張自強(qiáng)，丁 芳，張以河，安 琪，徐榮榮，劉明東

引導(dǎo)骨再生(guided bone regeneration,GBR)技術(shù)采用生物膜阻擋周圍軟組織的成纖維細(xì)胞進(jìn)入骨缺損區(qū)，保護(hù)缺損區(qū)具有成骨能力的血凝塊的穩(wěn)定，維護(hù)血塊充填的間隙，最終實(shí)現(xiàn)缺損區(qū)的骨修復(fù)再生[1-2]。成骨過程中具有成骨潛能的細(xì)胞向缺損區(qū)生長、移行的速度慢于周圍的結(jié)締組織，可吸收生物修復(fù)膜的存在機(jī)械性地阻礙了纖維結(jié)締組織和周圍軟組織進(jìn)入骨缺損部位，保持骨缺損部位具有成骨潛能的間質(zhì)細(xì)胞具有相對穩(wěn)定的生長環(huán)境[3-4]?？晌丈镄迯?fù)膜作為骨缺損修復(fù)的關(guān)鍵材料，臨床上最早應(yīng)用于引導(dǎo)牙周缺損的修復(fù)與再生，如種植牙前種植區(qū)骨量不足；即刻種植時(shí)種植體與拔牙創(chuàng)之間有間隙；種植時(shí)出現(xiàn)骨裂及種植體暴露；種植術(shù)后種植體周圍炎癥引起的病理性骨吸收等[5-6]。膠原作為天然的生物材料，廣泛的應(yīng)用于組織工程和再生醫(yī)學(xué)中[7]。喜勒可吸收生物修復(fù)膜以牛跟腱為原料，采用酶解、透析、體外分子自組裝、滅菌等工藝制得。本研究旨在對比喜勒可吸收生物修復(fù)膜與市售生物修復(fù)膜修復(fù)骨缺損的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 新西蘭大白兔由北京金牧陽試驗(yàn)動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供[SCXK-(京)-2015-0005]。共選取健康成年新西蘭大白兔12只，體重2～2.5 kg，雌雄不限，單籠喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動物手術(shù)前1天禁食(不禁水)。

1.1.2 儀器和設(shè)備 喜勒可吸收生物修復(fù)膜由北京湃生生物科技有限公司生產(chǎn)(批號20160720)。市售生物修復(fù)膜為國家食品藥品監(jiān)督管理總局已批準(zhǔn)的市售生物修復(fù)膜(批號160317-SS160102)。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法 新西蘭大白兔稱重后用3%戊巴比妥鈉30 mg/kg經(jīng)耳緣靜脈滴注，全身麻醉。將兔仰臥位固定在手術(shù)臺上，下頜角試驗(yàn)區(qū)用剪刀去毛。用2.5%的碘伏和75%的酒精進(jìn)行常規(guī)皮膚消毒鋪巾，無菌條件下，在下頜角區(qū)下緣做3 cm長的皮膚切口并切透骨膜，貼骨面向上剖離咬肌與翼內(nèi)肌，充分暴露下頜角手術(shù)區(qū)[8]。

1.2.2 自體骨髂骨取骨 為保持髂嵴的外形和完整性，骨切口采取髂嵴上H型開窗術(shù)，暴露松質(zhì)骨，用挖匙挖出塊狀松質(zhì)骨，鋼絲剪剪碎，無菌紗布包好待用，用可吸收線將髂嵴復(fù)位，皮下及皮膚逐層縫合，加壓包扎。

1.2.3 骨缺損模型的建立 在生理鹽水充分冷卻的條件下，采用直徑為6 mm的球鉆在兔下頜骨左右兩側(cè)下頜角區(qū)分別制備直徑6 mm洞穿性的骨缺損。覆蓋生物膜，需超出缺損邊緣2 mm，分層縫合創(chuàng)口。術(shù)后3 d每天皮下注射抗生素。分別于術(shù)后1個月、3個月采用空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔，取整個下頜骨。

1.2.4 骨缺損模型的分組 12只兔子分為2組：喜勒可吸收生物修復(fù)膜組6只(左側(cè)植入自體骨覆蓋喜勒可吸收生物膜，右側(cè)不植骨不覆膜作為空白對照)，分別在1個月時(shí)間點(diǎn)、3個月時(shí)間點(diǎn)處死3只實(shí)驗(yàn)兔取下頜骨；市售生物膜組6只(左側(cè)不植骨不覆膜作為空白對照，右側(cè)植入自體骨覆蓋市售生物膜)，分別在1個月時(shí)間點(diǎn)、3個月時(shí)間點(diǎn)處死3只實(shí)驗(yàn)兔取下頜骨。

