馬詠歌，宋鵬，葉向梅，趙輝，劉志宇，張麗坤，剛宏林,3，楊東光*(.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)， 黑龍江 哈爾濱 50040；.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心血液實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 5000；3.哈爾濱食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心， 黑龍江 哈爾濱 5005)

三氧化二砷(Arsenic trioxide, ATO)，又名亞砷酸，為中藥砒霜提取物，有劇毒，用于治療慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)歷史悠久，是最早的抗CML藥物。Hedgehog(Hh)通路是胚胎發(fā)育過程中的關(guān)鍵信號(hào)通路之一，但是Hedgehog通路成分的改變往往與人類惡性腫瘤的發(fā)展有關(guān)[1]。研究表明Hh通路在部分CML患者中異常活化，CML的靶向性治療藥物伊馬替尼(Imatinib mesylate,IM)對(duì)該通路無抑制作用，因此，該通路是IM耐藥細(xì)胞賴以生存的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

目前，研究的Hh信號(hào)抑制劑均以Smoothened(Smo)為靶點(diǎn)，其藥理活性較Smo的天然抑制劑環(huán)巴胺(Cyclopamine)有所提高，在治療CML的臨床前研究中獲得了滿意的療效[2]。但作為新研發(fā)的小分子藥物，在其走向臨床之前，需要進(jìn)行臨床前研究以評(píng)價(jià)其安全性。其次， Smo抑制劑的應(yīng)用誘發(fā)患者和鼠模型編碼Smo蛋白的基因發(fā)生突變，這些突變嚴(yán)重阻礙了Smo抑制劑與該蛋白的結(jié)合能力，導(dǎo)致患者對(duì)該療法耐藥[3]。此外，Smo下游分子Gli2 和cyclin D1的直接活化，可以繞過Smo抑制劑的作用靶點(diǎn)，是Smo抑制劑耐藥的另外一個(gè)原因[4]。所以，由于缺乏臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)及以Smo為靶點(diǎn)，目前的Hh通路抑制劑尚無法在CML患者中廣泛應(yīng)用。

近年來隨著醫(yī)學(xué)水平的提高以及分子生物學(xué)的進(jìn)展，ATO已經(jīng)較為普遍地運(yùn)用于腫瘤疾病的治療上，并展現(xiàn)出較好的治療效果。而且我們發(fā)現(xiàn)，ATO的應(yīng)用可預(yù)防IM耐藥的發(fā)生。ATO 在2010年被認(rèn)定為Hh通路的靶向性抑制劑，我們率先在應(yīng)用ATO治療并獲得滿意療效的急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)患者上進(jìn)行了ATO對(duì)Hh通路抑制作用的驗(yàn)證。這為ATO應(yīng)用于CML的IM耐藥的治療提供了理論上的可能性。但ATO對(duì)CML干細(xì)胞及其Hh通路的抑制作用及靶點(diǎn)尚未闡明。本研究以CML細(xì)胞株K562為模型，初步探討ATO對(duì)CML細(xì)胞Hh通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的抑制作用及機(jī)制，為該藥應(yīng)用于CML的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人類CML細(xì)胞株K562，為本實(shí)驗(yàn)室長期培養(yǎng)。ATO注射液(10 mg/10 mL)，由哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)提供。TRIzol，invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，PROMEGA公司。Fast Start Universal SYBR Green PCR Master實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，羅氏公司。RIPA強(qiáng)裂解液，碧云天公司?？筩-Abl抗體(sc-56887)，Santa Cruz公司。堿磷顯色二抗，Amersham公司。

1.2 方法

1.2.1 人類CML細(xì)胞株K562培養(yǎng)與處理

K562細(xì)胞使用含10%胎牛血清(杭州四季青)和濃度為100 IU/M青鏈霉素(Invitrogen)的1640培養(yǎng)基中(Gibco)，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中長期培養(yǎng)。ATO注射液(10 mg/10mL)，由哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)提供。實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用不同濃度的ATO溶液連續(xù)作用于K562細(xì)胞48 h，并收集細(xì)胞，做下一步檢測(cè)。

