王慶國 李臻 劉煒 潘教文

摘要：谷子是我國的傳統(tǒng)優(yōu)勢作物，具有抗旱、耐瘠薄、高光效以及基因組小、生育期短等突出優(yōu)勢，受到國際遺傳學(xué)界的高度重視，已迅速發(fā)展成為功能基因組研究新的候選模式作物。但目前在蛋白質(zhì)水平上解析谷子干旱響應(yīng)的研究還較少。本研究利用TMT（tandem mass tags）體外同重同位素標(biāo)記的相對與絕對定量技術(shù)，篩選并鑒定谷子干旱響應(yīng)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)谷子干旱響應(yīng)差異蛋白主要參與脅迫響應(yīng)、碳代謝、光合作用和蛋白合成等相關(guān)代謝途徑。該研究對于深入解析谷子的抗旱機(jī)制，培育抗旱耐逆谷子新品種具有重要意義。

關(guān)鍵詞：谷子；干旱脅迫；蛋白質(zhì)組；GO分析

中圖分類號：S515+Q51文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）04-0001-08

Abstract Foxtail millet is the traditional dominant crop in China. It has many outstanding advantages including drought resistance， poor soil tolerance， high photosynthetic efficiency， small genome and short growth period. The international field of genetics has paid more attention to it. It has been rapidly developed as the new candidate mode crop to study functional genomes. But there were less studies on the drought response of foxtail millet from protein level analysis at present. In the study， the drought response proteins of foxtail mille were screened and indentified by TMT technology. The results found that differential proteins in drought response of foxtail mille mainly participated in related metabolic pathways including stress response， carbon metabolism， photosynthesis and protein synthesis. This study was of great significance to deeply analyzing drought resistance mechanism and breeding new varieties of foxtail millet with drought and adversity resistance.

Keywords Foxtail millet； Drought stress； Proteomics； Gene ontology （GO） analysis

谷子（Setaria italica L. Beauv.）又稱粟，去殼后為小米，是起源于我國的傳統(tǒng)優(yōu)勢作物，也是糧飼兼用作物，種植面積占世界的80%。谷子在我國各省區(qū)幾乎都能種植，主產(chǎn)區(qū)為東北、華北及西北地區(qū)。在北方干旱省份仍是重要糧食作物，在一些地區(qū)甚至是首要栽培作物。谷子具有抗旱耐貧瘠的特點，其營養(yǎng)保健價值、國際競爭力和產(chǎn)量潛力均被重新認(rèn)識[1，2]。谷子不僅在目前旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)中有重要作用，而且針對日益嚴(yán)重的水資源短缺，谷子還是重要的戰(zhàn)略儲備作物，在我國國民經(jīng)濟(jì)中具有重要地位。

谷子與玉米、高粱、甘蔗、珍珠粟、糜子、柳枝稷等禾谷類糧食、能源作物近緣，具有抗旱、耐瘠薄、高光效以及基因組小、生育期短等突出優(yōu)勢。但長期以來谷子未受到國際科學(xué)界的關(guān)注，其遺傳學(xué)研究相對滯后[3]。進(jìn)入21世紀(jì)以來，谷子因其獨特的優(yōu)勢而逐步受到國際遺傳學(xué)界的高度重視，迅速發(fā)展成為功能基因組研究新的候選模式作物[4]。隨著2012年谷子基因組測序工作的完成及相關(guān)序列信息的釋放，在傳統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合目前迅速發(fā)展的分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)，使從基因組入手對谷子進(jìn)行有目的、有針對性的品質(zhì)、性狀研究及相關(guān)機(jī)制的解析成為可能[3]。通過以谷子為模式作物開展功能基因研究，不僅可以彌補相關(guān)作物基因組復(fù)雜、植株高大和繁殖期過長的不足，還能為解決多年來難以解析的抗旱和C4光合作用的遺傳分子機(jī)理提供嶄新的機(jī)遇，而且可以為研究作物的馴化和改良、抗旱性的遺傳機(jī)制、植物系統(tǒng)進(jìn)化和應(yīng)用價值基因的分離和克隆提供獨特的視角和思路[1-5]。