1.3 觀察方法 肉眼觀察皮膚創(chuàng)口愈合情況，解剖觀察創(chuàng)口處感染情況；X線觀察：對處理過的下頜骨進(jìn)行X光拍攝，并對X線圖像進(jìn)行處理，以便較直觀地反映骨缺損愈合情況；組織學(xué)觀察：常規(guī)石蠟包埋，脫鈣切片，Masson染色，光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察 1個月時(shí)，6只兔子下頜骨表皮創(chuàng)口愈合良好，無感染現(xiàn)象，解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)下頜骨膜植入位置創(chuàng)口愈合良好，無感染粘連現(xiàn)象；3個月時(shí)，毛已恢復(fù)正常長度，兔子下頜骨表皮創(chuàng)口愈合良好，下頜骨膜植入材料位點(diǎn)恢復(fù)良好。說明喜勒可吸收生物膜與市售生物修復(fù)膜生物相容性良好，不會引起機(jī)體炎性反應(yīng)(圖1)。

A：1個月時(shí)表皮傷口愈合良好；B：1個月時(shí)下頜角肌肉區(qū)創(chuàng)口愈合良好；C：3個月時(shí)表皮傷口愈合良好；D：3個月時(shí)下頜角肌肉區(qū)創(chuàng)口愈合良好圖1 新西蘭大白兔下頜角解剖圖

2.2 X線觀察 從X光圖片可以看出，植入材料1個月后喜勒可吸收生物修復(fù)膜組和市售生物修復(fù)膜組的大白兔下頜骨孔洞都有不同程度的縮小，說明缺損處都有不同程度的新骨生成，骨生成情況無明顯區(qū)別。但與空白對照相比，覆膜下頜骨孔洞明顯縮小(圖2)。

A：喜勒可吸收生物修復(fù)膜組左側(cè)下頜骨新生骨組織已覆蓋鉆孔；B：空白對照組左側(cè)下頜骨孔洞明顯；C：市售生物修復(fù)膜組右側(cè)新生骨組織已覆蓋鉆孔；D：空白對照右側(cè)下頜骨孔洞明顯

3個月時(shí)，喜勒可吸收生物修復(fù)膜組敷膜處骨缺損區(qū)消失，市售生物修復(fù)膜組敷膜處骨缺損消失，空白對照缺損區(qū)無明顯變化。表明使用喜勒可吸收生物修復(fù)膜與市售生物修復(fù)膜后，經(jīng)過3個月的修復(fù)生長，新生骨進(jìn)一步增加，骨缺損已基本愈合，說明喜勒可吸收生物修復(fù)膜與市售生物修復(fù)膜都可以阻擋肌肉組織長入骨缺損部位，并引導(dǎo)骨缺損修復(fù)再生(圖3)。

A:喜勒可吸收生物修復(fù)膜組左側(cè)下頜骨新生骨組織已覆蓋鉆孔;B:空白對照左側(cè)下頜骨孔洞明顯;C:市售生物修復(fù)膜組右側(cè)新生骨組織已覆蓋鉆孔;D:空白對照右側(cè)下頜骨孔洞明顯

2.3 組織學(xué)檢查 取下頜角部位，剔除部分肌肉組織，以10%中性福爾馬林固定，50%甲酸室溫下脫鈣處理，然后石蠟固定，脫鈣切片，Masson染色，光鏡下觀察生物膜吸收、降解情況及骨缺損愈合情況，顯微鏡下觀察(圖4)。

從圖中可以看出，植入材料1個月時(shí)，4倍鏡下喜勒可吸收生物修復(fù)膜結(jié)構(gòu)完整，緊貼骨組織，將骨缺損區(qū)與肌肉組織隔離，無炎性細(xì)胞。10倍鏡下喜勒可吸收生物修復(fù)膜結(jié)構(gòu)清晰，膜結(jié)構(gòu)內(nèi)及周圍無炎性細(xì)胞。植入材料3個月時(shí)，喜勒可吸收生物修復(fù)膜消失，骨缺損區(qū)修復(fù)良好，無炎性細(xì)胞。

