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呼吸道和下呼吸道感染是人類主要疾病之一，是兒童發(fā)病、住院和死亡的主要原因。引起人類呼吸道感染的病原十分復(fù)雜，已知大約有5%～30%是由人冠狀病毒HCoV-229E和HCoV-OC43感染引起[1]，主要導(dǎo)致普通感冒。2002-2003年“非典”暴發(fā)，SARS[2]冠狀病毒的出現(xiàn)推進了人們對冠狀病毒的研究。繼SARS-CoV之后，科學(xué)家們又發(fā)現(xiàn)了兩種新的引起呼吸系統(tǒng)疾病的HCoV(HCoV-NL63[3]和HCoV-HKU1[1])。HCoV-HKU1是2005年1月由香港科學(xué)家在一位老年肺炎患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，同年9月，另一位澳大利亞學(xué)者[4]在兒童急性呼吸道感染中也發(fā)現(xiàn)了該病毒的存在。該病毒可引起急性呼吸道感染，癥狀有流涕、發(fā)熱、咳嗽和喘鳴，嚴重者表現(xiàn)為支氣管炎和肺炎[4-5]，也可引起胃腸疾病[6]，甚至和熱性癲癇發(fā)作有關(guān)[6]。

冠狀病毒(Human coronaviruses, HCoV)屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，在自然界中廣泛存在，人和多種動物易感。形態(tài)上呈圓形或橢圓形，因其在電鏡下呈日冕狀或皇冠狀而得名。為單股正鏈RNA病毒，是目前已知RNA病毒中基因組最大的病毒，基因組全長約27～32 kb，使其在加工和修飾過程中增加了不穩(wěn)定性；由于RNA聚合酶忠實性較低，RNA病毒在復(fù)制過程中基因序列較易發(fā)生點突變；同時由于冠狀病毒具有獨特的復(fù)制機制，在基因組復(fù)制過程中存在一個復(fù)制中間體導(dǎo)致其在進化過程中發(fā)生重組的概率增大，因而不斷出現(xiàn)新的變異株而呈現(xiàn)遺傳多樣性。

HCoV-HKU1為無節(jié)段單股正鏈RNA病毒，GC含量為32%,是所有已知冠狀病毒中GC含量最低的。根據(jù)病毒基因組的序列，HCoV-HKU1和HCoV-OC43同屬β類冠狀病毒[7]。病毒基因組(圖1)5′ 端具甲基化的帽狀結(jié)構(gòu)，3′ 端具有 poly(A)尾，兩端分別包含一個轉(zhuǎn)錄非轉(zhuǎn)譯區(qū)(Untranslated region, UTR)，即 5′-UTR和 3′-UTR，其長度分別在200～600nt和200～500nt之間。其中，5′-UTR包含核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄起始信號，3′-UTR含有轉(zhuǎn)錄終止信號。距5′ 端約2/3的基因組包含兩個大的重疊的開放讀碼框(Open reading frame, ORF)ORF 1a和ORF 1b，主要負責編碼與病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶類等非結(jié)構(gòu)蛋白，比如RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，pol)，復(fù)制酶等和結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白包括血凝素酯酶糖蛋白(hemagglutinin-esterase, HE)、棘刺蛋白(spike, S)、膜蛋白(membrane, M)、包膜蛋白(envelop, E)和核衣殼蛋白(nucleocapsid, N)。在結(jié)構(gòu)蛋白之間通常含有一些小的開放讀碼框ORFs。體外實驗表明，有些ORF并非病毒復(fù)制所必須，但與病毒的致病性有關(guān)，同時決定著病毒的群特異性[8]。研究HCoV-HKU1病毒各個蛋白基因序列并進行比對和進化樹分析是非常有必要的。HCoV-HKU1分型較為復(fù)雜,主要根據(jù)pol基因、S基因和N基因，香港科學(xué)家將HCoV-HKU1可分為A、B、C三型[9-10]，并認為C型可能是A型和B型重組形成的。