谷子在響應(yīng)干旱脅迫時，一些保守的抗逆基因以及相關(guān)的代謝途徑均發(fā)揮重要的作用，其中包括LEA蛋白、脫水素、乙醇脫氫酶、脯氨酸、淀粉、蔗糖等物質(zhì)的代謝積累[1，3]。另外ABA響應(yīng)元件結(jié)合蛋白AREB、MYC/MYB、CBF、NAC以及WRKY等轉(zhuǎn)錄因子在谷子的抗旱信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中也起著非常重要的作用[3]。SiNAC和SiDREB2的表達(dá)能明顯受到干旱、鹽漬的誘導(dǎo)[6，7]。同時，SiNAC和SiWD40基因家族中很多成員都參與谷子非生物脅迫響應(yīng)[8，9]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，谷子中含有20個乙醛脫氫酶ALDH基因，其中SiALDH7B1、SiALDH12A1和SiALDH18B2的表達(dá)能明顯地被滲透脅迫、低溫、H2O2和ABA所誘導(dǎo)，將SiALDH2B2、SiALDH10A2、SiALDH5F1、SiALDH22A1和SiALDH3E2分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E. coli）后能明顯提高其鹽脅迫抗性。這些結(jié)果表明SiALDH蛋白對于提高谷子的脅迫抗性具有重要作用[10]。類受體蛋白激酶SiRLK35的表達(dá)明顯地受到NaCl和PEG處理的誘導(dǎo)。在原核菌株中誘導(dǎo)表達(dá)SiRLK35能明顯增強(qiáng)菌株對鹽脅迫的抗性，而且在水稻中過表達(dá)SiRLK35能明顯增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻的抗鹽性[11-13]。通過對干旱脅迫后的谷子轉(zhuǎn)錄組深度測序分析，發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)的基因，其中24-nt siRNA對干旱響應(yīng)基因的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用，一些長鏈非編碼RNAs（long noncoding RNAs， lncRNAs）也參與干旱脅迫響應(yīng)[14]。對谷子基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，谷子中含有1 517個特異的基因家族，這些基因家族中很多都與脅迫響應(yīng)相關(guān)。其中一個包含586個成員的基因家族與水分脅迫相關(guān)，推測這些特異基因可能對于谷子的干旱耐性及抗性具有決定性的作用[3]。因此，篩選并研究谷子抗逆基因，尤其是抗旱相關(guān)基因已成為目前的研究熱點。

TMT（tandem mass tags）技術(shù)是一種體外同重同位素標(biāo)記的相對與絕對定量技術(shù)，分別通過與氨基酸末端氨基以及賴氨酸殘基的游離氨基結(jié)合，實現(xiàn)對多肽的標(biāo)記，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時比較多個樣品之間的蛋白表達(dá)量，是近年來定量蛋白質(zhì)組學(xué)常用的高通量篩選技術(shù)[15，16]。本研究利用TMT技術(shù)篩選參與谷子干旱脅迫響應(yīng)的蛋白，對于深入解析谷子的抗旱機(jī)制，進(jìn)一步指導(dǎo)谷子耐旱抗逆新品種的培育具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 谷子干旱處理

以谷子測序品種“豫谷1號”為材料，種子精選后，播種于花盆中，每個花盆裝3 kg營養(yǎng)土和沙子（其中營養(yǎng)土和沙子的比例是1∶1），在溫室中培養(yǎng)，光周期為14 h，溫度為30/25℃（日/夜）。正常生長3周后，通過控制土壤含水量進(jìn)行干旱處理，其中對照組含水量控制在60%～70%，干旱組含水量控制在20%～30%，每個處理做2個重復(fù)。經(jīng)干旱處理2周后取材，材料經(jīng)液氮迅速冷凍，保存-80℃超低溫冰箱備用。

1.2 利用TMT技術(shù)篩選參與谷子干旱響應(yīng)蛋白

與杭州景杰生物科技有限公司進(jìn)行合作，進(jìn)行了蛋白質(zhì)組的相關(guān)試驗及數(shù)據(jù)分析，結(jié)合GO注釋（包括細(xì)胞組成、分子功能、生物過程）、蛋白結(jié)構(gòu)域注釋、代謝通路注釋以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位分析，對篩選出的差異蛋白進(jìn)行分析及歸類。

2 結(jié)果與分析

2.1 MS數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制

首先對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行有效性分析，結(jié)果如圖1A所示，鑒定到的所有蛋白分子量偏差主要集中在0附近，絕大多數(shù)都小于0.02 D，說明質(zhì)譜數(shù)據(jù)符合要求。多肽的長度主要集中在8～16之間（圖1B），這與胰蛋白酶分解成的肽段相符合，說明樣品制備達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 數(shù)據(jù)分析

