果

在第8～24周觀察周期內(nèi)，實驗組25只接種樹鼩HBsAg和（或）HBV-DNA均陽性12只，其中慢性感染組7只，疑似慢性感染組5只，HbsAg和HBV-DNA均陰性13只（不納入研究）。對照組血清HBsAg和HBV-DNA均陰性。

2.2 雙抗體夾心法檢測樹鼩外周血TLR-4、IL-6蛋白表達(dá)水平

在第8周、第12周、第16周、第20周、第24周，慢性感染組與疑似慢性感染組樹鼩外周血TLR-4蛋白表達(dá)水平均高于對照組（P＜0.05），但慢性感染組與疑似慢性感染組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；慢性感染組與疑似慢性感染組樹鼩外周血IL-6蛋白表達(dá)水平均高于對照組（P＜0.05），慢性感染組與疑似慢性感染組第8周、第12周、第16周IL-6蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在第20周、第24周差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 RT-PCR法檢測樹鼩肝組織TLR-4、IL-6 mRNA的表達(dá)水平

第12周，疑似慢性感染組與慢性感染組IL-6 mRNA表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；慢性感染組TLR-4 mRNA表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表1 引物序列信息

表2 3 組樹鼩外周血 TLR-4、IL-6 蛋白水平的比較［（x±s），ng/mL］

表3 3組樹鼩肝組織中IL-6及TLR-4 mRNA表達(dá)水平的比較（x±s）

3 討論

HBV感染是我國肝癌發(fā)生的主要因素，多數(shù)肝癌發(fā)生與慢性HBV關(guān)系密切，特別是與乙型肝炎病毒復(fù)制密切相關(guān)，而機體抗HBV病毒侵?jǐn)_主要通過感染早期先天免疫反應(yīng)和后期病毒持續(xù)感染導(dǎo)致的特異免疫反應(yīng)。宿主感染HBV的病程變化及不同轉(zhuǎn)歸，取決于機體對病毒免疫應(yīng)答的強弱。HBV的清除應(yīng)答包括強效的先天免疫和后天獲得性細(xì)胞應(yīng)答，不同感染狀態(tài)可能在病毒清除過程中有不同影響［9］。HBV與先天、后天免疫之間的關(guān)系決定感染的結(jié)局［10］。

TLR-4是一類病原分子識別受體，與其配體結(jié)合后可被激活，活化信號通路，最終進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動核內(nèi)相關(guān)基因，轉(zhuǎn)導(dǎo)出相應(yīng)的mRNA，合成并釋放IL-6、IL-8、TNF、IFN等細(xì)胞因子，引起毛細(xì)血管通透性增高、淋巴細(xì)胞浸潤等炎癥反應(yīng)，發(fā)揮早期免疫應(yīng)答效應(yīng)。此外，TLR-4活化可誘導(dǎo)表達(dá)協(xié)同刺激信號，目前已有證據(jù)表明巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上的協(xié)同刺激分子 B7（CD86/CD80）出現(xiàn)可能與此有關(guān)［11］。IL-6 來源于單核巨噬細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞等，為體內(nèi)重要的致炎性細(xì)胞因子。當(dāng)HBV感染發(fā)生后，血清IL-6含量明顯升高，這與肝細(xì)胞受損，產(chǎn)生大量抗原免疫應(yīng)答反應(yīng)，使單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等被激活后分泌IL-6，可調(diào)節(jié)多種急性期反應(yīng)蛋白合成有關(guān)［12］。此外有研究［13］發(fā)現(xiàn)，在肝癌組織中TLR-4表達(dá)與NF-κB表達(dá)呈正相關(guān)，其下游炎性因子IL-6的表達(dá)量亦升高，說明TLR-4/NF-κB/IL-6通路激活可能促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展。

根據(jù)2015年《乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》［14］，慢性乙型肝炎癥狀持續(xù)半年以上可診斷為慢性乙型肝炎感染。本研究接種的25只樹鼩，其中HBV-DNA或HBsAg出現(xiàn)2次或以上陽性12只，其中HBV-DNA和（或）HBsAg能持續(xù)24周陽性，形成慢性感染7只；另5只疑似慢性感染不連續(xù)出現(xiàn)HBV-DNA或HBsAg陽性。檢測發(fā)現(xiàn)疑似慢性感染組與慢性感染組新生樹鼩血清TLR-4、IL-6分泌水平高于對照組，表明人HBV能在新生樹鼩體內(nèi)成功感染，激活樹鼩體內(nèi)的免疫應(yīng)答。其中，樹鼩血清中TLR-4和IL-6的表達(dá)量在疑似慢性感染組與慢性感染組中均較對照組明顯升高，但是疑似慢性感染組與慢性感染組間的表達(dá)量大部分時間無明顯差異?？梢奣LR-4、IL-6在HBV感染過程中均升高，與人乙型肝炎感染者的血清TLR-4、IL-6表達(dá)水平一致。本研究發(fā)現(xiàn)TLR-4與IL-6在血清中的分泌量，疑似感染組隨時間呈進(jìn)行性下降趨勢，而慢性感染組保持相對恒定高水平分泌，可能是疑似慢性感染組樹鼩呈一過性感染表現(xiàn)，機體通過體內(nèi)免疫反應(yīng)，引起被感染細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)機體的適應(yīng)性免疫，最終清除感染病毒［15］。

進(jìn)一步采用RT-PCR法檢測3組樹鼩肝組織中TLR-4及IL-6 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)疑似慢性感染組與慢性感染組樹鼩實驗第12周肝組織中TLR-4、IL-6 mRNA表達(dá)量高于對照組，說明樹鼩感染HBV后肝組織中TLR-4、IL-6持續(xù)升高，再次驗證TLR-4、IL-6在HBV感染過程中可能起重要作用。

本實驗表明，新生樹鼩感染HBV可觀察到與人感染HBV相似的免疫變化過程，說明樹鼩在感染人HBV后可產(chǎn)生與人類相似免疫應(yīng)答過程，給應(yīng)用樹鼩感染HBV模型研究人乙型肝炎的致病機制提供新思路。同時檢測TLR-4與IL-6可能有助于了解HBV患者機體的免疫情況，對臨床判斷病情進(jìn)展程度有一定意義。此外，由于HBV持續(xù)復(fù)制可能導(dǎo)致肝癌發(fā)病率升高，在HBV感染早期階段采用TLR-4激動劑，抑制HBV復(fù)制從而減輕肝臟損傷可能有助于預(yù)防肝癌的發(fā)生。

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