王詠枝 屈會化 邢洪霞 張越 成金俊 熊威 羅娟 趙琰 孔慧 王慶國

摘要：目的 合成大黃酸人工抗原，制備敏感性高、特異性強的大黃酸兔源多克隆抗血清。方法 采用碳二亞胺法制備大黃酸人工抗原，將大黃酸分別與牛血清白蛋白和卵清蛋白相偶聯(lián)。用紫外掃描法鑒定大黃酸人工抗原是否偶聯(lián)成功，免疫新西蘭兔，制備多抗血清，通過間接競爭ELISA測定抗血清效價，通過間接競爭ELISA鑒定抗血清的敏感性和特異性，并分別用間接競爭ELISA和HPLC檢測大黃中大黃酸的含量。結果 2只新西蘭兔產生的多抗血清效價在1∶64 000以上，其中，2號兔多抗血清敏感性最好，半數(shù)抑制濃度為0.09 ng/mL，且具有良好的特異性。兔抗血清測得大黃中大黃酸含量為（0.026±0.001）%，HPLC測得大黃中大黃酸含量為（0.027±0.000）%。結論 本研究制備了敏感性高、特異性強的大黃酸兔源多克隆抗體血清，為建立大黃酸免疫親和色譜分析技術和快速檢測方法奠定了基礎。

關鍵詞：大黃酸；人工抗原；碳二亞胺法；兔源多抗血清；酶聯(lián)免疫分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.010

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）05-0041-05

Preparation and Identification of Rhein Rabbit Polyclonal Antiserum

WANG Yong-zhi1， QU Hui-hua2， XING Hong-xia3， ZHANG Yue1， CHENG Jin-jun4，

XIONG Wei1， LUO Juan1， ZHAO Yan4， KONG Hui4， WANG Qing-guo4

1. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2. Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 3. Qufu Traditional Chinese Medicine Hospital， Qufu 273100， China；

4. School of Traditional Chinese Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China

Abstract： Objective To synthesize rhein （RHE） artificial antigens； To prepare high sensitivity and specificity polyclonal antiserum against RHE. Methods RHE was coupled respectively to bovine serum albumin （BSA） and ovalbumin （OVA） by using carbodimide two-step method. The RHE artificial antigen was identified by UV spectrophotometry， then it was injected to rabbits for antiserum preparation. Anti-serum titer was determined by indirect ELISA. Sensitivity and specificity were identified by indirect competitive ELISA. And the contents of RHE of Rhei Radix et Rhizoma were detected by indirect competitive ELISA and HPLC. Results Indirect ELISA showed a high titer above 1∶64 000. The sensibility of No.2 antiserum was better， which IC50 was 0.09 ng/mL and had good specificity. The content of RHE in Rhei Radix et Rhizoma was （0.026±0.001）% detected by rabbit polyclonal antiserum， and the content of RHE was （0.027±0.000）% detected by HPLC. Conclusion In this study， RHE artificial antigens is synthesized successfully. RHE rabbit polyclonal antiserum with high sensitivity and specificity is prepared， and these may provide basis for the immune affinity chromatography analysis technology and immunology fast detection methods.

Keywords： rhein； artificial antigen； carbodiimide two-step method； rabbit polyclonal antiserum； ELISA

基金項目：國家自然科學基金重點項目（81430102）

通訊作者：王慶國，E-mail：wangqg5858@sina.com

大黃酸（rhein，RHE）屬單蒽核類1，8-二羥基蒽醌衍生物，是大黃、虎杖、何首烏等多種中藥的主要有效成分[1]，也是大黃藥材的質控指標之一?，F(xiàn)代藥理研究表明，大黃酸具有抗腫瘤[2]、抗菌[3]、抗炎[4]、降糖調脂[5]、保肝抗纖維化[6]等多種活性，在治療糖尿病腎病及協(xié)同抗腫瘤方面表現(xiàn)尤其突出[7]。目前大黃酸常用檢測方法為HPLC[8-9]，此方法依賴高精密儀器，分析成本高；樣品前處理復雜，要求專業(yè)的分析人員，耗時長；不適宜現(xiàn)場檢測和大樣本檢測。而基于小分子多克隆抗體的中藥活性成分免疫學分析方法（ELISA）靈敏度高，特異性強，前處理簡單，高通量，且不依賴貴重儀器，操作也較為簡便[10-11]。RHE免疫分析方法的建立需要得到抗RHE的抗體。本研究對RHE的人工完全抗原進行了合成與鑒定，免疫動物新西蘭大白兔獲得了特異性強、靈敏度高的兔源多克隆抗體。

