趙一丁,閆嬋娟,李文彬

(陜西省中醫(yī)醫(yī)院,西安 710003)

瘙癢的定義最早由德國醫(yī)生Samuel Hafenreffer于350年前提出[1],是一種可引發(fā)搔抓意愿和搔抓反射的特異性皮膚感覺,可由多種皮膚疾病和系統(tǒng)性疾病引起,臨床醫(yī)生通常將持續(xù)時間超過 6周的瘙癢定義為慢性瘙癢[2],其發(fā)生率隨年齡的增加而升高,嚴重影響患者的生活質量。由于瘙癢產(chǎn)生機制復雜,目前尚缺乏可以長期緩解的治療手段,大量研究證實針刺對瘙癢具有不同程度的抑制作用[3],但作用機制尚不清楚,本研究擬構建瘙癢動物模型,通過針刺穴位,觀察模型小鼠延髓β-內(nèi)啡肽(β-EP)的表達,以期探討針刺在對瘙癢調控過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康C57B/6J雄性小鼠50只,SPF級,6～8周齡,體重 20～25 g,由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供(許可證號SCXK2012-003)。飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境中,室溫控制在 18～24℃,濕度控制在50%～70%,光照時間 8:00—20:00,自由飲水進食。實驗過程中對實驗動物的處置均符合 2006年國家科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》規(guī)定。

1.2 主要儀器及試劑

1.2.1 主要儀器

冰凍切片機(德國 LAIKA)、超低溫冰箱(日本SANYO)、熒光顯微鏡(日本OLYMPUS)、臺式離心機(美國 Benchmark)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海生工生物工程股份有限公司)、蛋白垂直電泳槽(美國Biorad公司)、蛋白濕轉儀(美國Biorad公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)、攝像機(日本 SONY)、50 μL微注射器、0.25 mm×25 mm華佗牌一次性針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)、微計量器、血管鉗、手術刀、眼科剪等。

1.2.2 主要試劑

一 抗 Beta endorphin(66358-1-Ig,美 國Proteintech公司),Beta-actin(SC-47778,美國Santa Cruz Biotechnology公司),羊抗鼠二抗(31430,美國 PIERCE公司),羊抗兔二抗(31460,美國 PIERCE公司)、考馬斯亮藍R-250、Tween20(美國Amresco公司),兔IgG免疫組化試劑盒、抗熒光衰減封片劑、DAPI染色劑(武漢博士德生物工程有限公司),OCT包埋劑(武漢賽維爾生物技術有限公司),NC膜、BCA kit、Supersignalwest pico(美國PIERCE公司),RIPA蛋白裂解液(上海邦奕生物科技有限公司),Cocktail蛋白酶抑制劑(德國Roch公司),98%組胺二磷酸鹽,氯喹等。

1.3 動物分組與處理[4-5]

采用隨機數(shù)字表將50只C57B/6J小鼠隨機分為組胺組20只、氯喹組20只和空白對照組10只,其中組胺組和氯喹組又分為針刺組和非針刺組,每組10只。實驗前所有小鼠放入透明樹脂盒內(nèi)每天適應1 h,連續(xù)3 d。第3天適應結束后將組胺組和氯喹組小鼠頸背部(肩胛連線中點上方約5 mm處)皮膚刮毛。

組胺組小鼠,適應結束后第 1天置于透明樹脂盒內(nèi)適應1 h后于小鼠頸背部刮毛區(qū)皮內(nèi)注射磷酸組胺100 μL/只造模。第2天適應及給藥同第1天,給藥后針刺組隨即進行針刺干預,針刺組取雙側血海、曲池及合谷穴,小鼠穴位定位及針刺深度均參照《實驗針灸學》[6],將毫針直刺雙側血海、曲池及合谷穴2.5～3 mm,采用提插和捻轉手法刺激,留針時間為20 min,每日1次,共針刺2次。

氯喹組小鼠,適應結束后第 1天置于透明樹脂盒內(nèi)適應 1 h后于小鼠頸背部刮毛區(qū)皮內(nèi)注射氯喹50 μL/只造模。第 2天適應及給藥同第 1天,給藥后針刺組給予針刺干預,具體同組胺針刺組。

空白對照組:適應結束后不做任何處理，每日進行行為學觀察前需適應1 h。

1.4 取材

針刺后各組小鼠腹腔注射 2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉,固定在操作臺上,迅速開胸,提拉胸骨柄,完全暴露小鼠心臟,使用6號靜脈輸液器插入左心室后,用血管鉗固定好輸液器進針處,并夾閉心臟,剪開右心耳,打開靜脈輸液器最快滴速注入生理鹽水,觀察小鼠肝臟及腸管,待肝臟由紅色變?yōu)榘咨?腸管鼓脹,四肢及尾部僵直,迅速緊貼小鼠枕骨下用剪刀斷頭,剔除多余皮膚、肌肉組織,用彎鉗剪去顱骨,將大腦沿腹側剝出并置于冰面上,切除小腦后定位延髓上、下界,取延髓后切半,一半置于凍存管內(nèi)放入液氮罐中凍存,后移入﹣80℃冰箱中保存,用于 Western blot檢測;另一半置于 4%多聚甲醛固定液中固定,經(jīng) 30%蔗糖溶液脫水4 d,待組織沉底后在冰凍切片機中做水平切片,收集切片于防脫載玻片上,置于切片盒中 4℃冰箱保存用于免疫熒光檢測。

