，，2，，，，

利什曼原蟲所致的利什曼病，可分為內(nèi)臟利什曼病(又稱為黑熱病)、黏膜皮膚利什曼病和皮膚利什曼病。引起不同臨床類型的利什曼原蟲在形態(tài)結(jié)構(gòu)上沒(méi)有明顯差別，傳統(tǒng)方法對(duì)蟲株的鑒別主要依靠流行病學(xué)及臨床資料[1]?；诜肿友芯康姆椒ㄒ驯粡V泛運(yùn)用于微生物和寄生蟲的分類，相別于傳統(tǒng)方法，具有快速、準(zhǔn)確，且可與國(guó)內(nèi)外數(shù)據(jù)比對(duì)構(gòu)建進(jìn)化關(guān)系的特點(diǎn)。SSU rRNA是真核生物一個(gè)較保守的基因，但在原蟲的不同種間的變異比原核生物還要大，可用于原蟲種屬之間親緣關(guān)系的研究[2-3]。本文研究分析了陜西省韓城市利什曼原蟲標(biāo)本的SSU rRNA基因片段，與國(guó)內(nèi)外發(fā)表的該基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從分子水平確立陜西省利什曼原蟲種屬分類地位。

1 材料與方法

1.1 陜西省利什曼原蟲陽(yáng)性標(biāo)本

1.1.1蟲株標(biāo)本 采集病犬及病例骨髓標(biāo)本，以NNN培養(yǎng)基25 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，第10 d收集培養(yǎng)液鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)有前鞭毛體存在者為培養(yǎng)陽(yáng)性。取培養(yǎng)液用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen公司生產(chǎn))提取基因組DNA。

1.1.2病例標(biāo)本 3例有黑熱病疫區(qū)接觸史，癥狀典型的病例，取骨髓穿刺液，瑞氏染色，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)典型利杜體者為陽(yáng)性，取骨髓液用QIAamp DNA Mini Kit提取基因組DNA。

1.1.3媒介標(biāo)本 采集病區(qū)白蛉標(biāo)本，單只裝管，冷凍研磨砂，以天隆動(dòng)物組織基因組核酸提取試劑盒(西安天隆公司生產(chǎn))提取基因組DNA，以kDNA引物RV1、RV2及K13A、K13B[4]擴(kuò)增陽(yáng)性者作為媒介感染的陽(yáng)性標(biāo)本。

1.2 SSU rRNA基因序列擴(kuò)增及測(cè)序

1.2.1SSU rRNA引物及擴(kuò)增條件 參照文獻(xiàn)[5]，研究序列SSU rRNA的上游引物為R222：TATTGGAGATTATGGAGCTG；下游引物R333：AAAGCGGGCGCGCGGTGCTG。由上海生工公司合成。PCR試劑盒由Takara公司生產(chǎn)，反應(yīng)體系50 μL：10×PCR緩沖液5 μL，上下游引物各1 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP，各2.5 mmol/L)1 μL，加水補(bǔ)齊至47.6 μL，加入模板DNA 2 μL，100 ℃，解鏈10 min，再加入Taq酶(2.5 U)0.4 μL，再按照94 ℃ 75 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 60 s循環(huán)32次，最后72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物大小約395 bp。

1.2.2PCR產(chǎn)物測(cè)序 上述PCR產(chǎn)物由QIAxcel Advanced毛細(xì)管電泳儀(Qiagen公司生產(chǎn))進(jìn)行電泳檢測(cè)，條件為AM420，條帶清晰且產(chǎn)物大小符合目的序列的PCR產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行純化，雙向測(cè)序拼接，將拼接序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3SSU rRNA基因分析及系統(tǒng)發(fā)育樹 將獲得序列通過(guò)Blast查詢搜索，并參照文獻(xiàn)[5-6]下載國(guó)內(nèi)外利什曼原蟲的SSU rRNA基因序列，與本研究所獲得的序列共同構(gòu)成分析的文件數(shù)據(jù)庫(kù)。利用DNAStar軟件中的Megallign模塊進(jìn)行序列比對(duì)，分析突變區(qū)域堿基的變化情況，與文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道進(jìn)行比較。再利用Mega 6.06繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行同源性分析。

