孫淑琴 孫冰冰 楊秀榮 張惟 霍建飛

摘要：解淀粉芽孢桿菌Bs-18是一株對黃瓜白粉病具有顯著防效的生防菌株，為深入研究此菌株的生防作用機(jī)理，本研究應(yīng)用電擊法構(gòu)建了攜帶轉(zhuǎn)座子TnYLB-1的穿梭質(zhì)粒pMarA轉(zhuǎn)化Bs-18的突變體文庫。通過對轉(zhuǎn)座溫度和轉(zhuǎn)座時間的篩選，篩選出50℃高溫誘導(dǎo)16 h可獲得最大轉(zhuǎn)座成功率，并對突變體進(jìn)行了PCR驗(yàn)證。Bs-18突變體文庫的構(gòu)建為研究其生防功能基因并深入揭示其生防作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：突變體文庫；轉(zhuǎn)座子；生防功能基因

中圖分類號：S476.1+Q785文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）04-0012-04

Abstract Bacillus amyloliquefaciens Bs-18 is a biocontrol strains against cucumber powdery mildew with significant control effect. In this paper， the mutant library of Bs-18 was constructed with the shuttle plasmid pMarA carrying transposon TnYLB-1 by the electric shock method to deeply study the molecular mechanism of the biocontrol strain. Through screening transpositional temperature and time， the maximum transpositional success rate was obtained after induced at 50℃ for 16 hours. The mutants were verified by PCR. The construction of Bs-18 mutant library laid a foundation for further study on its biocontrol function genes and mechanism.

Keywords Mutant library； Transposon； Biocontrol function genes

隨著許多微生物基因組全序列的獲得，人們對微生物關(guān)注和研究的熱點(diǎn)逐漸從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)移到功能基因組學(xué)上。轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變技術(shù)因操作簡單逐漸成為研究功能基因組（如發(fā)現(xiàn)新基因、克隆功能基因、發(fā)掘已知基因的新功能）的一種有效工具。目前利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)突變技術(shù)對于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的研究較為深入，并且獲得了與芽孢形成、生物被膜形成以及植物與微生物互作等相關(guān)基因[1，2]。隨著對轉(zhuǎn)座子技術(shù)研究的深入，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）在這一領(lǐng)域的工作也逐漸展開。郝建安等[3]通過對解淀粉芽孢桿菌Mu轉(zhuǎn)座突變子進(jìn)行表型篩選，并結(jié)合克隆和測序發(fā)現(xiàn)了2個新的抑菌作用調(diào)節(jié)基因rpmGA和yxlC。高衛(wèi)華等[4]對1株野生型解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行了mini-Tn10 轉(zhuǎn)座突變庫的構(gòu)建，根據(jù)菌落形態(tài)差異進(jìn)行初篩，利用結(jié)晶紫染色法篩選生物被膜缺陷菌株，由此發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌生物被膜形成相關(guān)基因。從突變庫中篩選到4株生物被膜缺陷株，經(jīng)過鑒定發(fā)現(xiàn)突變株citB、citG、gpsA和yvfB基因發(fā)生插入突變，其中citB、citG 和gpsA均與能量代謝相關(guān)，yvfB基因功能未知。由此可見，轉(zhuǎn)座突變技術(shù)已成為發(fā)現(xiàn)功能基因的一種有效手段。穿梭質(zhì)粒載體 pMarA 上攜帶轉(zhuǎn)座子 TnYLB-1，它具有轉(zhuǎn)座頻率高、插入穩(wěn)定、隨機(jī)插入、非寄主專化性等優(yōu)點(diǎn)，已成為人們研究細(xì)菌基因功能的首選轉(zhuǎn)座子。

Bs-18是本實(shí)驗(yàn)室分離自黃瓜根系的微生物，大田防治試驗(yàn)表明其對黃瓜白粉病的防效達(dá)79%，經(jīng)生理生化和分子鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。本研究以攜帶轉(zhuǎn)座子TnYLB-1的質(zhì)粒pMarA為插入質(zhì)粒，通過電擊法轉(zhuǎn)化野生生防菌株Bs-18，篩選高溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座的最佳溫度和時間，從而構(gòu)建Bs-18的轉(zhuǎn)座插入突變體文庫，為研究其生防功能基因及深刻揭示生防解淀粉芽孢桿菌的生防作用機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 菌株Bs-18（B. amyloliquefaciens Bs-18）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。質(zhì)粒pMarA購自BGSC中心。

1.1.2 引物 本試驗(yàn)引物合成和序列測定均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.1.3 試劑 DL2000、MIX等分子試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；卡那霉素（Kan）、紅霉素（Erm）購自上海生工生物工程有限公司；蛋白胨、牛肉浸膏等其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化生防解淀粉芽孢桿菌Bs-18