植入材料1個月時(shí)，4倍鏡與10倍鏡下市售生物修復(fù)膜消失，缺損區(qū)無炎性細(xì)胞，植入材料3個月時(shí)，骨缺損區(qū)修復(fù)良好，無炎性細(xì)胞。

1個月時(shí)喜勒可吸收生物修復(fù)膜膜結(jié)構(gòu)依然完整，但市售生物修復(fù)膜已經(jīng)消失。說明喜勒可吸收生物修復(fù)膜與市售生物修復(fù)膜生物相容性良好，但喜勒可吸收生物膜較市售生物修復(fù)膜抗降解能力強(qiáng)。

喜勒可吸收生物修復(fù)膜組左下頜角區(qū)，鉆孔內(nèi)植入自體骨覆蓋喜勒可吸收生物修復(fù)膜，骨缺損區(qū)域具有類骨質(zhì)生成，類骨質(zhì)表面具有一層到多層成骨細(xì)胞；市售生物修復(fù)膜組右下頜角區(qū)，骨缺損區(qū)填充自體骨覆蓋市售生物修復(fù)膜，骨組織修復(fù)良好，骨缺損區(qū)已連接植入自體骨，骨內(nèi)膜和外膜層整齊排列一層呈柱狀成骨細(xì)胞；空白對照左下頜角區(qū)，斷骨區(qū)明顯；空白對照右下頜骨區(qū)骨缺損區(qū)域明顯，骨缺損區(qū)內(nèi)被膠原纖維或成纖維細(xì)胞填充，無骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)形成。

植入材料1個月時(shí)，喜勒可吸收生物修復(fù)膜與市售生物修復(fù)膜引導(dǎo)骨再生能力無明顯區(qū)別，骨缺損區(qū)都已連接植入自體骨并有類骨質(zhì)生成。覆蓋喜勒可吸收生物修復(fù)膜的骨缺損區(qū)內(nèi)有成骨細(xì)胞生成，而空白對照骨缺損區(qū)內(nèi)被膠原纖維或成纖維細(xì)胞填充，無成骨細(xì)胞。說明喜勒可吸收生物修復(fù)膜能起到物理阻隔作用，能夠有效的引導(dǎo)骨再生(圖5)。

植入材料3個月時(shí)，喜勒可吸收生物修復(fù)膜與市售生物修復(fù)膜都降解完畢，2組骨缺損都修復(fù)良好，骨膜完整，骨外膜細(xì)胞為扁平狀，骨組織完整，骨基質(zhì)內(nèi)有一層扁平狀的成骨細(xì)胞，骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)呈板層狀較為致密；空白對照斷骨區(qū)域明顯，骨缺損區(qū)被間充質(zhì)細(xì)胞填充，再次說明敷蓋喜勒可吸收生物修復(fù)膜能夠起到物理阻隔作用，可良好的引導(dǎo)骨組織再生(圖5)。

A：1個月時(shí)4倍鏡下喜勒可吸收生物修復(fù)膜結(jié)構(gòu)完整；B：1個月時(shí)10倍鏡下喜勒可吸收生物修復(fù)膜結(jié)構(gòu)完整；C：3個月時(shí)4倍鏡下喜勒可吸收生物修復(fù)膜消失；D：3個月時(shí)10倍鏡下喜勒可吸收生物修復(fù)膜消失；E：1個月時(shí)4倍鏡下市售生物修復(fù)膜消失；F：1個月時(shí)10倍鏡下市售生物修復(fù)膜消失；G：3個月時(shí)4倍鏡下市售生物修復(fù)膜消失；H：3個月時(shí)10倍鏡下市售生物修復(fù)膜消失

A：1個月喜勒可吸收生物修復(fù)膜組左側(cè)下頜角區(qū)；B：1個月市售生物修復(fù)膜組右側(cè)下頜角區(qū)；C：1個月空白對照左下頜角區(qū)；D：1個月空白對照右下頜角區(qū)；E：3個月喜勒可吸收生物修復(fù)膜組左側(cè)下頜角區(qū)；F：3個月市售生物修復(fù)膜組右側(cè)下頜角區(qū)；G：3個月空白對照左下頜角區(qū)；H：3個月空白對照右下頜角區(qū)(Masson染色，×4)