2 結(jié) 果

2.1SSU rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 獲得1份利什曼原蟲培養(yǎng)蟲株，1份犬骨髓、3份病例骨髓、2份白蛉共7份利什曼原蟲kDNA陽(yáng)性標(biāo)本。對(duì)7份標(biāo)本進(jìn)行SSU rRNA擴(kuò)增，毛細(xì)管電泳有5份標(biāo)本出現(xiàn)大小約400 bp的目的條帶，見圖1。來(lái)自白蛉的核酸標(biāo)本未擴(kuò)增出目的條帶，有3份標(biāo)本條帶較淡，有一份出現(xiàn)雜帶，未影響測(cè)序。將出現(xiàn)條帶的樣本進(jìn)行雙向測(cè)序，有3份標(biāo)本測(cè)序成功，分別為QB41-1、QB41-2(單向測(cè)序)、Niufei。

C2：QB41-1，C4：Niufei，C5：Niufei-2，C9：JXF，C10：QB41-2，A12：Marker圖1 SSU rRNA序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 SSU rRNA sequence amplification electrophoresis

對(duì)測(cè)序成功的3條序列提交GenBank，獲得登錄號(hào)分別為MG020105、MG020106、MG020107，下載文獻(xiàn)[3,7-8]中的序列以及通過(guò)Blast獲得的代表性利什曼原蟲的SSU rRNA序列，組成本研究所用的序列數(shù)據(jù)信息表如表1。

2.2 利什曼原蟲SSU rRNA序列分析

2.2.1序列同源性分析 利用DNAStar MegaAllign7.07進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)本研究的3條序列中有2條完全相同，另一條測(cè)序不完整。與GenBank登錄號(hào)為HQ895849和HQ895854的序列在第49位均為C、第92位均為A，與其余序列有3-4個(gè)核甘酸的差異，序列對(duì)比圖未列出，序列同源分析如圖2，可見陜西MG020106_QB41-1、MG020107_Niufei標(biāo)本與甘肅HQ895849和新疆HQ895854蟲株100%同源，與其余國(guó)內(nèi)利什曼原蟲同源性在98%以上。

表1 本研究所用的利什曼原蟲SSU rRNA序列信息

Tab.1 SSU rRNA sequence of Leishmania in this study

登錄號(hào)蟲株長(zhǎng)度來(lái)源MG020105?QB41-2365陜西韓城MG020106?QB41-1398陜西韓城MG020107?Niufei396陜西韓城HQ895845MHOM/CN/54/#3390北京HQ895846MHOM/CN/80/XJ801383新疆HQ895847MHOM/CN/?/GS4355甘肅HQ895849MHOM/CN/93/GS7393甘肅HQ895852MCAN/CN/86/SC7393四川HQ895853MHOM/CN/84/SD1393山東HQ895854IPHL/CN/77/XJ771394新疆HQ895859MHOM/CN/84/JS1392江蘇M80291L.adleri882肯尼亞M80292L.brazilensis883-M80293L.mexicana883-M84225L.tarentolae2195-M81430L.chagasi882-M81428L.aethiopia882-X53912L.amazonensis2138巴西X53915L.major2137蘇丹X53916L.tarentolae2137-X07773L.donovani2205蘇丹AF13836L.colombiensis546-CQ277631L.mexicana563-XR_001203206L.infantum387-