1.5 指標檢測

1.5.1 行為學觀察

各組小鼠均于適應結束后第1天開始放入透明樹脂盒子內(nèi)觀察小鼠行為學變化,連續(xù)觀察3 d。第1天組胺組和氯喹組于第1次頸部皮下注射致癢劑后觀察;第2～3天組胺針刺組和氯喹針刺組于針刺后觀察,組胺非針刺組和氯喹非針刺組行為學觀察時間同第1天。觀察過程中保持室內(nèi)安靜無人,攝像機錄像40 min,實驗結束后回放錄像觀察小鼠活動情況。瘙癢行為學觀察以搔抓次數(shù)作為評判方法,具體以小鼠后爪離開盒子底面并搔抓皮膚到其后爪落地或舔舐其后爪為1次完整的搔抓動作,在此期間不管搔抓多少次,均記為 1次[7],由2名不參加實驗的工作人員記錄小鼠搔抓次數(shù)。

1.5.2 免疫熒光檢測延髓β-EP能神經(jīng)元

將制備的延髓組織切片用含 0.3% TritonX-100的PBS洗1次,再用PBS洗3次,每次10 min,用10%羊血清封閉液封閉 30 min,之后甩干凈封閉液,晾干;一抗用PBS稀釋(1:200),4℃過夜,棄去一抗,用 0.3%TritonX-100洗2次,PBS洗1次,每次10 min;二抗用PBS稀釋,室溫孵育30 min,用0.3% TritonX-100洗2次,PBS洗1次,每次10 min;用稀釋的SABC-FITC室溫孵育30 min,0.3% TritonX-100洗2次,PBS洗1次,每次 10 min,用 DAPI染色劑染色 5 min,0.3%TritonX-100洗2次,PBS洗1次,每次10 min,最后加入抗熒光衰減封片劑加蓋玻片于熒光顯微鏡進行觀察。

1.5.3 Western blot檢測延髓β-EP的表達

取出﹣80℃冰箱保存的延髓組織,稱重后在研缽中倒入液氮,研碎組織塊后移入 EP管中,在管中加入RIPA蛋白裂解液(3 mL/g)、蛋白酶抑制劑Aprotinin,充分裂解后取上清液置于新 EP管內(nèi),冰上保存,將各樣品蛋白液1:50稀釋,參照BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白測定,每個樣品取相同質量的蛋白,加入5×loading buffer后沸水煮10 min使蛋白變性;將制備好的 10%凝膠板放入電泳槽內(nèi),倒入 1×running buffer,用細槍頭加樣,確定加樣順序和計算加樣量;將電泳槽與電源連接好,以90 V穩(wěn)壓狀態(tài)電泳,當溴酚藍進入分離膠時將電壓調整至100 V,待溴酚藍電泳至分離膠底部停止電泳;按方向依次放好濾紙、膠、膜,直至整個夾板保持緊密,用含5%脫脂奶粉的TBS封閉,可在室溫封閉 4 h;結合一抗,在 4℃過夜,HTR2B(1:1000),室溫漂洗3次,每次10 min,結合二抗,室溫結合 2 h;羊抗鼠二抗(1:10000)、羊抗兔二抗(1:10000),室溫漂洗 3次,每次 10 min,最后一次用TBS漂洗以去除吐溫;化學發(fā)光,于暗室中曝光操作,梯度曝光10 s至5 min。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SAS9.3統(tǒng)計軟件進行分析處理。計量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標準差表示,兩組之間比較采用t檢驗,多組之間比較采用one-way ANOVA,所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組干預后小鼠搔抓次數(shù)比較

組胺組及氯喹組模型動物搔抓次數(shù)均明顯高于空白對照組,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),可作為成功建立瘙癢模型的指征;針刺對組胺組及氯喹組動物搔抓行為均具有抑制作用,氯喹針刺組搔抓次數(shù)低于氯喹非針刺組(P＜0.05),組胺針刺組搔抓次數(shù)明顯低于組胺非針刺組(P＜0.01),氯喹非針刺組搔抓次數(shù)高于組胺針刺組(P＜0.01)。詳見表1。