圖1 HCoV-HKU1病毒基因組結(jié)構(gòu)Fig.1 Genome organization of HCoV-HKU1

本研究從2007年11月至2015年1月采集了在福建省福州市婦幼保健院因呼吸道感染住進兒科重癥監(jiān)護病房(PICU)的266例小兒鼻咽抽取物標本，對用RT-PCR法檢測出的兩例HCoV-HKU1進行了N基因和S基因的全基因序列測定、拼接和系統(tǒng)進化分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本采集 采集266例因急性下呼吸道感染住院患兒(臨床診斷為支氣管炎或肺炎、毛細支氣管炎)的鼻咽抽取物(Nasopharyngeal aspirates, NPA)標本，并征得患兒父母的知情同意和醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.1.2試劑儀器 病毒RNA提取采用德國QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit，按手冊所提供的方法提取病毒RNA。引物由TaKaRa(大連)有限公司合成。M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶為Invitrogen公司產(chǎn)品(SuperScriptTM Ш Reverse Transcriptase), Taq酶為TaKaRa公司產(chǎn)品。RT-PCR和PCR擴增主要儀器為ABI公司的VeritiTM Dx 96 Well Thermal Cycler基因擴增儀。熒光定量RT-PCR檢測試劑盒和熒光定量PCR檢測試劑盒均購自上海之江生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1標本處理 將采集的NPA標本加入3 mL 左右DMEM采樣液中，在4 ℃條件下送達實驗室后，于生物安全柜中反復(fù)吹打標本，并加入雙抗(含200 U/mL青霉素，200 U/mL鏈霉素)，分裝數(shù)管，置-70 ℃保存。

1.2.2病毒核酸提取 將標本凍融兩次后，10 000 g離心15 min，吸取上清。采用德國Qiagen 公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit，按其手冊所提供的方法提取病毒RNA。

1.2.3HCoV-HKU1 RT-PCR產(chǎn)物的擴增 采用一對人冠狀病毒的通用引物[1,11]進行擴增，擴增產(chǎn)物為pol基因的一段，長440 bp。反應(yīng)條件為：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min, 95 ℃ 15 min, 然后94 ℃ 30 s, 50 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min，共45個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min；同時采用一對新型人冠狀病毒HCoV-HKU1的特異性引物[11-12]進行擴增確認, 擴增產(chǎn)物長950 bp。反應(yīng)條件為：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃ 15 min，然后94 ℃ 40 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共45個循環(huán)，最后72 ℃ 10 min。

1.2.4RNA的體外轉(zhuǎn)錄 提取的RNA, 用隨機引物和反轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,以便進行后續(xù)的各種PCR反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為: 65 ℃變性5 min，50 ℃逆轉(zhuǎn)錄60 min，70 ℃ 10 min。

1.2.5HCoV-HKU1N基因和S基因的擴增與序列測定 根據(jù)文獻[13]合成N基因和S基因序列引物。引物以GenBank中NC-006577為參考序列，N基因全長1 326 bp，擴增片段為參考株的28 119～29 682區(qū)域,擴增片段長度為1 564 bp；S基因全長4 071 bp，擴增部分為參考株的22 642～27 075區(qū)域,總共分3個片段進行擴增。S1片段擴增長度為1 738 bp，S2片段擴增長度為1 625 bp，S3片段擴增長度為1 443 bp。N基因和S基因的S2、S3片段PCR反應(yīng)條件為:94 ℃,5 min預(yù)變性；再以94 ℃,45 s,54 ℃,45 s, 72 ℃,1 min 30 s進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。S1片段PCR退火溫度則為52 ℃。各擴增片段用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測鑒定后送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進行純化和序列測定。

1.2.6其它幾種呼吸道病毒的檢測 對檢測出HCoV-HKU1的2例陽性標本也進行了4種常見呼吸道病毒—呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(包括甲1、甲3和乙型)、人副流感病毒(HPIV)1-4型、呼吸道腺病毒(R-ADV)和4種呼吸道新病毒(包括人偏肺病毒hMPV、人博卡病毒HBoV、WU多瘤病毒W(wǎng)UPyV和KI多瘤病毒KIPyV)的檢測[11]。

1.2.7基因比對分析 將所測得的序列在GenBank中進行BLAST初步比對分析。系統(tǒng)進化分析采用MEGA6.06軟件，以鄰接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建進化樹，Bootsrap值設(shè)定為1000。