*為本研究測(cè)序序列，其余下載自GenBank

2.2.2利什曼原蟲SSU rRNA多變區(qū)段序列比較 將GenBank下載的序列與本研究的3條序列以Clustal W方法對(duì)齊，分析兩個(gè)獨(dú)特序列區(qū)UQ-I和UQ-II的序列點(diǎn)突變的情況，見表2?？梢婈兾?條序列點(diǎn)突變完全一致，不同于其余所有蟲株。僅與甘肅HQ895849、新疆HQ895854、 印度L.d.DD8、M81430、蘇丹X07773、XR_001203206蟲株在374位有一個(gè)點(diǎn)位突變，而與國(guó)內(nèi)其它蟲株的突變差異較大。另外，陜西省蟲株MG020105、MG020107在45、46位還有兩個(gè)堿基缺失。在與國(guó)外的蟲株比較中，在72位、312位、376附近還有堿基位點(diǎn)的變化，表中未列出。

表2 陜西省利什曼原蟲與國(guó)內(nèi)分離株SSU rRNA序列點(diǎn)突變的比較

Tab.2 Comparison of point mutations in Leishmania SSU rRNA sequences

蟲株UQ-IUQ-II475292353374MG020105CTATCMG020106CTATCMG020107CTATCHQ895854CTATTHQ895849CTATTHQ895845TTGACHQ895846TTGACHQ895847TTGACHQ895852TTGACHQ895853TTGACHQ895859TTGTCM81430CTATTX07773CTATTXR_001203206CTATTL.d.SD2TTGTTL.d.DD8CTATTL.d.SC6TTGACL.d.SC10TTGACL.d.GS7TGGAC

2.3基于SSU rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹 將本研究序列與GenBank下載的的SSU rRNA序列導(dǎo)入MEGA6.06，以Clustal W對(duì)齊后，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3，可見國(guó)內(nèi)利什曼原蟲聚為3支，陜西省的3條序列與杜氏利什曼原蟲HQ895854、HQ895849、X07773、夏科氏利什曼原蟲M81430以及嬰兒利什曼原蟲XR_001203206聚為一類。而其余來(lái)自北京、新疆、甘肅、四川等地的杜氏利什曼原蟲聚在另一支。1株來(lái)自江蘇的蟲株與墨西哥利什曼原蟲、碩大利什曼原蟲、亞馬遜利什曼原蟲聚為一支。

圖2 利什曼原蟲SSU rRNA序列同源比較Fig.2 Sequence distence of Leishmania SSU rRNA gene

圖3 基于利什曼原蟲SSU rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the SSU rRNA gene sequence of Leishmania

3 討 論

陜西省是我國(guó)黑熱病的傳統(tǒng)疫區(qū)，解放前后對(duì)人民群眾生命健康造成極大的危害。韓城市1967-2011年之間無(wú)病例發(fā)生。近年來(lái)在該地區(qū)屢見黑熱病病例報(bào)告，甚至出現(xiàn)小的暴發(fā)點(diǎn)[9]。但陜西省缺乏利什曼原蟲病原體的研究資料，2017年從韓城市病犬分離到1株利什曼原蟲，并獲得了數(shù)份利什曼原蟲PCR陽(yáng)性的標(biāo)本。本文采用了SSU rRNA基因作為研究序列，以韓城市犬只、白蛉、病例的標(biāo)本，對(duì)SSU rRNA基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序拼接，所獲得的3條序列分別來(lái)自犬只與病例，將序列與國(guó)內(nèi)外發(fā)表的SSU rRNA進(jìn)行對(duì)比分析，構(gòu)建了基于SSU rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明陜西省韓城市的標(biāo)本與杜氏利什曼原蟲、嬰兒利什曼原蟲以及夏科氏利什曼原蟲聚為一類。