1.2.2 Annexin-V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡

收集經(jīng)過濃度分別為0、1、2、4、8μM的ATO處理的K562細(xì)胞，經(jīng)用PBS洗滌、AnnexinV-FITC染色后，在室溫避光靜止15 min后每管再加入1×binding buffer 400 μL，在1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測(cè)。每份樣品同設(shè)3份，求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.3 免疫印跡

收集經(jīng)過濃度分別為0、1、2、4 μM的ATO處理的K562細(xì)胞，采用RIPA強(qiáng)裂解液(150 mM NaCl, 1% w NP-40, 0.5%[w/v]sodium deoxycholate, 0.1%[w/v]sodium dodecyl sulfate (SDS), 50 mM Tris HCl [pH=8], 10 mM EDTA, and 1 mM PMSF)(碧云天)提取蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，用蛋白轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，按轉(zhuǎn)移蛋白的常規(guī)方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，進(jìn)行免疫印跡、堿磷顯色及灰度分析。采用抗體為抗Gli2抗體(C-10)(Santa Cruz)，抗Gli1抗體(Abcam)， 抗Smoothened抗體(Abcam)，抗Patched/PTCH 抗體(Abcam)and抗-actin抗體 (Santa Cruz)，及堿磷顯色二抗 (Amersham)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ATO對(duì)K562細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用

經(jīng)不同濃度的ATO處理后，CML細(xì)胞K562逐漸出現(xiàn)了凋亡現(xiàn)象，ATO誘導(dǎo)K562細(xì)胞出現(xiàn)凋亡呈藥物劑量依賴性(見圖1)。但值得注意的是，K562對(duì)ATO的敏感性較低，2 μM的ATO僅能誘導(dǎo)少量CML細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖1 在48 h內(nèi)不同濃度ATO誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡效果

2.2 ATO對(duì)K562細(xì)胞Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子蛋白水平的影響

經(jīng)不同濃度的ATO連續(xù)作用于K562細(xì)胞株48 h后，我們檢測(cè)了K562細(xì)胞Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ATO 對(duì)Hh通路的核心蛋白Gli2蛋白表達(dá)具有顯著的抑制作用，其抑制作用呈劑量依賴性(P<0.05)(見圖2)。ATO對(duì)于Hh通路的抑制因子ptch2的表達(dá)具有一定的促進(jìn)作用(高劑量呈抑制作用)，但無劑量依賴性(P>0.05)。但ATO對(duì)于Gli1蛋白，無論何種劑量，在48 h的作用時(shí)間內(nèi)，均未對(duì)其蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生顯著的抑制作用(P>0.05)(見圖3)。

圖2 在ATO處理組和對(duì)照組中Gli2蛋白的表達(dá)情況注:與對(duì)照組比較，P<0.05

圖3 在ATO處理組和對(duì)照組中ptch2、Gli1蛋白的表達(dá)情況注:與對(duì)照組比較，P>0.05

3 討論

《本草圖經(jīng)》云:“砒霜，舊不著所出郡縣，今近銅山處亦有之，惟信州者佳。其塊有甚大者，色如鵝子黃，明澈不雜。此類本處自是難得之物，每一兩大塊，真者人競珍之，市之不啻金價(jià)。古服食方亦或用之，必得此類，乃可入藥。其市肆所蓄，片如細(xì)屑，亦夾土石，入藥服之，為害不淺。誤中，解之用冷水研綠豆?jié){飲之?！迸饕煞譃槿趸?(ATO)，白色，八面體狀結(jié)晶，三氧化二砷加高熱可以升華，故精制比較容易，升華物普通名砒霜。上世紀(jì)70年代哈爾濱醫(yī)科大學(xué)創(chuàng)用“癌靈1號(hào)”(氧化砷注射液)治療APL患者，說明砷劑對(duì)某些髓系惡性增殖性疾病有確切的療效，含砷中藥對(duì)白血病的治療效果，再一次引起了國際腫瘤學(xué)界的關(guān)注[5]。ATO應(yīng)用于臨床治療APL患者多年，現(xiàn)已被公認(rèn)為是APL的標(biāo)準(zhǔn)治療方案[6]。最近幾年的研究表明，ATO具有廣泛的抑瘤作用，不僅可以抑制惡性血液腫瘤細(xì)胞增殖，對(duì)于肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等其他腫瘤細(xì)胞同樣具有抑制作用[7-10]。