2 結(jié) 果

2.1病毒檢測 從266例患兒中檢測到8例HCoV感染陽性病例[11]，經(jīng)基因序列測定和BLAST比對分析得到證實，檢出率為3.0%。其中2例檢出HCoV-HKU1(FZ90, FZ96)，檢出率0.75%；還有1例檢出HCoV-NL63，4例檢出HCoV-OC43，1例檢出HCoV-229E。檢測出2例HCoV-HKU1與人副流感病毒3型(HPIV-3)混合感染。

2.2HCoV-HKU1陽性病例的臨床癥狀 HCoV-HKU1感染患兒為一男一女，男嬰4個半月大，診斷為支氣管炎，連續(xù)咳嗽加?。慌畫?個月大，診斷為急性重癥肺炎伴心衰。他們體溫正常，都在3月底發(fā)病。

2.3序列比對和系統(tǒng)進化分析 根據(jù)pol基因RT-PCR產(chǎn)物序列測定與BLAST比對分析顯示，在福州地區(qū)檢測出的8株人冠狀病毒中，2株為人冠狀病毒HCoV-HKU1，序列比對表明福州的2株HCoV-HKU1pol基因片段堿基序列有4處不同。1株FZ90與北京BJ01-p9株(NO. KT779556)和香港N18基因型A株(NO. DQ415914)等的同源性為99%；另1株FZ96與北京BJ01-p9株和香港N18基因型A株等的同源性也為99%，但與泰國CU-H2809/2010株(NO. JX513214)的1abpol基因的同源性為100%[11]。用于確認HCoV-HKU1的950 bp的核酸片段含有部分M基因和N基因，福州2株HCoV-HKU1的950 bp的核酸片段序列完全相同。

2.4N基因進化分析 N蛋白基因序列全長為1 326個核苷酸, 編碼441個氨基酸。序列比對表明福州的2株HCoV-HKU1 N基因片段堿基序列完全相同。BLAST比對分析顯示，2株福州株與北京BJ01-p9株和香港N18基因型A株等的同源性都為100%。

將在福州地區(qū)檢測出的2株HKU1 N基因核苷酸序列與基因庫中HKU1的3種亞型的一些代表性毒株序列進行比對分析(圖1)，這些毒株包括香港(HK)、北京(BJ)、美國(USA)、法國(FR)，系統(tǒng)進化分析采用MEGA6.06軟件。圖1顯示2株FZ90和FZ96與HKU1的A基因型聚成一簇。

2.5S基因進化分析 S蛋白基因序列全長為4 071個核苷酸, 是編碼1 356個氨基酸的糖蛋白。將檢測出的S基因的3個片段進行拼接和序列分析。序列比對表明福州的2株HCoV-HKU1S基因片段堿基序列有2處不同，但所編碼的氨基酸序列卻完全相同。BLAST比對分析顯示，這2株與北京BJ01-p9株和香港N18基因型A株等的同源性為99%。

將在福州地區(qū)檢測出的2株HKU1S基因核苷酸序列與基因庫中HKU1的3種亞型的一些代表性毒株序列進行比對分析。比對所采用的毒株比N基因多了3株巴西(BRA)的。圖2顯示2株FZ90和FZ96與HKU1的A基因型聚成一簇。

圖2 福州2株HKU1 N基因系統(tǒng)進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of N genes in Fuzhou HKU1 strains

圖3 福州2株HKU1 S基因系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of S genes in Fuzhou HKU1 strains

