王書平　吳濤　陸玉建

摘 要：該文采用水蒸氣蒸餾法提取辛夷、艾蒿和黃花蒿精油，選取大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）2種細(xì)菌作為供試菌株，采用菌絲生長法測定3種芳香植物精油對2種細(xì)菌的抑菌活性。測試結(jié)果表明：辛夷、艾蒿、黃花蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有抑菌活性。

關(guān)鍵詞：辛夷；艾蒿；黃花蒿；精油；抑菌活性

中圖分類號 S482.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）02-0020-05

Abstract：Essential oils was extracted by steam distillation from three plants（Flos Magnoliae，Artemisia argyi，Aetemisia annua L.），selected E.coli （Escherichia coli） and S.aureus （Staphylococcus aureus） for the two bacteria strains tested，measured using the mycelium growth and development of three essential oil antibacterial activity against two bacteria.Test results showed that：Flos Magnoliae、Artemisia argyi and Aetemisia annua L.essential oils against E.coli and S.aureus have antibacterial activity.

Key words：Flos Magnoliae；Artemisia argyi；Aetemisia annua L.；Essential oils；Antimicrobial activity

植物精油是植物體內(nèi)的一種次生代謝物質(zhì)，由分子量相對較小的簡單化合物構(gòu)成，具有一定的芳香氣味，并在常溫下能揮發(fā)的油狀液體物質(zhì)。植物精油具有復(fù)雜的化學(xué)成分，將各種化學(xué)成分按其化學(xué)結(jié)構(gòu)的差別可分為脂肪族、芳香族和萜類三大類化合物，以及它們的含氧衍生物，如醇、酮、酸、醚、酯、內(nèi)酯等。另外，除了含氮和含硫的化合物，這些化合物的共同特點還有沸點低和易揮發(fā)[1-2]。

當(dāng)前，對植物精油的抑菌活性研究主要在醫(yī)用和農(nóng)用2個方面。醫(yī)用方面如：植物精油具有普遍的抗菌作用，如連翹精油對動物病原細(xì)菌（白葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌）和酵母菌、黑曲霉等有很好的抑菌活性；丹參金露梅精油對多種植物病原真菌都有較好的抑菌活性[3-5]，薄荷精油的抑菌活性體現(xiàn)在能引發(fā)玉米穗腐病的串珠鏈孢菌[6]。農(nóng)用方面如：其對農(nóng)業(yè)害蟲、植物病原菌表現(xiàn)出的生物活性引起了科研工作者的注意。至今，在農(nóng)用殺菌活性方面獲得廣泛研究的植物有：菊科、蕓香科、傘形科、唇形科、姜科、樟科、木蘭科、桃金娘科、馬兜鈴科、馬鞭草科、禾本科等10個科20余種植物[7]。另外，人們還開發(fā)研究了其余的精油類產(chǎn)品，如精油類農(nóng)藥和精油類食品防腐劑等[9-11]。大量研究表明，植物精油具有廣譜的抗菌活性，多種植物精油聯(lián)合使用能夠提升抗菌活性，亦能拓寬抗菌譜，使其食品中用量降低、減少對食品風(fēng)味的影響[12]

本實驗主要研究3種芳香植物精油的抑菌活性，以常見的3種芳香植物為材料，利用水蒸氣蒸餾法提取各種芳香植物精油，采用菌絲生長法測定芳香植物精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性，確定含高效抑菌活性物質(zhì)的芳香植物精油，為野生植物資源綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 樣品采集與制備 采樣地點：濱州市濱城區(qū)郊區(qū)。樣品種類：辛夷、艾蒿、黃花蒿。樣品處理：在實驗室中將樣品進(jìn)行清洗，去除土壤烘干搗碎備用。本實驗使用菌種：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，為本實驗室所存。

