劉思征 劉琴

（1汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科 廣東 汕頭 515041）（2汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 廣東 汕頭 515041）

1.前言

隨著人類生存環(huán)境的不斷變化，不育不孕癥的發(fā)病率連年升高。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，全球大約有12～15%的育齡夫婦受到不育不孕癥的困惱，其中50%是由男性因素造成的。生殖細(xì)胞移植是治療男性不育癥的理想方法。功能生殖細(xì)胞的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，體外模擬合適的細(xì)胞微環(huán)境十分關(guān)鍵。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUMSC）是一種受到疾病和環(huán)境造成基因突變可能性極低的細(xì)胞，其來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（HUMSC-IPS）具有類似胚胎干細(xì)胞的多向分化潛能[2]。本研究在體外模擬精原細(xì)胞生長(zhǎng)的三維環(huán)境，提供干細(xì)胞分化所需的電、機(jī)械刺激及細(xì)胞因子，觀察HUMSC-IPS向男性生殖細(xì)胞分化的情況。

2.材料與方法

2.1 材料

2.1.1 主要試劑及設(shè)備 DMEM/F12培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清；TRIZOL試劑；BMP4蛋白；絲裂霉素C；SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RnaseH Plus)；臺(tái)式高速離心機(jī)；Real-Time PCR儀；低溫與超低溫冰箱；超凈工作臺(tái)；CO2恒溫培養(yǎng)箱；倒置顯微鏡等。

2.1.2 標(biāo)本來源 臍帶：取自汕頭大學(xué)第二附屬醫(yī)院剖宮產(chǎn)出生的健康足月新生兒，均征得家屬同意，放棄使用權(quán)，并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。HUMSC-IPS：來自本課題組前期液氮凍存細(xì)胞。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠：3～4周齡及新生兒小鼠，從汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購買。

2.2 方法

2.2.1 小鼠睪丸支持細(xì)胞（SCs）的分離、培養(yǎng)及飼養(yǎng)層的制備出生1天昆明小鼠麻醉處死后，取出睪丸并剪碎，分離曲細(xì)精管并依次加入0.1%DNA酶、0.1%膠原酶Ⅳ、0.1%透明質(zhì)酸酶，兩次消化、離心、過濾后分裝至六孔板里，加入培養(yǎng)基（DMEM/F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清），37℃培養(yǎng)箱4小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)基。48小時(shí)后棄去舊培養(yǎng)基，PBS清洗后，加入無菌Tris-HCL低滲休克（20mmol/l，PH 7.4）2～3min，清洗后加入新鮮DMEM/F12培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱，每隔2～3天換液一次。當(dāng)?shù)诙腟Cs生長(zhǎng)融合達(dá)到80%～90%時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，加入含15ug/ml絲裂霉素C的培養(yǎng)基孵育2h，清洗后加入0.05%胰蛋白酶/EDTA，消化、吹打、離心，將沉淀的細(xì)胞以H-DMEM培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞的濃度是0.5×105/L，加入培養(yǎng)板里，在培養(yǎng)箱中保持單層貼壁培養(yǎng)，隔兩天換一次液，通過培養(yǎng)4 d使其形成單層細(xì)胞飼養(yǎng)層及特殊的三維立體細(xì)胞接觸表面。

2.2.2 HUMSC-IPS體外誘導(dǎo)自液氮中取出HUMSC-IPS凍存管，復(fù)蘇后細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)層皿上，輕搖培養(yǎng)板，使IPS克隆均勻分布于皿中，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天觀察細(xì)胞貼壁情況，每日觀察克隆生長(zhǎng)情況并更換新鮮培養(yǎng)基。HUMSC-IPS貼壁飼養(yǎng)層上后，實(shí)驗(yàn)組更換為含有100ng/mlBMP4的IPS培養(yǎng)基，對(duì)照組更換為不含BMP4的IPS培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，以首次更換含BMP4培養(yǎng)基前作為D0，分別收集D3、D7、D14、D21細(xì)胞。

2.2.3 檢測(cè)SOX17和BLIMP1基因表達(dá) 將收集細(xì)胞用于RNA提取，以D0作為基礎(chǔ)表達(dá)量，收集第0、3、7、14及21天的總RNA，通過RT-PCR檢測(cè)生殖分化關(guān)鍵因子SOX17和BLIMP1表達(dá)量的變化。相同時(shí)間點(diǎn)利用兩個(gè)獨(dú)立樣本T-檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間的差異利用重復(fù)測(cè)量方差分析來檢驗(yàn)表達(dá)量的變化。