1.2.1 質(zhì)粒pMarA轉(zhuǎn)化Bs-18菌株 挑取單菌落Bs-18接種于5 mL試管中，37℃、160 r/min搖床過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)液按1%接種量接種于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至OD600為0.65左右。將培養(yǎng)好的菌液冰浴20 min。4℃、8 000 r/min離心2 min，收集菌體。加入10 mL預(yù)冷的 ddH2O清洗菌體細(xì)胞3次。再加入ddH2O重懸菌體，制得感受態(tài)細(xì)胞。在100 μL感受態(tài)細(xì)胞中加入1 μL質(zhì)粒pMarA，均勻混合，將混合物移至預(yù)冷的電擊杯中，以1.1 kV電壓，電穿孔儀BIO-RAD進(jìn)行脈沖電擊（電阻200 Ω，電容25 μF），電擊后迅速加入400 μL復(fù)蘇培養(yǎng)基，37℃溫浴60 min，涂布含Kan（50 μg/mL）和Erm（10 μg/mL）的雙抗平板，37℃培養(yǎng)過夜，第二天挑取平板上的轉(zhuǎn)化子Bs18-MA[5-7]。

1.2.2 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證 從轉(zhuǎn)化平板上挑選轉(zhuǎn)化子，接種于含Kan（50 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，使用離心柱型質(zhì)粒小提試劑盒提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒。

使用引物oAtnpFwd、oAtnpRev擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子中的HimarⅠ轉(zhuǎn)座酶編碼基因片段。

使用引物Km-F和Km-R擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子中的卡那霉素抗性基因片段。

以上驗(yàn)證均以質(zhì)粒pMarA作為陽性對照，以Wt作為陰性對照，擴(kuò)增程序?yàn)椋?6℃ 2 min；94℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 2 min，30 cycles；72℃ 10 min；4℃ forever[8]。

1.3 高溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子TnYLB-1轉(zhuǎn)座

1.3.1 轉(zhuǎn)座子TnYLB-1轉(zhuǎn)座條件的優(yōu)化 挑取轉(zhuǎn)化子于LB（Kan 50 μg/mL，Erm 10 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。將菌液系列稀釋至10-3～10-6，取100 μL涂布LB （Kan 50 μg/mL）平板，將平板置于不同溫度條件下（分別設(shè)45、46、47、48、49、50℃溫度梯度），分別處理不同時間（4、10、16、22 h）。用無菌牙簽挑取LB平板上的同一單菌落分別點(diǎn)種于Erm和Kan抗性平板上，進(jìn)行原位生長比較試驗(yàn)。具有Kan抗性而缺失Erm抗性的菌株即為TnYLB-1轉(zhuǎn)座插入Bs-18菌株基因組的突變子，挑取突變子構(gòu)建菌株Bs-18的突變體文庫[9]。

轉(zhuǎn)座成功率（%）=（K-E）/K×100

式中K∶代表卡那霉素平板上的菌落數(shù)，E∶代表紅霉素平板上的菌落數(shù)。

1.3.2 突變體的驗(yàn)證 從Bs-18的突變體文庫中隨機(jī)挑取12個突變體，提取基因組DNA，用引物oITR 擴(kuò)增突變體基因組的TnYLB-1轉(zhuǎn)座子片段，驗(yàn)證TnYLB-1轉(zhuǎn)座子片段是否成功插入到Bs-18的基因組中。以質(zhì)粒pMarA作為陽性對照，以Wt作為陰性對照，擴(kuò)增程序?yàn)椋?6℃ 2 min；94℃ 45 s，66℃ 1 min，72℃ 2 min，30 cycles；72℃ 10 min；4℃ forever。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bs-18的轉(zhuǎn)化

將攜帶TnYLB-1轉(zhuǎn)座子的穿梭質(zhì)粒pMarA轉(zhuǎn)化入解淀粉芽孢桿菌Bs-18的感受態(tài)細(xì)胞中，獲得數(shù)個轉(zhuǎn)化子Bs18-MA。使用離心柱型質(zhì)粒小提試劑盒提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒。通過引物oAtnpFwd-oAtnpRev擴(kuò)增質(zhì)粒中的HimarⅠ轉(zhuǎn)座酶編碼基因（如圖1A），待驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子4—6均得到約為1.5 kb的片段，與質(zhì)粒pMarA得到的片段一致，而Wt沒有擴(kuò)增出條帶。又通過引物Km-F、Km-R擴(kuò)增質(zhì)粒中的卡那霉素抗性基因（如圖1B），

待驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子2—4得到了與質(zhì)粒pMarA一致的片段，而Wt沒有擴(kuò)增出此條帶。以上驗(yàn)證結(jié)果表明，質(zhì)粒pMarA已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到菌株Bs-18中，轉(zhuǎn)化子Bs18-MA可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 高溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子TnYLB-1的轉(zhuǎn)座