1 實驗材料

1.1 動物

雌性新西蘭大白兔2只，體質量2.5 kg，8周齡，斯貝福（北京）生物技術有限公司中心，動物許可證號SCXK（京）2015-0005。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學實驗動物研究中心，溫度15～25 ℃，相對濕度55%～65%，光照12 h，自由攝食飲水。

1.2 主要試劑與儀器

RHE，南京澤朗有限公司；大黃飲片，北京仟草有限公司；甲醇（色譜純，F(xiàn)isher），雙蒸水（娃哈哈）；N-羥基琥珀酸亞胺（NHS），Biotopped；脫脂奶粉，Oxoid公司；卵蛋白（OVA），Sigma公司；水溶性碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），北京化學試劑廠；牛血清白蛋白（BSA），Sigma公司；弗式完全佐劑（F5881），Sigma公司；弗式不完全佐劑（F5506），Sigma公司；酶標二抗（HRP-標記羊抗兔IgG），Gene-Script公司；四甲基聯(lián)苯胺（TMB），Sigma公司；二甲基甲酰胺（DMF），Sigma公司?？烧{微量系列加樣器，Eppendorf；SZ-93自動純水蒸餾器，Labsystems；BS124S電子分析天平，賽多利斯公司；高效液相色譜儀，Agilent Technologies 1260 Infinity；QL-901漩渦混合器，其林貝爾儀器制造有限公司；84-1A磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；紫外-可見分光光度計，Beckman coulter DU 800；10 kD超濾管，Sigma 公司；UV-265FW分光光度計，日本島津；Millipore 純水系統(tǒng)，Millipore，USA；96孔酶標板，Corning；酶標儀，Tecan Safire2全波長多功能酶標儀；TGL-16G臺式高速冷凍離心機，北京醫(yī)用離心機廠。

2 實驗方法

2.1 大黃酸完全抗原的合成方法

根據本實驗室人工抗原合成方法[12-14]，采用碳二亞胺兩步法，將RHE分別與BSA、OVA偶聯(lián)制備人工抗原與包被抗原。具體方法：準確稱取BSA 100 mg，溶于2 mL碳酸鹽緩沖液（pH 9.6），為A液；稱取RHE 100 mg，溶于14 mL碳酸鹽緩沖液，另外稱取EDC 76 mg和NHS 38 mg分別溶于1 mL碳酸鹽緩沖液，加入以上配好的RHE溶液中，滴加DMF 2 mL，室溫磁力攪拌2 h，為B液。將A液緩慢滴加到B液中，邊滴邊搖，密封且用錫箔紙包裹避光，室溫攪拌連續(xù)反應6 h，用10 kD超濾管超濾，碳酸鹽緩沖液清洗3次，獲得RHE-BSA。以相同方法獲得RHE-OVA。

2.2 大黃酸完全抗原的鑒定

2.2.1 紫外掃描法

用PBS精確配制適宜濃度的RHE與BSA標準溶液，然后將待檢樣品按1∶10濃度稀釋，用紫外分光光度計測出RHE（a）、BSA（b）、RHE-BSA（c）的全波長圖譜，計算RHE-BSA的偶聯(lián)比。同法計算RHE-OVA的偶聯(lián)比。

2.2.2 動物免疫

用RHE-BSA免疫原經頸部皮下多點注射免疫2只雌性新西蘭兔。首次免疫予弗氏完全佐劑充分混勻乳化，免疫劑量以RHE計1 mg/只。以后每間隔2周加強免疫1次，改用弗氏不完全佐劑乳化抗原，免疫劑量相同。第4次免疫后，耳緣靜脈取血，4 ℃靜置12 h，5000 r/min離心10 min分離血清，分別編號為1#、2#[14]。