自2010年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ATO對(duì)Hh通路具有靶向性抑制作用以來，陸續(xù)有研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ATO通過此種機(jī)制對(duì)包括骨肉瘤、間皮瘤、惡性橫紋肌樣瘤、惡性膠質(zhì)瘤、胰腺癌、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤和尤文肉瘤甚至APL在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)揮殺傷作用，而且ATO的作用范圍不僅是腫瘤細(xì)胞，也包括部分腫瘤干細(xì)胞[11-15]。ATO對(duì)Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表現(xiàn)出特異性抑制，該抑制作用與ATO的細(xì)胞毒性、ATO對(duì)Ras和Wnt通路的抑制和對(duì)JNK和Pp38MAPK通路的活化起作用均無關(guān)[13]。

研究發(fā)現(xiàn)，ATO對(duì)Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用靶點(diǎn)為執(zhí)行這條通路的核心蛋白Gli。ATO僅對(duì)Gli高表達(dá)腫瘤細(xì)胞具有較好的敏感性，而對(duì)Gli低表達(dá)的細(xì)胞株敏感性較差。目前推測(cè)ATO對(duì)Gli的作用機(jī)理為：Gli蛋白上存在與PML/RARα半胱氨酸殘基相同的巰基結(jié)構(gòu)，因此ATO能夠與Gli蛋白結(jié)合并誘導(dǎo)其降解，體外研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，ATO長期作用能降解Gli2蛋白；并能與Gli1蛋白結(jié)合，抑制其靶基因Ptch和cyclinD1的表達(dá)[13-14]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，ATO短期作用還可以抑制Gli2在初級(jí)鞭毛的積累(該過程為Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵步驟)，這可能是與ATO對(duì)微管的直接作用相關(guān)。

研究采用不同濃度的ATO處理CML細(xì)胞K562發(fā)現(xiàn)ATO對(duì)Hh通路核心蛋白Gli2的抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡均呈藥物劑量依賴性。但ATO的誘導(dǎo)凋亡效果落后于對(duì)Gli2抑制，ATO對(duì)Gli2的抑制作用開始于0.5 μM，該劑量對(duì)細(xì)胞的凋亡并未產(chǎn)生影響，當(dāng)ATO濃度達(dá)到2 μM時(shí)，僅使少量CML細(xì)胞發(fā)生凋亡，但可使K562細(xì)胞的Gli2表達(dá)顯著受抑。因此ATO對(duì)Hh分子的抑制，并非是細(xì)胞凋亡的后果，表明ATO對(duì)Gli2的抑制具有靶向性。本研究在K562細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)ATO對(duì)Gli2的抑制作用，與文獻(xiàn)報(bào)道的在其他細(xì)胞上ATO對(duì)Gli2的效果一致[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)，ATO對(duì)K562細(xì)胞的Gli1蛋白并無抑制作用，該結(jié)果亦符合其他研究者的文獻(xiàn)報(bào)道[14]。Hh通路的負(fù)反饋調(diào)控因子Ptch低表達(dá)是CML患者預(yù)后不良的標(biāo)志，Ptch是預(yù)測(cè)IM治療失敗的敏感和特異性指標(biāo)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在ATO作用后，Ptch2蛋白的表達(dá)有升高的趨勢(shì)，表明ATO可能是通過上調(diào)負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)，抑制Hh通路。當(dāng)ATO的濃度達(dá)到4 μM，大部分細(xì)胞死亡，Ptch2隨之降解。

總之，本研究證實(shí)，在CML細(xì)胞中，ATO對(duì)Hh通路具有顯著的抑制作用，主要是通過降解以Gli2為核心的蛋白發(fā)揮最用，并可一定程度上上調(diào)負(fù)調(diào)控因子Ptch2蛋白的表達(dá)。ATO對(duì)Hh通路的抑制作用具有特異性，發(fā)生在誘導(dǎo)凋亡之前。本實(shí)驗(yàn)為擴(kuò)大ATO應(yīng)用于IM耐藥的CML提供了一個(gè)堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

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