SSU rRNA(核糖體小亞基RNA)具有一個(gè)rRNA分子，在真核生物為18S，其基因序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)是至今發(fā)現(xiàn)的最為保守的一類核糖體基因，以此構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，在分子水平上更適合反映原蟲的進(jìn)化關(guān)系。本研究利用SSU rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，陜西省的利什曼原蟲與新疆、甘肅、蘇丹的杜氏利什曼原蟲以及夏科氏利什曼原蟲、嬰兒利什曼原蟲聚類為一支。而國(guó)內(nèi)其余地區(qū)的利什曼原蟲則聚在另一支，一株來(lái)自江蘇的蟲株與墨西哥利什曼原蟲、碩大利什曼原蟲、亞馬遜利什曼原蟲聚為一支。與曹得萍[3]、Guan W[6]等人的研究結(jié)果一致，從SSU rRNA的序列發(fā)育樹來(lái)看，陜西省的原蟲與新疆、甘肅、蘇丹的杜氏利什曼原蟲以及嬰兒、夏科氏利什曼原蟲的遺傳關(guān)系近緣。此3類均是引起內(nèi)臟利什曼病的原蟲，世界衛(wèi)生組織建議將其歸屬于杜氏利什曼原蟲的種群[10]。Van Eys[4]等研究了9株利什曼原蟲的SSU rRNA序列，認(rèn)為其中存在2個(gè)獨(dú)特的的突變序列區(qū)，分別是1-148位的UQ-1，包括7個(gè)突變點(diǎn)，229-392位的UQ-II包括2個(gè)突變點(diǎn)。卜毅玲[7-8]等人研究了5株利什曼原蟲的SSU rRNA基因片段，發(fā)現(xiàn)在UQ-1上有3個(gè)堿基突變，UQ-II上有2個(gè)堿基突變。并認(rèn)為在UQ-II區(qū)中，只有山丘疫區(qū)存在2個(gè)點(diǎn)突變，與平原疫區(qū)的L.d.SD2也存在堿基序列上的不同，認(rèn)為我國(guó)山丘疫區(qū)與平原疫區(qū)存在種間的差異。本研究所分析的陜西省3條SSU rRNA序列不同于已發(fā)表的任何一條序列，特別是與國(guó)內(nèi)眾多利什曼原蟲序列突變位點(diǎn)差異較大，僅與HQ895854、HQ895849在374位有一個(gè)位點(diǎn)突變(T變C)。同時(shí)還與來(lái)自印度的L.d.DD8、蘇丹的X07773以及另一株夏科氏利什曼原蟲在同樣位點(diǎn)有突變(T變C)，不同的是，蘇丹的X07773和夏科氏蟲株在376位有C堿基的插入。這些突變與鄭學(xué)禮[11]等報(bào)道的新疆皮膚型利什曼原蟲也有明顯的差異。而蘆殿梅[12]等用RAPD證實(shí)，印度平原型標(biāo)準(zhǔn)株L.d.DD8與國(guó)內(nèi)荒漠型的HQ895854遺傳距離較近，HQ895854蟲株1977年分離自新疆塔里木碩大白蛉[3,7]，屬嬰兒利什曼原蟲。歷史資料表明，陜西省黃土高原病區(qū)屬犬源性疫區(qū)，病原體為嬰兒利什曼原蟲[13]。韓城市位于黃土高原與關(guān)中平原的交界地帶，流行學(xué)資料顯示犬只感染率高而人的感染率低，且以兒童發(fā)病較多，符合犬源性疫區(qū)特征，該疫區(qū)的原蟲應(yīng)為嬰兒利什曼原蟲[13-14]，與SSU rRNA序列分析研究結(jié)果一致。

陜西省關(guān)中平原地區(qū)的人源性利什曼原蟲疫區(qū)已消滅多年，陜北黃土高原及陜南山區(qū)偶有內(nèi)臟利什曼病散發(fā)[15-16]。韓城市位于黃土高原與關(guān)中平原交界地帶，自1967年以后再無(wú)病例報(bào)告，據(jù)郭曉莉[9]等報(bào)道，韓城市2012年暴發(fā)黑熱病之前，有人從外地引進(jìn)藏獒飼養(yǎng)，間隔45年再度出現(xiàn)利什曼病的流行，據(jù)報(bào)道[14,17]在犬源性疫區(qū)，野生動(dòng)物也參與了傳播過(guò)程，成為保存宿主之一。韓城的利什曼病是本地還是輸入入值得探討。雖然基于SSU rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹中陜西蟲株與新疆聚為一支，但突變位點(diǎn)來(lái)看與新疆1977年分離株有1個(gè)位點(diǎn)的差異，一方面SSU rRNA雖然可以代表一定的遺傳變異關(guān)系，但畢竟序列較少，仍有局限性存在，另一方面二者相隔分離時(shí)間相差40年，是距離年代久遠(yuǎn)的變異還是陜西的蟲株，由于缺乏陜西省利什曼原蟲本底資料，還需要進(jìn)一步的研究。

[1] 詹希美. 人體寄生蟲學(xué)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2010:80-87.