2.2.3 抗體效價測定

RHE-OVA作為包被原，采用間接競爭ELISA測定RHE抗血清的效價。包被抗原RHE-OVA用CBS按1∶10 000稀釋，加入100 μL/孔，37 ℃孵育2 h，PBST洗板，每次5 min，共3次。5%脫脂奶粉100 μL/孔封閉，37 ℃封閉1 h，PBST洗板3次。加樣100 μL/孔，抗血清的初始稀釋倍數(shù)為2000倍，以2倍為稀釋梯度逐級稀釋。以空白血清作為陰性對照。37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次，再加入100 μL/孔HRP-羊抗兔二抗（1∶10 000），37 ℃反應1 h。PBST洗板3次，加入顯色液100 μL/孔，37 ℃顯色15 min，每孔加2 mmol/L硫酸50 μL終止反應。測OD450 nm吸光度。以同一稀釋倍數(shù)抗血清（P）與陰性血清（N）OD450 nm比值（P/N）>2.1時血清的最大稀釋度為抗體效價[15]。

2.2.4 抗體敏感性測定

間接競爭ELISA實驗步驟與間接ELISA測定方法大體相同，不同處在于第1步加入多抗血清50 μL（1∶2000稀釋）和不同濃度RHE溶液50 μL作為競爭物，其余操作步驟相同。以RHE質量濃度的對數(shù)值為橫坐標，以抑制率A/A0（A0為RHE質量濃度為0時的吸光度，A為RHE不同質量濃度的吸光度）為縱坐標，繪制多抗血清對RHE的抑制曲線，根據曲線回歸方程，計算多抗血清對RHE的半數(shù)抑制濃度（IC50），評價RHE抗血清的敏感性。

2.2.5 抗體特異性測定

選擇與RHE具有醌類母核或羧基等類似結構的化合物，通過間接競爭ELISA測定多抗血清對不同競爭物的IC50值。以多抗血清對RHE的IC50與多抗血清對競爭物的IC50比值作為交叉反應率（CR）[16]，并以CR反映多抗血清的特異性。

2.3 大黃酸含量測定

2.3.1 HPLC測定

準確稱取大黃酸標準品0.10 mg，用甲醇配制50 μg/mL標準品溶液2 mL。取大黃飲片粉碎，稱取大黃粉末1.00 g，加30 mL甲醇超聲30 min，過濾，重復2次，合并濾液，濃縮，甲醇定容至成10 mL，即為大黃供試品溶液。參考2015年版《中華人民共和國藥典》（一部），選用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相為甲醇- 0.1%磷酸溶液（85∶15），檢測波長 254 nm，進樣量10 μL。取標準品溶液1 mL，以甲醇配成50、45、35、30、25、20、15、10 μg/mL 8個濃度，繪制標準曲線，供試品用甲醇稀釋10倍，作為待測樣品，平行測定3次。

2.3.2 間接競爭ELISA測定

取上述HPLC大黃供試品溶液100 μL，以PBS稀釋1000倍作為間接競爭ELISA檢測的供試品溶液，按照“2.2.4”項下方法測定，平行測定3次。

3 結果

3.1 RHE-BSA偶聯(lián)比

紫外-可見分光光度計掃描結果可以看出，加入RHE-BSA結合物的PBS中，RHE吸收峰在437 nm波長處，BSA的最大吸收為Kmax=277 nm，RHE-BSA結合物紫外光譜明顯具有RHE和BSA蛋白疊加的特征，并且相同BSA質量濃度的結合物和標準蛋白BSA的紫外光譜相比，在277 nm波長處吸光度明顯增高。由于偶聯(lián)產物經透析袋充分透析后，排除未結合BSA的RHE小分子，而BSA屬于大分子被截留在透析袋內，故吸光度增加推測其原因是RHE與BSA結合所致。經計算RHE-BSA偶聯(lián)比約為17∶1，在文獻推薦范圍（5∶1～20∶1）[15]內。結果見表1、圖1。