3 討 論

HCoV-HKU1和同屬β群的HCoV-OC43一樣, 均為普通感冒病毒, 通常對人沒有生命危險, 但在嬰幼兒、老年人和免疫缺陷者可引起較嚴重的臨床癥狀。目前只報道2例因HCoV-HKU1感染導(dǎo)致肺炎死亡病例[9]，這2例都伴有基礎(chǔ)疾病,尤其是呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病。香港同一研究表明, 7名感染HKU1 A基因型的病人都有基礎(chǔ)疾病，而2名感染HKU1 B基因型的病人沒有基礎(chǔ)疾病。在法國, 6名HKU1感染者中有3名伴有基礎(chǔ)疾病[6]，HKU1的感染可能會加重患者基礎(chǔ)疾病病情,導(dǎo)致其需要入院治療。本研究發(fā)現(xiàn)2例HKU1感染患兒都伴有HPIV-3的混合感染，這可能加重了呼吸道感染的病情。美國學(xué)者的研究[14]表明59%HKU1陽性的科羅拉多呼吸道感染病人伴有其它病毒的混合感染，其中24%混合感染鼻病毒，20%混合感染呼吸道合胞病毒，11%混合感染腺病毒，7%混合感染HCoV-NL63。58%為2歲以下嬰幼兒。

2012年，又出現(xiàn)一種新型HCoV—中東呼吸綜合癥(Middle East Respiratory Syndrome, MERS)病毒[15]，使已知感染人的冠狀病毒增加到了6種，MERS-CoV和SARS-CoV也歸類為β類冠狀病毒。它們的出現(xiàn)意味著在野生動物宿主中新的、對人類有毒性的HCoVs不斷出現(xiàn)的可能。在2003年SARS出現(xiàn)之前，總共已知19種冠狀病毒，包括2種人類，13種哺乳動物和4種禽類冠狀病毒。SARS流行之后短短3年內(nèi)，科學(xué)家們又發(fā)現(xiàn)了20種新的冠狀病毒，包括3種人類，11種哺乳動物和6種禽類冠狀病毒[10]。香港科學(xué)家曾在蝙蝠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了8種不同種類的冠狀病毒。由于冠狀病毒存在跨種屬傳播機制，且是一類較為獨特的、具有高頻重組特點的RNA病毒[16]，高重組和高突變率的傾向使其容易去適應(yīng)新的宿主和生態(tài)小環(huán)境，并跨越宿主屏障，導(dǎo)致動物源性傳染病的暴發(fā)并帶來災(zāi)難性的后果。

從HCoV-HKU1的N基因和S基因的進化樹分析可以看出福州的2株都屬于HKU1的A基因型，與部分pol基因的進化樹分析結(jié)果[11]一致。ORF(open reading frams)7編碼N蛋白，冠狀病毒的N蛋白是一種磷酸化蛋白,與病毒基因組的RNA相結(jié)合,可能對RNA的轉(zhuǎn)錄、病毒的形態(tài)和在基因組的包裝中起重要的作用[17]；同時,在大多數(shù)的冠狀病毒中, 磷酸化的N蛋白可能對細胞周期起抑制作用[18]。ORF3編碼預(yù)測的S糖蛋白[1]，大多數(shù)S糖蛋白(殘基15-1300)暴露在病毒的外部，C端跨膜區(qū)為殘基1301-1356。S基因是基因組中最容易發(fā)生改變的地區(qū)之一，決定了病毒的進化枝(clade)。但在各亞型中，S基因序列是相對穩(wěn)定的。病毒在選擇壓力的作用下, 通常在其表面蛋白上的某些位點發(fā)生糖基化,從而改變其空間結(jié)構(gòu)。糖基化分析顯示, 在S蛋白上有28個潛在的糖基化位點[13]。有研究認為在美國科羅拉多，HKU1亞型隨著年份交替出現(xiàn)[16]，福州這2株都出現(xiàn)在同一年份。臨近的泰國[19]，HKU1的檢出率相近，為0.32%，3種基因型都有，多為基因型B；位于熱帶地區(qū)的馬來西亞[20]，HKU1的檢出率為1.1%，其中27.3%屬于基因型A，72.7%屬于基因型B。北京地區(qū)A[21]、B[22]兩種基因型都有檢出；在韓國檢出的11株中，3株為基因型A，8株為基因型B[23]。

顯然，目前的研究證明HCoV-HKU1在世界各國人群中持續(xù)流行并引發(fā)感染，兒童感染多于成人，并且多與其它呼吸道病毒一起混合感染人類。我們下一步將對成人嚴重急性呼吸道感染(SARI)患者中HCoV-HKU1感染情況進行檢測和分析，以便全面了解該病毒在本地區(qū)人群中的感染狀況、流行特征和系統(tǒng)進化情況。

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