1.1.2 實驗儀器及試劑 儀器：雙人單面凈化工作臺、低溫生化培養(yǎng)箱、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、紫外可見分光光度計、冰箱、電子天平、高壓滅菌鍋、組織搗碎機、pH計、移液槍、接種針、涂布棒、打孔器、燒杯、錐形瓶、試劑瓶、廣口瓶、玻璃棒、膠頭滴管、量筒、試管、試管架、鑷子、培養(yǎng)皿、酒精燈、鑰匙、電爐子、牙簽、脫脂棉、紗布。試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、丙酮、75%乙醇、95%乙醇、蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基 詳見表1和表2。

1.2.2 水蒸氣蒸餾法 稱取實驗材料干樣50g（辛夷、艾蒿、黃花蒿）于圓底燒瓶A內(nèi)，再加入500mL水，振搖混勻后，連接揮發(fā)油測定器B與回流冷凝管C。自冷凝管上端加水，使揮發(fā)油測定器的U形管內(nèi)的水到達(dá)刻度線處，并出現(xiàn)有流入燒瓶內(nèi)的現(xiàn)象時為止。放到電熱套中緩慢加熱至沸騰，然后調(diào)節(jié)電壓至100V，保持微沸2h，直到測定器中精油量不再增加時停止加熱，放置片刻，開啟測定器下端的活塞，將水緩慢放出，再靜置一段時間再開啟活塞使精油收到培養(yǎng)瓶中，放入4℃冰箱中保存。裝置如圖1所示。

1.2.3 菌懸液的制備 大腸桿菌菌懸液的制備：取長有大腸桿菌的斜面試管，用接種針挑取大腸桿菌，在固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行四區(qū)劃線，然后用封口膜封好后放入37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。取出平板，用接種針挑取單菌落放入裝有100mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，放入37℃恒溫振蕩水浴鍋內(nèi)培養(yǎng)約9h，測定其OD值達(dá)0.8時即可使用。金黃色葡萄球菌菌懸液的制備：取長有金黃色葡萄球菌的平板，用接種針挑取金黃色葡萄球菌，在固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行四區(qū)劃線，然后用封口膜封好放入37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。取出平板，用接種針挑取單菌落放入裝有100mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，放入37℃恒溫振蕩水浴鍋內(nèi)培養(yǎng)約8h，測定其OD值達(dá)0.8時即可使用。

1.2.4 辛夷、艾蒿、黃花蒿精油的抑菌效力測定 采用瓊脂擴散法測定辛夷、艾蒿和黃花蒿精油的抑菌圈直徑：用打孔器將干凈的吸水性較強的優(yōu)質(zhì)濾紙制成直徑為6mm的圓紙片，干熱滅菌后備用。在無菌條件下，向固體培養(yǎng)基平板內(nèi)注入供試菌菌懸液各100μL到相應(yīng)菌種的培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂抹均勻。將含有精油的濾紙片平展放入在營養(yǎng)皿中。精油在固體培養(yǎng)基平板上不斷向紙片周圍擴散，使濾紙片周圍的測試菌生長受到抑制而形成透明的抑菌圈，濾紙片周圍有抑菌圈者為陽性，無抑菌圈者則為陰性。根據(jù)抑菌圈的大小可判斷樣品抑菌作用的強弱，同時以加無菌水及丙酮的濾紙片作為空白對照測試，以排除所用試劑的干擾。在37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)24h后，測定大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑，重復(fù)試驗3次。