2.2 各組干預后延髓β-EP能神經(jīng)元表達比較

免疫熒光結果顯示,空白對照組及組胺非針刺組延髓β-EP能神經(jīng)元表達均不明顯(見圖1 A、E);組胺針刺組延髓β-EP能神經(jīng)元表達數(shù)量略有增加,氯喹針刺組及氯喹非針刺組延髓β-EP能神經(jīng)元均有一定的表達,延髓β-EP呈點狀、條索形或不規(guī)則狀分布(見圖1 B、C、D)。

表1 各組干預后搔抓次數(shù)比較 (x ±s,次/40 min)

2.3 各組干預后延髓β-EP蛋白表達比較

Western blot結果顯示,氯喹針刺組、氯喹非針刺組及組胺針刺組延髓β-EP表達均明顯高于空白對照組(P＜0.01),組胺非針刺組延髓β-EP表達與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),組胺針刺組延髓β-EP表達明顯高于組胺非針刺組(P＜0.01),氯喹針刺組與氯喹非針刺組延髓β-EP表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表2、圖2。

表2 各組干預后延髓β-EP表達比較 (x±s)

圖2 各組干預后延髓β-EP表達

3 討論

瘙癢是許多皮膚疾病常見而棘手的臨床表現(xiàn),如特應性皮炎、蕁麻疹、皮膚瘙癢癥、銀屑病等。中醫(yī)學認為瘙癢由風、濕、熱、蟲、毒之邪氣郁于皮膚腠理之間,使其氣血不和,膚失濡養(yǎng),郁生微熱所致,或由于血虛風燥阻于皮膚,肌膚失養(yǎng),內(nèi)生虛熱而發(fā)[8-9]。針灸通過穴位刺激可以激發(fā)機體的自愈能力,達到疏風解表、清熱祛濕、殺蟲止癢、調和氣血的作用[10-11],本研究取曲池、合谷,屬手陽明大腸經(jīng),乃多氣多血之經(jīng),善于開泄,能疏泄蘊于肌膚之邪,達到開腠理、疏風清熱止癢的作用,血海屬足太陰脾經(jīng)穴,為血會,具有理血活血、散風除濕的作用,“治風先治血,血行風自滅”。針刺對瘙癢性皮膚病具有很好的療效及安全性,對于針刺止癢的機制研究主要圍繞外周瘙癢介質展開[12-14],針刺對中樞神經(jīng)元、瘙癢信號及其分子機制尚不清楚。

瘙癢與疼痛同為傷害性刺激,延髓頭端腹內(nèi)側核作為中樞調制系統(tǒng)中下行抑制系統(tǒng)的重要組成部分,參與多種神經(jīng)遞質對感覺的調控,RVM區(qū)神經(jīng)元在脊髓水平傷害性信號的傳導中具有重要的作用[15]。阿片類物質是具有鎮(zhèn)痛作用的一類特殊的神經(jīng)肽,內(nèi)源性阿片活性物質的代表是內(nèi)啡肽及強啡肽,廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng),其中β-EP是由31個氨基酸組成的阿片類物質,β-EP通過與其特異性受體μ-阿片類受體(μ opioid receptor,MOR)結合,可以抑制電壓依賴的Ca2﹢通道開放和腺苷環(huán)化酶活化,同時激活K﹢通道,降低神經(jīng)細胞興奮性,從而抑制痛覺[16-18],同時 MOR的異構體 MOR1D(morphine receptor-1D)與胃泌素釋放肽受體形成異二聚體,傳導瘙癢信號產(chǎn)生癢覺[19]。

本研究結果顯示針刺對組胺致癢及氯喹致癢動物模型搔抓行為均具有抑制作用,對組胺致癢動物模型延髓β-EP的表達具有明顯的上調作用,對氯喹致癢動物模型β-EP的表達影響不明顯,但氯喹致癢動物模型β-EP表達明顯高于空白對照組,說明無論針刺與否β-EP均參與氯喹誘導的非組胺依賴性瘙癢的產(chǎn)生。而組胺致癢動物模型延髓β-EP的表達與針刺密切相關,這可能與針刺誘發(fā)模型動物痛覺產(chǎn)生有關,有研究顯示,辣椒素局部注射可引起痛覺過敏,在出現(xiàn)痛覺過敏的皮膚內(nèi)注射致癢劑,可發(fā)現(xiàn)瘙癢強度減低,癢覺超敏和癢覺過敏消失[20],亦有研究顯示破壞大鼠脊髓背角瘙癢相關神經(jīng)元可以減少慢性疼痛和痛覺過敏[21-24],均反映了疼痛和瘙癢可能共用—部分神經(jīng)通路,故本研究中針刺誘發(fā)疼痛使β-EP表達反饋性增加,同時抑制癢覺的產(chǎn)生,存在疑問的是本研究中β-EP的表達增加沒有引起搔抓行為的增加,可能與針刺穴位、手法、刺激量、刺激時間均存在聯(lián)系,有待進一步深入研究。

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