3.結(jié)果

3.1 小鼠睪丸支持細(xì)胞（SCs）的分離、培養(yǎng) 采用三種酶連續(xù)消化及低滲性處理新生昆明小鼠睪丸，SCs容易貼壁，而生殖細(xì)胞不貼壁，利用這個(gè)特性很容易分離SCs。該方法分離培養(yǎng)出來的SCs純度高，電鏡下觀察SCs上漂浮著一些圓形細(xì)胞即為生殖細(xì)胞，可見SCs呈單層膜狀不規(guī)則形狀。約1周后SCs鋪滿整個(gè)培養(yǎng)板，單個(gè)細(xì)胞胞質(zhì)豐富，可見小空泡或顆粒狀物，胞核大，呈橢圓形或圓形。

3.2 HUMSC-IPS體外誘導(dǎo)

IPS克隆呈圓形，邊緣整齊，細(xì)胞連接緊密，如圖1。倒置顯微鏡下觀察，D0可見兩組擬胚體大小大部分相近，形態(tài)均呈現(xiàn)出周緣光滑，聚集緊密，為正圓形態(tài)，自發(fā)分化組較誘導(dǎo)組早出現(xiàn)形態(tài)變化，D10出現(xiàn)周緣毛糙、松散，克隆中央尚致密，D14大多克隆變松散；而誘導(dǎo)組擬胚體在誘導(dǎo)D14開始出現(xiàn)周緣毛糙、松散，持續(xù)誘導(dǎo)至D21克隆中央仍較致密。

3.3 HUMSC-IPS體外向生殖方向分化關(guān)鍵基因表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)到HUMSC-IPS在體外生精微環(huán)境中培養(yǎng)，可以表達(dá)生殖分化關(guān)鍵基因SOX17和BLIMP1，且表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間變化而不同。在添加BMP4誘導(dǎo)組，SOX17基因表達(dá)量在第3天升高到達(dá)最高值，隨后升高幅度減慢，在誘導(dǎo)14天后升高幅度明顯減慢，在21天時(shí)仍高于對(duì)照組。BLIMP1基因的表達(dá)與SOX17基因表達(dá)變化趨勢(shì)大體一致，呈規(guī)律性表達(dá)。見圖2。

圖1 IPS克隆邊緣規(guī)整，細(xì)胞間連接緊密，生長(zhǎng)在SCs飼養(yǎng)層上

圖2 RT-PCR檢測(cè)到生殖分化關(guān)鍵基因SOX17和BLIMP1表達(dá)增高，且隨誘導(dǎo)時(shí)間變化而不同

4.討論

不育不孕癥是重要的現(xiàn)代社會(huì)和醫(yī)學(xué)問題，生殖細(xì)胞移植是治療不育癥的理想途徑。生殖細(xì)胞的發(fā)生是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，其具體機(jī)制尚未完全清楚。研究表明通過類胚體形成、藥物誘導(dǎo)和模擬生殖細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境均可誘導(dǎo)干細(xì)胞往生殖方向分化。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（IPS）是具有類似胚胎干細(xì)胞（ES）多能分化潛能的一類新型細(xì)胞，目前它越來越廣泛的應(yīng)用于基因治療、藥物篩選和細(xì)胞移植等領(lǐng)域[3]。人臍帶華爾通膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（HUMSC）在分化程度上較為原始，受到疾病和環(huán)境造成的基因突變可能性極低，免疫原性低，取材來源廣泛且安全無創(chuàng)[4]。本課題組前期已成功獲得HUMSC來源的IPS細(xì)胞，且證實(shí)了HUMSC-IPS的無限自我更新能力和多胚層分化潛能[2]，并藥物誘導(dǎo)其向生殖細(xì)胞方向分化做出了嘗試。

隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)精子的發(fā)生與睪丸微環(huán)境密切相關(guān)，在睪丸生精小管中提供微環(huán)境的唯一體細(xì)胞，是睪丸支持細(xì)胞（SCs）。SCs形成了生殖細(xì)胞發(fā)生、成長(zhǎng)、獲能所需要的結(jié)構(gòu)支持、營養(yǎng)、內(nèi)分泌因子環(huán)境，并通過構(gòu)建血睪屏障形成局部免疫赦免來保護(hù)生殖細(xì)胞，維持生殖細(xì)胞通過減數(shù)分裂并最終發(fā)育出有功能的精子[5]。本實(shí)驗(yàn)通過絲裂霉素C處理純化的新生小鼠睪丸SCs后，獲得了失去分裂增值能力，但保留了細(xì)胞結(jié)構(gòu)及分泌功能的SCs飼養(yǎng)細(xì)胞，可以為HUMSC-IPS向精原細(xì)胞分化提供立體接觸表面及內(nèi)分泌因子支持，形成生殖細(xì)胞分化所需的微環(huán)境。