在谷子干旱后的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中共鑒定到4 074個蛋白點，其中有2 474個蛋白可進(jìn)行定量分析，相對表達(dá)量超過1.5定義為上調(diào)蛋白，相對表達(dá)量低于1/1.5（0.67）定為下調(diào)蛋白，其中上調(diào)蛋白有252個，下調(diào)蛋白有69個，表達(dá)變化明顯的總共有321個蛋白。

2.3 蛋白功能富集分析

對差異表達(dá)蛋白結(jié)合功能注釋，進(jìn)行功能富集分析，對谷子響應(yīng)干旱脅迫的蛋白進(jìn)行功能劃分。在差異表達(dá)蛋白的功能富集分析中，應(yīng)用費歇爾確切檢驗法進(jìn)行了定義：如果假設(shè)檢驗值P﹤0.05，那么認(rèn)為該蛋白是顯著富集的。

2.3.1 Gene ontology （GO）富集分析 在GO富集分析中，首先，我們可以統(tǒng)計出顯著差異表達(dá)蛋白在每個GO分類上的數(shù)量a和所有鑒定到的蛋白在每個GO分類上的數(shù)量b。然后統(tǒng)計出在GO分類注釋中所有顯著差異表達(dá)的數(shù)c，以及所有鑒定到的蛋白數(shù)d。最后，我們根據(jù)這四個數(shù)值（a， b， c， d）去計算費歇爾確切檢驗P值和富集倍數(shù)Fold enrichment=（a/c）/（b/d）。如圖2所示，在GO富集分析中，biological process中主要富集在metabolic process 和cellular process這兩類中，cellular component中主要富集在membrane-enclosed lumen、organelle、macromolecular complex和cell這四類中，而 molecular function中主要富集在structural molecule activity這類中。

2.3.2 聚類分析 為進(jìn)一步挖掘谷子經(jīng)干旱脅迫后的蛋白數(shù)據(jù)變化情況，基于蛋白功能富集分析又進(jìn)一步進(jìn)行了聚類分析，在biological process中，上調(diào)的蛋白主要聚類在cellular metabolic process、response to stress和biosynthetic process等（圖3）。聚類在cellular metabolic process的蛋白主要參與光合作用、碳代謝和蛋白合成等過程。聚類在response to stress中的蛋白主要包括abscisic stress-ripening protein （ASR）、non-specific lipid-transfer protein （nsTLP）、抗氧化還原酶蛋白、Hsp蛋白等。聚類在biosynthetic process中的主要包括蛋白合成相關(guān)的蛋白如核糖體蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等，ATP合酶蛋白、多胺合成酶蛋白、氨基酸合成相關(guān)蛋白、脯氨酸合成酶蛋白等。

在cellular component中，上調(diào)的蛋白主要聚類在cell part、ribosome、plasma membrane等（圖4）。聚類在plasma membrane的蛋白主要包括脅迫響應(yīng)蛋白、碳代謝相關(guān)蛋白等。下調(diào)的蛋白主要聚類在photosystem Ⅰ，如photosystem Ⅰ reaction center subunit和thylakoid membrane phosphoprotein。

在molecular function中，上調(diào)的蛋白主要聚類在catalytic activity、structural molecule activity和coenzyme binding等（圖5），聚類在catalytic activity的蛋白主要包括脅迫相關(guān)的抗氧化酶類、光合作用和碳代謝過程中的催化酶類以及各種代謝相關(guān)的酶類。聚類在structural molecule activity的蛋白主要包括核糖體小亞基蛋白和微管蛋白。