1.2.5 辛夷、艾蒿、黃花蒿精油的最低抑菌濃度（MIC）測定 采用試管液體培養(yǎng)基稀釋法測定3種芳香植物精油的最低抑菌濃度（MlC，the minimum inhibitory concentration）。具體步驟如下：（1）擺好試管進(jìn)行編號W1～W9，W1～W6為測試管，W7號試管為培養(yǎng)基對照管，W8號試管為加丙酮的對照管，W9號試管為加菌懸液的對照管。（2）由于精油與水是不相混溶的，所以試驗中選用丙酮作為介質(zhì)，其與精油的體積比為1∶1。取精油0.5mL和丙酮0.5mL混勻備用。（3）取精油與丙酮的混合液160μL加入W1號試管，再加入4.84mL液體培養(yǎng)基，混勻。（4）向W2～W7、W9號試管中分別加入2.5mL液體培養(yǎng)基。（5）取W1號試管的混合液體2.5mL加入2號試管混勻；取2號試管的混合液體2.5mL加入W3號試管混勻；照此順序，用二倍稀釋法依次稀釋剩余試管，使其精油濃度梯度設(shè)置為0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%。（6）向W8號管加80μL丙酮、80μL無菌水和4.84mL液體培養(yǎng)基，混勻。（7）向W1～W6、W8～W9號試管分別加50μL菌懸液，震蕩后放入37℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后觀察試管的渾濁度，重復(fù)實驗3次。實驗結(jié)論根據(jù)試管渾濁度判斷，澄清的試管說明沒有長菌，渾濁的試管說明有菌生長。

1.2.6 辛夷、艾蒿、黃花蒿精油的最低殺菌濃度（MBC）測定 最低殺菌濃度（MBC Minimal bactericidal concentration）就是指精油能殺死微生物的最低濃度，最小殺菌濃度的測定可以和最低抑菌濃度的測定同步進(jìn)行。將最低抑菌濃度測定實驗結(jié)果中澄清和較澄清的試管進(jìn)行涂平板，然后放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)在37℃下培養(yǎng)1d，以完全沒有菌落生長的最低精油濃度為最低殺菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 辛夷精油對各種測試菌抑菌效力 采用瓊脂擴散法[13]測定辛夷精油對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性，抑菌效果見圖2。若辛夷精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用，則濾紙片周圍會有抑菌圈出現(xiàn)，而且辛夷精油對測試菌的抑菌作用越強抑菌圈的直徑會越大。從抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn)[14]來看：抑菌作用效果以抑菌圈直徑在小于10mm為不敏感，在10～15mm為敏感，在15～20mm為中度敏感，大于20mm為高度敏感。由圖2中（B、C、E、F）可知，對照組中無菌水對照和丙酮對照中供試菌生長良好，沒有抑菌圈。實驗組中辛夷精油對供試菌有一定的抑菌效果，對大腸桿菌的抑菌直徑為10～11mm，證明大腸桿菌對辛夷精油為敏感，如圖2（A）所示。辛夷精油對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑為16～18mm，證明金黃色葡萄球菌對辛夷精油為中度敏感，如圖2（D）所示。

2.2 辛夷精油的最低抑菌濃度（MIC） 采用試管液體培養(yǎng)基稀釋法[15]，由于精油不溶于水，用丙酮作溶劑，將待測精油與液體培養(yǎng)基充分振蕩混合均勻，保證待測精油在液體培養(yǎng)基中具有符合要求的均勻度。從表3中可看出：辛夷精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有明顯的抑菌效果，并且隨著辛夷精油濃度不斷增大抑菌效果越來越明顯；而以丙酮和無菌水作對照的試管中供試菌生長良好。從表3中可粗略估計，辛夷精油對大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.1%～0.2%，辛夷精油對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.05%～0.1%。此結(jié)論對精油抑菌的后續(xù)研究具有重要意義。

2.3 辛夷精油的最低殺菌濃度（MBC） 從表4中可看出：辛夷精油不僅對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，而且當(dāng)辛夷精油達(dá)到一定值時，對兩種菌則能產(chǎn)生殺菌效果。從表4中可粗略推知，辛夷精油對大腸桿菌的最低殺菌濃度為0.2%～0.4%，辛夷精油對金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度為0.1%～0.2%，但準(zhǔn)確濃度需要進(jìn)一步試驗才能獲得。