3 討論

GBR技術(shù)應(yīng)用了膜的屏障作用、空間保護(hù)作用、誘導(dǎo)引導(dǎo)作用，應(yīng)用于牙種植，引導(dǎo)種植體周圍骨再生，都取得了理想的骨再生效果。GBR技術(shù)通過膜的機(jī)械屏障作用，阻止了來自周圍組織的成纖維細(xì)胞侵入骨缺損區(qū)，并通過缺損區(qū)植入材料的引導(dǎo)支架作用，使自體成骨細(xì)胞有足夠時(shí)間在缺損區(qū)增殖、成骨，最終達(dá)到缺損區(qū)骨組織重建。

GBR技術(shù)中應(yīng)用的可吸收生物修復(fù)膜材料分為可生物降解與不可生物降解2大類，其中第一代再生膜的材料是不可降解的鈦膜、聚四氟乙烯等。這類材料易操作且具有較好的生物相容性和較理性的機(jī)械強(qiáng)度，但是這類膜通透性較差，影響營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入上方瓣膜，易于引起牙齦退縮，從而引發(fā)感染及膜暴露，同時(shí)材料不能被組織吸收且無法與周圍組織結(jié)合，因此不可避免的要經(jīng)受二次手術(shù)，增加了創(chuàng)傷[9-10]。第二代再生膜材料為生物可降解材料，膜材料在機(jī)體內(nèi)可降解吸收，從而避免了二次手術(shù)取出。可降解生物膜材料有聚乳酸、膠原、聚乙烯二醇、殼聚糖等，這些材料中，膠原膜具有纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，有利于再生細(xì)胞附著，易于放置貼附，生物相容性好，在促進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖和分化方面優(yōu)于其他可吸收生物修復(fù)膜材料[11]，因此在各類可吸收性GBR膜中，膠原膜備受關(guān)注。目前臨床中應(yīng)用較多的膠原膜為脫細(xì)胞真皮基質(zhì)膜，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)膜去除了真皮的細(xì)胞成分，保留真皮內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)，維持完整的膠原形態(tài)和基底膜結(jié)構(gòu)[12]。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)膜采用Dispase-Triton法[13]或NaCl-SDS法[14]去除了基質(zhì)外的細(xì)胞成分，但是膜中膠原分子內(nèi)C、N末端區(qū)域的主要免疫原性位點(diǎn)“端肽”[15]無法去除，因此不能完全去除其免疫原性。而喜勒可吸收生物修復(fù)膜采用精準(zhǔn)酶切技術(shù)從牛跟腱中提?、裥湍z原蛋白，其純度達(dá)99%以上，酶切去除了Ⅰ型膠原蛋白的端肽結(jié)構(gòu)，徹底去除了其免疫原性。與脫細(xì)胞真皮基質(zhì)膜不同，喜勒可吸收生物修復(fù)膜采用的是體外自組裝工藝，運(yùn)用了膠原蛋白大分子中攜帶不同電荷的基團(tuán)，氫鍵、通過靜電作用、疏水性作用等非共價(jià)鍵力自發(fā)地自組裝形成的膜[16]，這些分子鍵使其機(jī)械強(qiáng)度比脫細(xì)胞工藝基質(zhì)膜高，組織相容性好。

可吸收性生物修復(fù)膜植入生物體后，在被吸收之前需要維持一定時(shí)間才能起到良好的修復(fù)作用，即膜的降解速率應(yīng)當(dāng)與組織愈合的速率保持一致。如果膜的降解時(shí)間低于骨的形成時(shí)間，骨的缺損修復(fù)效果將會大打折扣[17-18]。宋愛梅等[19]和Karring等[20]研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后2～3周是牙周再生愈合的關(guān)鍵時(shí)間，因此生物修復(fù)膜用于治療牙周病時(shí)，降解周期需要在3～4周以上，膜材料用于修復(fù)骨缺損時(shí)，其降解周期應(yīng)保持17周左右時(shí)間，以平衡人類骨的正常形成周期。市售生物修復(fù)膜在植入1個月時(shí)已經(jīng)消失，而喜勒可吸收生物修復(fù)膜結(jié)構(gòu)依然完整，且緊貼骨組織，無炎性細(xì)胞，表明喜勒可吸收生物修復(fù)膜的降解時(shí)間更長，抗降解能力優(yōu)于市售組。

喜勒可吸收生物修復(fù)膜在進(jìn)行GBR時(shí)，具有很好的安全性和有效性，能夠起到生物屏障膜的作用，阻止來自周圍軟組織的成纖維細(xì)胞，讓成骨細(xì)胞有足夠的時(shí)間和空間增殖，最終達(dá)到引導(dǎo)組織再生、定向修復(fù)的目的，實(shí)現(xiàn)缺損區(qū)的骨修復(fù)再生。

【參考文獻(xiàn)】

[1]馬士卿,張旭,孫迎春,等.引導(dǎo)骨組織再生膜的研究進(jìn)展[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2016,32(3):308-310.