圖1 RHE-BSA全波長紫外掃描圖

3.2 抗體效價

間接ELISA實驗結果表明，2只新西蘭兔均有特異性抗體產生，P/N≥2.1時，效價均在1∶64 000以上，見圖2。

圖2 間接ELISA法測定血清效價

3.3 敏感性測定結果

間接競爭ELISA測定RHE多抗血清抑制效價的結果見圖3?？芍?只新西蘭兔所產生的多抗血清均對RHE有很好的抑制效果，線性回歸方程為Y=-0.205 4X+0.288 6，R2=0.983 8，IC50為0.09 ng/mL，表示2號兔的多抗血清對RHE具有很高的敏感性。

圖3 2號兔多抗血清對RHE的間接競爭ELISA抑制曲線

3.4 抗體特異性測定結果

間接競爭ELISA測定兔多抗血清特異性的結果見表2?？芍撏枚嗫寡鍖HE的交叉反應率為100%，除蘆薈大黃素的交叉反應率是0.1%，其余化合物均小于0.1%，說明抗RHE的多抗血清具有良好的特異性。

3.5 大黃酸含量測定結果

Ic-ELISA測得大黃中RHE含量為（0.026±0.001）%。HPLC測定：標準曲線為Y=61.126X-1174.7。測得大黃中RHE含量為（0.027±0.000）%，采用SPSS20.0對2組數(shù)據進行t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。因此，Ic-ELISA與HPLC檢測結果具有一致性，從而驗證了所建立的Ic-ELISA的準確性。

4 討論

基于抗體特異性的免疫分析方法具有耗時少、能夠大批量處理樣品、靈敏度和準確度高等優(yōu)點，并且有多種技術形式，將免疫分析方法應用于中醫(yī)藥的研究具有廣闊前景[12，15]。我們通過合成RHE人工抗原，進而產生抗RHE抗體，可以建立起相應的免疫分析方法，來進行大黃藥材、含大黃中成藥的質量檢測以及相關藥物的作用機理研究等。

人工抗原合成有很多種方法，如碳二亞胺法、高碘酸鈉氧化法及活潑酯法等。不同偶聯(lián)方法所選擇半抗原的連接基團或連接部位不同，決定半抗原表位構型表達上的差異，影響半抗原的免疫原性，更決定其免疫抗體的特異性[16]。RHE為1，8-二羥基-3-羧基蒽醌，根據化學結構中的1、8位羥基和3位羧基，設計RHE人工抗原的合成[17]。為了最大程度保證半抗原的極性與目標待測物的一致性，需要使間隔臂的介入點遠離特征性基團，故本實驗室選用基于羧基的碳二亞胺法來合成其人工抗原[18]。本方法中，EDC先和RHE反應生成一個加成中間產物，再與蛋白質分子上的氨基反應形成酰胺鍵，從而實現(xiàn)兩者的交聯(lián)。本方法操作簡便，且保留了RHE的特征性結構，可以提高RHE的免疫原性。

目前，鑒別人工抗原是否成功的方法主要有紫外分光光度法、電泳法、質譜法及同位素示蹤法等[19]。本研究采用紫外光譜法對合成產物進行鑒定，經過初步鑒定，RHE與載體蛋白成功偶聯(lián)，并且對免疫新西蘭兔血清進行ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，所合成的RHE-BSA可使新西蘭兔體內產生抗RHE抗體，效價達64 000以上，以兔血清測得大黃中RHE含量為（0.026±0.001）%，HPLC測得大黃中RHE含量為（0.027±0.000）%，兔多抗血清建立的免疫分析方法測定結果與HPLC測定結果差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

本研究采用免疫新西蘭兔方法制備抗RHE免疫血清效價（64 000）較張波等[20]報道的Balb/C小鼠抗血清效價（8000）更高；抗體敏感性IC50為0.09 μg/L，遠高于小鼠抗血清敏感性185.82 μg/L；另外，1只新西蘭兔可得到約50 mL高性價比抗RHE免疫血清，而1只Balb/C小鼠僅能產腹水5～10 mL，并且所得腹水效價遠低于血清。一般情況下制備基于抗體的免疫親和色譜柱需要使用的抗體量比較大，所以兔源性多克隆抗體特別適合用來制備免疫親和色譜柱，用于中藥特異性成分的敲除[21]或分離[16]。

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（收稿日期：2017-09-05）

（修回日期：2017-10-07；編輯：華強）