2.4 艾蒿精油對各種測試菌抑菌效力 采用瓊脂擴散法[13]測定艾蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性。抑菌效果見圖3。若艾蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用，則濾紙片周圍會有抑菌圈出現(xiàn)，而且艾蒿精油對測試菌的抑菌作用越強抑菌圈的直徑會越大。從抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn)[15]來看：抑菌作用效果以抑菌圈直徑在小于10mm為不敏感，在10～15mm為敏感，在15～20mm為中度敏感，大于20mm為高度敏感。由圖3中（B、C、E、F）可知，對照組中無菌水對照和丙酮對照中供試菌生長良好，沒有抑菌圈。實驗組中艾蒿精油對供試菌有一定的抑菌效果，對大腸桿菌的抑菌直徑為7～9mm，證明大腸桿菌對艾蒿精油為不敏感，如圖3（A）所示。艾蒿精油對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑為10～11mm，證明金黃色葡萄球菌對艾蒿精油為敏感，如圖3（D）所示。

2.5 艾蒿精油的最低抑菌濃度（MIC） 采用試管液體培養(yǎng)基稀釋法[15]，由于精油不溶于水，用丙酮作溶劑，將待測精油與液體培養(yǎng)基充分振蕩混合均勻，保證待測精油在液體培養(yǎng)基中具有符合要求的均勻度。從表5中可看出：艾蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有明顯的抑菌效果，并且隨著艾蒿精油濃度不斷增大抑菌效果越來越明顯；而以丙酮和無菌水作對照的試管中供試菌生長良好。從表5中可粗略估計，艾蒿精油對大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.4%～0.8%，艾蒿精油對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.1%～0.2%。此結(jié)論對精油抑菌的后續(xù)研究具有重要意義。

2.6 艾蒿精油的最低殺菌濃度（MBC） 從表6中可看出：艾蒿精油不僅對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，而且當(dāng)艾蒿精油達(dá)到一定值時，對兩種菌則能產(chǎn)生殺菌效果。從表中可粗略推知，艾蒿精油對大腸桿菌的最低殺菌濃度為0.8%～1.6%，艾蒿精油對金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度為0.2%～0.4%，但準(zhǔn)確濃度需要進(jìn)一步試驗才能獲得。

2.7 黃花蒿精油對各種測試菌抑菌效力 采用瓊脂擴散法[13]測定黃花蒿精油對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌活性，抑菌效果見圖4。若黃花蒿精油對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌有抑制作用，則濾紙片周圍會出現(xiàn)抑菌圈，而且黃花蒿精油對測試菌的抑菌作用越強抑菌圈的直徑會越大。從抑菌圈判定標(biāo)準(zhǔn)[14]來看：抑菌作用效果以抑菌圈直徑在小于10mm為不敏感，在10～15mm為敏感，在15～20mm為中度敏感，大于20mm為高度敏感。由圖4中（B、C、E、F）可知，對照組中無菌水對照和丙酮對照中供試菌生長良好，沒有抑菌圈。實驗組中黃花蒿精油對供試菌有一定的抑菌效果，對大腸桿菌的抑菌直徑為10～12mm，證明大腸桿菌對黃花蒿精油為敏感，如圖4（A）所示。黃花蒿精油對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑為6～8mm，證明金黃色葡萄球菌對黃花蒿精油為不敏感，如圖4（D）所示。

2.8 黃花蒿精油的最低抑菌濃度（MIC） 采用試管液體培養(yǎng)基稀釋法[15]，由于精油不溶于水，用丙酮作溶劑，將待測精油與液體培養(yǎng)基充分振蕩混合均勻，保證待測精油在液體培養(yǎng)基中具有符合要求的均勻度。從表7中可看出：黃花蒿精油對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌都有明顯的抑菌效果，并且隨著黃花蒿精油濃度不斷增大抑菌效果越明顯；而以丙酮和無菌水作對照的試管中供試菌生長良好。從表中可粗略估計，黃花蒿精油對大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.20%～0.40%，黃花蒿精油對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.40%～0.80%。此結(jié)論對精油抑菌的后續(xù)研究具有重要意義。