[2]Talreja PS,Gayathri GV,Mehta DS.Treatment of an early failing implant by guided bone regeneration using resorbable collagenmembrane and bioactive glass[J].J Indian Soc Periodontol,2013,17(1):131-136.

[3]鄭漢峰.不同口腔修復(fù)膜材料在牙種植引導(dǎo)骨再生中的應(yīng)用效果觀察[J].臨床醫(yī)學(xué)工程,2016,23(8):1001-1002.

[4]蔣柳宏,董瀅,景向東.引導(dǎo)骨再生技術(shù)在上前牙種植修復(fù)中的效果[J].中國組織工程研究,2015,19(7):1138-1142.

[5]趙進(jìn)峰,尹蒙熔,樊馬娟.改良式GBR技術(shù)聯(lián)合即刻種植術(shù)后即刻修復(fù)上前牙的療效分析[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2015,38(4):151-152.

[6]黃宇文.牙周炎對種植體周圍邊緣骨吸收的影響[J].實(shí)用臨床醫(yī)學(xué),2017,18(7):63-64,70.

[7]Mercado KP,Helguera M,Hocking DC,et al.Noninvasive quantitative imaging of collagen microstructure in three-dimensional hydrogels using high-frequency ultrasound[J].Tissue Eng Part C Methods,2015,21(7):671-682.

[8]胡秀蓮,邱立新,林野,等.可吸收性Bio-Gide膜治療下頜角區(qū)局部骨缺損實(shí)驗(yàn)研究[J].中國口腔種植學(xué)雜志，2002,7(1):10-12,24.

[9]馬遙.靜電紡PBS/PPC載rh-BMP2納米纖維膜的制備及生物活性評價(jià)[D].長春：吉林大學(xué),2015.

[10]白冰,朱靜濤,王立威.作為GBR屏障膜的新型膠原膜的體內(nèi)植入效果分析[J].口腔醫(yī)學(xué),2015,35(3):170-174.

[11]杜倩.殼聚糖-膠原角膜修復(fù)材料的制備及生物相容性[J].中國組織工程研究，19(52)：8433-8437.

[12]侯勁松,黃洪章.脫細(xì)胞真皮基質(zhì)在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國口腔頜面外科雜志,2007,5(3):163-169.

[13]Takami Y,Matsuda T,Yoshitake M,et al.Dispase/deter-gent treated dermal matrix as a dermal substitute[J].Burns,22(3):182-190.

[14]Livesey SA,Herndon DN,Hollyoak MA,et al.Transplanted acellular allograft dermal matrix:potential as a template for the reconstruction of viable dermis[J].Transplantation,1998,60(1):1-9.

[15]杜曉丹，方玉，奚廷斐，等.動物源性膠原的生產(chǎn)、應(yīng)用及其免疫原性[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(23):4511-4514.

[16]李新明,劉歡,劉潔.基于多肽及多肽衍生物而構(gòu)建的具有生物應(yīng)用潛力的超分子自組裝體的研究[C].蘇州：全國高分子學(xué)術(shù)論文報(bào)告會,2015.

[17]周藝群.可吸收性GTR膜材料的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].中國口腔種植學(xué)雜志,2002,7(1):42-45.

[18]Zhang Y,Zhang X,Shi B,et al.Membranes for guided tissue and bone regeneration[J].Oral Maxillofac Surg Clin North Am,2013,1(1):1-10.

[19]宋愛梅,楊丕山,孫欽峰,等.屏障膜放置時(shí)間與牙周再生量關(guān)系的動物實(shí)驗(yàn)研究[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志,2001,11(1):17-19.

[20]Karring T,Nyman S，Lindhe J,et al.Potentials for root resorption during periodontal wound healing[J].J Clin Periodontol,1984,11(1):41-52.