2.3.3 KEGG代謝途徑分析 在KEGG分析中，我們首先計算每個途徑中表達(dá)變化的蛋白數(shù)（a）和該途徑中的所有可定量的總蛋白數(shù)（b），然后統(tǒng)計在KEGG途徑中所有表達(dá)變化的蛋白數(shù)（c）和所有可定量的蛋白數(shù)（d）。最后，結(jié)合這四個數(shù)值（a， b， c， d）去計算費歇爾確切檢驗P值和富集倍數(shù)Fold enrichment=（a/c）/ （b/d）。結(jié)果如圖6所示，表達(dá)上調(diào)的蛋白主要富集在carbon fixation in photosynthetic organisms、ribosome、carbon metabolism、protein processing in endoplasmic reticulum、pyruvate metabolism、glyoxylate and dicarboxylate metabolism、photosynthesis-antenna proteins、glycolysis/gluconeogenesis、biosynthesis of amino acids 和tryptophan metabolism。下調(diào)蛋白主要富集在phenylalanine metabolism、phenylpropanoid biosynthesis、photosynthesis、metabolic pathways和oxidative phosphorylation。

2.3.4 蛋白結(jié)構(gòu)域功能富集分析 蛋白結(jié)構(gòu)域功能富集分析方法與GO富集分析方法相同。如圖7所示，上調(diào)表達(dá)的蛋白主要富集在NAD（P）-binding domain、alpha crystallin/Hsp20 domain、Hsp20-like chaperone、Thioredoxin-like fold、Thioredoxin domain等，下調(diào)表達(dá)的蛋白主要富集在Heat shock protein DnaJ、cysteine-rich domain。

3 討論

近年來，隨著全球氣溫的升高和淡水資源的匱乏，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展對作物品種提出了更高的要求，培育耐旱、耐瘠薄的作物新品種，不僅有利于旱作農(nóng)業(yè)的發(fā)展，還可以減少化肥用量，對生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。谷子作為我國的傳統(tǒng)優(yōu)勢作物，具有抗旱、耐貧瘠和高光效等突出優(yōu)勢，谷子特殊的生理特點：葉面積小、細(xì)胞壁較厚、根系發(fā)達(dá)都賦予谷子突出的水分利用效率和耐逆性[17]。2012年谷子基因組公布后，作為一種新興的模式作物，谷子逐漸被國內(nèi)外的專家學(xué)者所接受。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、生物信息學(xué)等手段，谷子抗逆、發(fā)育相關(guān)的基因被大量挖掘出來，但相關(guān)數(shù)據(jù)還是很有限，而本實驗室利用TMT蛋白定量分析方法解析了谷子經(jīng)干旱脅迫后的蛋白組學(xué)變化，分析了參與谷子干旱響應(yīng)的蛋白，具有重要的意義。

本研究共鑒定到差異蛋白321個，其中上調(diào)的蛋白252個，下調(diào)的69個，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些表達(dá)變化的蛋白參與細(xì)胞代謝的各個途徑。其中包括一些脅迫響應(yīng)蛋白如late embryogenesis abundant （LEA） protein、heat shock protein（Hsp），這些蛋白的積累能有效保護(hù)細(xì)胞的正常代謝，Hsp作為分子伴侶促進(jìn)蛋白的正常折疊。植物在受到脅迫后會產(chǎn)生大量的ROS，抗氧化酶能有效地清除多余的ROS，谷子在受到干旱脅迫后POD、SOD、CAT、APX和GST等抗氧化酶蛋白明顯增加，有助于清除ROS，避免了過量ROS積累對植物造成的危害。植物在響應(yīng)脅迫過程中，需要啟動一系列的響應(yīng)反應(yīng)和代謝變化，因此這個過程中需要消耗大量的能量，在本研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)了大量與能量代謝相關(guān)的蛋白有明顯的積累，其中光合作用碳固定過程、糖酵解、三羧酸循環(huán)和呼吸鏈上相關(guān)的催化酶和蛋白都有所增加，這些蛋白的積累能有效地增強(qiáng)胞內(nèi)的能量代謝，為谷子脅迫響應(yīng)提供充足的能量。參與代謝合成過程的催化酶和合成酶蛋白也有不同程度的積累，包括脯氨酸、甜菜堿、胼胝質(zhì)合成酶、脂肪酸、氨基酸、脂質(zhì)代謝相關(guān)酶類等。這些物質(zhì)的積累與代謝都對增強(qiáng)植物對干旱脅迫的響應(yīng)及抗性具有重要作用。

本研究在分析谷子干旱響應(yīng)蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)上，將進(jìn)一步解析關(guān)鍵脅迫響應(yīng)因子，克隆抗旱相關(guān)的基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合生理生化分析，對基因的功能及作用機(jī)制進(jìn)行解析，為作物新品種培育及旱作農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供基因資源和理論基礎(chǔ)。

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