原始生殖細(xì)胞（PGCs）是在胚胎時(shí)期出現(xiàn)的最早細(xì)胞類型，具有全能細(xì)胞的特性，是精子與卵子的前體細(xì)胞，是生殖細(xì)胞發(fā)育及配子產(chǎn)生的基礎(chǔ)。SOX17和BLIMP1共同表達(dá)于PGCs中，靶向敲除SOX17后，發(fā)現(xiàn)多能基因及多種生殖細(xì)胞標(biāo)記基因均出現(xiàn)表達(dá)的抑制，重新激活SOX17基因后，受抑制的相關(guān)基因表達(dá)量上升。SOX17是進(jìn)入PGC階段的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而BLIMP1則抑制內(nèi)胚層和其他由SOX17和BMP信號(hào)通路誘導(dǎo)的成體細(xì)胞基因的表達(dá)。作為SOX17的下游基因，BLIMP1敲除后同樣導(dǎo)致原始生殖細(xì)胞特化失敗。[6,7]因此，SOX17及其下游基因BLIMP1對(duì)早期生殖細(xì)胞特化生成及功能維持至關(guān)重要。BMP4因子屬于TGF—β家族，它通過激活SMAD家族的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)導(dǎo)其信號(hào)通路并激活一系列的下游基因來發(fā)揮作用，可誘導(dǎo)外胚層細(xì)胞特化發(fā)育成PGCs。[8]

BMP4因子是否通過SOX17通路的激活，從而促使生殖細(xì)胞分化形成，我們?cè)O(shè)計(jì)了上述實(shí)驗(yàn)。我們通過HUMSC-IPS與SCs飼養(yǎng)層共培養(yǎng)，并添加細(xì)胞因子BMP4，體外模擬生殖細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展需要的睪丸微環(huán)境，觀察多能細(xì)胞向生殖細(xì)胞方向分化的過程。我們觀察到，HUMSC-IPS在形態(tài)學(xué)上明顯發(fā)生了變化，周緣毛糙、松散，逐漸出現(xiàn)精原細(xì)胞分化跡象。通過基因?qū)用娴谋磉_(dá)分析，我們發(fā)現(xiàn)SOX17基因及其下游基因BLIMP1在我們的誘導(dǎo)體系下，均呈規(guī)律性高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：（1）睪丸支持細(xì)胞構(gòu)成的接觸立體微環(huán)境，可以促進(jìn)多能細(xì)胞向生殖細(xì)胞分化；（2）BMP4因子通過激活SOX17通路，來促使多能細(xì)胞特化發(fā)育成PGCs，從而向生殖細(xì)胞分化方向推進(jìn)。

[1]Larson, K.L., et al. Sperm chromatin structure assay parameters as predictors of failed pregnancy following assisted reproductive techniques. Hum Reprod, 2000. 15(8): p.1717-22.

[2]楊漢華，etal.，六個(gè)轉(zhuǎn)錄因子將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高效重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[J]中華實(shí)用兒科臨床雜志，29，1331(2014).

[3]劉思征，馬廉.誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，(3):173-175.

[4]Ma, L.,et al.Human umbilical cord Wharton's Jellyderived mesenchymal stem cells differentiation into nervelike cells.Chin Med J (Engl),2005.118(23):p.1987-93.

[5]Xie L，et a1．Sertoli cell—mediated differentiation of male germ cell-like cells from human umbilical cord Wharton’s jelly— derived mesenchymal stem cells in an in vitro co—culture system．Eur J Med Res，2015，20：9．

[6]Irie N,et al. SOX17 is a critical specifier of human primordialgerm cell fate[J].Cell,2015,160(1):253-268.

[7]Nakaki F,et al.Induction of mouse germcell fate by transcriptionfactors in vitro[J].Nature,2013,501(7466):222-226.

[8]Li, Y.and M.M.Parast,BMP4 regulation of human trophoblast development.Int J Dev Biol,2014.58(2-4):p.239-46.