由于質(zhì)粒pMarA含有溫度敏感型復(fù)制子repG+ts，30℃時在菌體中能復(fù)制，而50℃不能復(fù)制，在50℃下，質(zhì)粒上的HimarⅠ在啟動子PA作用下表達(dá)，并識別轉(zhuǎn)座子TnYLB-1兩端的反向重復(fù)序列ITR，使轉(zhuǎn)座子從質(zhì)粒上跳躍到宿主菌基因組上，并識別基因組上的插入位點(diǎn)“TA”，隨機(jī)插入宿主基因組。在轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座后，其余的質(zhì)粒骨架（含ErmR）將在細(xì)胞中被降解，因此在LBKan平板上生長而在LBErm平板上不生長的菌落即為成功發(fā)生轉(zhuǎn)座的突變子。原位生長比較試驗(yàn)中隨機(jī)挑選2 000株目標(biāo)突變子，構(gòu)建菌株Bs-18的TnYLB-1突變體文庫。

通過菌液濃度系列稀釋表明稀釋濃度為10-5時，菌落在LB平板中能夠較好的以單菌落形式生長，后續(xù)試驗(yàn)均采用10-5濃度涂板。通過比較不同轉(zhuǎn)座溫度及轉(zhuǎn)座處理時間對轉(zhuǎn)座成功率的影響發(fā)現(xiàn)，如圖2所示，在同一溫度誘導(dǎo)下，隨誘導(dǎo)時間的延長而逐漸升高，16 h處理的轉(zhuǎn)座成功率最高，之后轉(zhuǎn)座成功率又呈現(xiàn)降低的趨勢；同一誘導(dǎo)時間不同誘導(dǎo)溫度下，50℃處理誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座成功率最高，其次為49℃。表明轉(zhuǎn)座子TnYLB-1在50℃高溫誘導(dǎo)處理16 h后能最大效率地（高達(dá)70%）轉(zhuǎn)座菌株Bs-18。

2.3 突變體的驗(yàn)證

擴(kuò)增結(jié)果顯示，12個隨機(jī)挑選的突變體基因組中都能擴(kuò)增出與質(zhì)粒pMarA中的TnYLB-1轉(zhuǎn)座子片段大小相同的片段，與陽性對照質(zhì)粒pMarA的擴(kuò)增結(jié)果一致，而野生型菌株Bs-18不能擴(kuò)增出該片段（圖3），說明TnYLB-1已成功插入到Bs-18基因組中。

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）又稱轉(zhuǎn)座因子或跳躍因子，是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和移位的DNA片段，于20世紀(jì)50年代初由McClintock在玉米基因組中首次發(fā)現(xiàn)。當(dāng)轉(zhuǎn)座子在基因組間或組內(nèi)跳躍而插入到某個基因時，就可能引起插入處基因發(fā)生突變或使鄰近插入處基因的表達(dá)活性發(fā)生改變。本研究利用穿梭質(zhì)粒pMarA上的轉(zhuǎn)座子TnYLB-1轉(zhuǎn)化B. amyloliquefaciens Bs-18，構(gòu)建了含2 000株菌株的突變體文庫，為更好地揭示生防菌株Bs-18的生防功能基因奠定了基礎(chǔ)。

本研究利用電擊法將質(zhì)粒pMarA轉(zhuǎn)化Bs-18菌株的轉(zhuǎn)化效率很低，分析原因一可能是由于質(zhì)粒pMarA過大，增加了轉(zhuǎn)化的難度；二可能是由于B. amyloliquefaciens Bs-18的感受態(tài)細(xì)胞制備困難，今后還應(yīng)在芽孢桿菌的感受態(tài)細(xì)胞制備方面做更深一步的研究，為提高轉(zhuǎn)化效率奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子Bs18-MA成為后續(xù)試驗(yàn)轉(zhuǎn)座子TnYLB-1隨機(jī)插入Bs-18基因組的重要前提和基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)通過誘導(dǎo)條件篩選，表明轉(zhuǎn)座子TnYLB-1隨機(jī)插入解淀粉芽孢桿菌Bs-18基因組的最佳溫度是50℃，最佳誘導(dǎo)時間為16 h。有研究表明，轉(zhuǎn)座子TnYLB-1的轉(zhuǎn)座效率在10-2數(shù)量級，而在本研究中，沒有采用轉(zhuǎn)座效率，而是采用轉(zhuǎn)座成功率。因?yàn)榻?jīng)高溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座后在LBKan上生長的菌落并不一定是轉(zhuǎn)座成功的突變體，必須進(jìn)行原位生長比較試驗(yàn)才能最終得到正確的突變體，即經(jīng)高溫誘導(dǎo)后，在含Kan抗性平板上生長而在含Erm的抗性平板上不能生長的菌落數(shù)占在含Kan抗性平板上生長的菌落數(shù)的百分比。轉(zhuǎn)座成功率的表示方法簡單，省去了換算過程，能更直觀地表明轉(zhuǎn)座成功與否。誘導(dǎo)條件的篩選為快速建立突變體庫節(jié)省了大量的時間和精力，也為后續(xù)突變體的篩選提供了大量的試驗(yàn)材料。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Budiharjo A，Chowdhury S P， Dietel K， et al. Transposon mutagenesis of the plant-associated Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum FZB42 revealed that the nfrA and RBAM17410 genes are involved in plant-microbe-interactions[J]. PLoS One，2014，9（5）：e98267.

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