[2] Tenter AM. Current research on Sarcocyst is species of domestic animals[J]. J Parasitol. 1995, 25(11): 1311-1330．

[3] 曹得萍, 廖琳, 陳達(dá)麗,等. 利用SSU rRNA分子探討中國(guó)利什曼原蟲分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)[J]. 青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2013, 34(1):25-30.

[4] 汪俊云, 陳生邦, 高春花,等. 甘肅文縣嬰兒利什曼原蟲無(wú)癥狀感染犬的檢測(cè)[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2006, 22(8):734-737.

[5] van Eys GJ, Schoone GJ, Kroon NC, et al. Sequence analysis of small subunit ribosomal RNA genes and its use for detection and identification ofLeishmaniaparasites[J]. Mol Biochemic Parasitol, 1992, 51(1): 133-142.

[6] Guan W, Cao DP, Sun K, et al. Phylogenic analysis of ChineseLeishmaniaisolates based on small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) and 7 spliced leader RNA (7SL RNA)[J]. Acta Parasitologica, 2012, 57(2): 101-113. DOI: 10.2478/s11686-012-0022-9

[7] 卜玲毅, 胡孝素, 敬保遷,等. 利什曼原蟲中國(guó)分離株SSUrDNA多變區(qū)序列分析[J]. 寄生蟲病與感染性疾病, 2001, 9(1):1-3.

[8] 卜玲毅, 胡孝素, 敬保遷,等. 我國(guó)內(nèi)臟利什曼病山丘疫區(qū)與平原疫區(qū)利什曼原蟲SSUrDNA多變區(qū)序列分析[J]. 中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2000, 18(6):321-324.

[9] 郭曉莉, 薛小萍. 1例黑熱病臨床及其流行病學(xué)[J]. 醫(yī)藥前沿, 2016, 6(12):52-53.

[10] Schnur LF. Control of the leishmaniases. Report of a WHO Expert Committee. Technical Report Series 793[R]. WHO, 1990:25.

[11] 鄭學(xué)禮, 敬保遷. 新疆皮膚利什曼病病原體SSU rRNA基因克隆與序列分析[J]. 中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2000, 18(5):260-262.

[12] 蘆殿梅, 胡孝素, 喬中東,等. 用RAPD技術(shù)對(duì)利什曼原蟲kDNA、nDNA的分析[J]. 寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報(bào), 2002, 9(1):1-6.

[13] 管立人, 瞿靖琦, 柴君杰. 中國(guó)利什曼病的現(xiàn)狀和對(duì)開展防治工作的若干建議[J]. 疾病預(yù)防控制通報(bào), 2000(3):49-53.

[14] 金長(zhǎng)發(fā), 洪玉梅, 熊光華,等. 中國(guó)犬源性和野生動(dòng)物源性內(nèi)臟利什曼病的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志, 2007, 34(5):227-230.

[15] 景彩霞, 曹志敏. 延安市幼兒內(nèi)臟利什曼病1例[J]. 中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2014, 32(4):252-252.

[16] 薛亞娟, 劉志剛. 延安市2例內(nèi)臟利什曼病病例報(bào)道[J]. 中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志, 2016, 34(5):476-476.

[17] 陳凱, 伍衛(wèi)平, 官亞宜. 利什曼原蟲動(dòng)物宿主研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào), 2015, 31(5):462-466. DOI: 10.3969/ j.issn.1002-2694.2015.05.015