2.9 黃花蒿精油的最低殺菌濃度（MBC） 從表8中可看出：黃花蒿精油不僅對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌具有抑菌作用，而且當(dāng)黃花蒿精油達(dá)到一定值時，會對兩種菌產(chǎn)生殺菌效果。從表8中可粗略推知，黃花蒿精油對大腸桿菌的最低殺菌濃度為0.40%～0.80%，黃花蒿精油對金黃色葡萄球菌的最低殺菌濃度為0.80%～1.60%，但準(zhǔn)確濃度需要進(jìn)一步試驗才能獲得。

2.10 辛夷、艾蒿、黃花蒿精油的最低抑菌濃度比較 從表9中可看出：辛夷、艾蒿、黃花蒿3種植物提煉的精油中，可以比較出：大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對辛夷精油都為高度敏感；其中，大腸桿菌對艾蒿精油不敏感，對黃花蒿精油中度敏感，金黃色葡萄球菌對黃花蒿精油不敏感，對艾蒿精油中度敏感。

2.11 辛夷、艾蒿、黃花蒿精油的最低殺菌濃度比較 從表10中可看出：辛夷、艾蒿、黃花蒿3種植物提煉的精油中，可以比較出：大腸桿菌和金黃色葡萄球菌對辛夷精油都為高度敏感；其中，大腸桿菌對艾蒿精油不敏感，對黃花蒿精油中度敏感，金黃色葡萄球菌對黃花蒿精油不敏感，對艾蒿精油中度敏感。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論 在芳香植物精油的提取方面，從實驗中可以知道，芳香植物精油的提取并不簡單，芳香植物精油通常的提取方法有水蒸氣蒸餾法、浸取法和冷壓法等，本實驗過程中主要用水蒸氣蒸餾法對3種芳香植物精油進(jìn)行提取，雖然較其他的方法較優(yōu)秀，但因為3種植物中含精油量并不是很高，提取效果并非很理想，在后續(xù)實驗中希望能將3種芳香植物精油的提取方法進(jìn)行改善，盡可能提高精油的提取率。本實驗重在測定精油對細(xì)菌的抑菌作用，所以在整個過程中避免雜菌污染是非常重要的，雖然在超凈工作臺中完成菌懸液的制作，接種抑菌的實驗步驟，但是由于實驗操作不當(dāng)和沒有注意避免污染等原因，在實驗過程中造成多次污染，使得實驗材料浪費和實驗結(jié)果不準(zhǔn)確等后果，希望無菌操作過程能進(jìn)一步得到熟練。

就目前從國內(nèi)外對辛夷精油的研究和開發(fā)來看，僅限于辛夷精油提取和鼻炎治療，但辛夷精油的提取率低，精油也不能全面地利用，辛夷還有其他的藥理作用也未開發(fā)出來，值得進(jìn)一步研究開發(fā)。艾蒿是一種多功能的植物，具有很多作用，而且分布廣，價格低廉，但現(xiàn)在人們利用的很有限，所以在以后的研究中，艾蒿的各種作用值得深入研究。黃花蒿在我國分布比較廣，花期較長，花期花序占整個植株比例大，精油含量較高，而且該種精油香氣好、毒性低、對皮膚無刺激并有一定的殺、抑菌作用，因此，黃花蒿精油作為化妝品工業(yè)的天然香料來源是很有前途的，值得進(jìn)一步研究。

3.2 結(jié)論 通過本實驗可初步得出：辛夷精油對大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.10%～0.20%，最低殺菌濃度為0.20%～0.40%；而辛夷精油對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.05%～0.10%，最低殺菌濃度為0.10%～0.20%；艾蒿精油對大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.40%～0.80%，最低殺菌濃度為0.80%～1.60%；而艾蒿精油對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.1%～0.2%，最低殺菌濃度為0.20%～0.40%；黃花蒿精油對大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.20%～0.40%，最低殺菌濃度為0.40%～0.80%；而黃花蒿精油對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.40%～0.80%，最低殺菌濃度為0.80%～1.60%。綜上所述，辛夷、艾蒿、黃花蒿精油在抑菌方面有很大的作用，值得進(jìn)一步開發(fā)研究。

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（責(zé)編：張宏民）