丁濤，陽(yáng)彥，趙琰，伍瓊芳，吳興武，胡毅娜

(江西省婦幼保健院，南昌 330006)

地中海貧血是一種全球范圍內(nèi)的疾病，可以分為 α地貧、β地貧、δ地貧、γ地貧、δβ地貧和εγδβ地貧等。α和β地貧是人群中最常見(jiàn)的地貧類型[2，3]，全球地貧基因攜帶者頻率高達(dá)2.62%，包括中國(guó)南方在內(nèi)的東南亞地區(qū)、印度次大陸、地中海地區(qū)、中東、北非和太平洋地區(qū)都是該病的高發(fā)地區(qū)[4，5]。 β 地中海貧血是人 β 珠蛋白（HBB）基因突變的單基因遺傳病，由于位于11號(hào)染色體上的β珠蛋白基因突變，導(dǎo)致正常β珠蛋白肽鏈缺失或合成量不足，a肽鏈相對(duì)過(guò)剩并沉積在紅細(xì)胞膜上，使紅細(xì)胞破壞出現(xiàn)溶血性貧血[6，7]。

1 臨床資料

患者，女，23歲，2014年足月順產(chǎn)一子（半歲時(shí)診斷為重度β地中海貧血，基因型：βIVS-2-654/βIVS-2-654），2015年孕5+月羊穿提示胎兒為β地中海貧血引產(chǎn)。夫妻雙方均為β地中海貧血基因攜帶者（βIVS-2-654/βN）。于 2016年 7月來(lái)我院輔助生殖中心擬行以β地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)合HLA配型為目的的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation geneticdiagnosis，PGD）（簡(jiǎn)稱 PGD-HLA） 助孕治療。經(jīng)過(guò)遺傳咨詢，在治療開(kāi)始前患者夫婦被告知治療方案及流程、誤診的風(fēng)險(xiǎn)、不能獲得HLA配型相符的胚胎的可能，并簽署知情同意書(shū)。

收集夫婦雙方及先證者的外周血，建立家系的單體型。以基因HBB(NM_000518.4 chr11：5246696-5248301反向轉(zhuǎn)錄)區(qū)域及側(cè)翼10bp序列作為目標(biāo)區(qū)域，并在基因上下游選擇若干SNP位點(diǎn)作為遺傳標(biāo)記，半導(dǎo)體法高通量測(cè)序，檢測(cè)SNP位點(diǎn)基因型，選擇其中相應(yīng)位點(diǎn)構(gòu)建單體型，進(jìn)行連鎖分析。SNP位點(diǎn)分布見(jiàn)表1。

以HLA-A基因上游，HLA-A與HLA-B之間，HLA-B與 HLA-DRA之間，HLA-DRA與HLA-DQB1之間，以及HLA-DQB1上游作為目標(biāo)區(qū)域，選擇197個(gè)高密度緊密連鎖的SNP作為遺傳標(biāo)記，利用ION AMPLISEQTM DESIGNER網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物，經(jīng)DNA純化、建庫(kù)、PGM測(cè)序后，選擇若干有效位點(diǎn)進(jìn)行單體型分析。所有位點(diǎn)分成5部分進(jìn)行建立單體型：HLA-A和上游區(qū)域位點(diǎn)；HLA-B和下游區(qū)域位點(diǎn)；HLA-DRA和上游區(qū)域位點(diǎn)；HLA-DQB1和下游區(qū)域位點(diǎn)；HLA-DQB1上游區(qū)域位點(diǎn)。通過(guò)單體型分析，該家系通過(guò)單體型PGD預(yù)實(shí)驗(yàn)?；颊哂?017年3月采用經(jīng)典黃體期長(zhǎng)方案，充分降調(diào)節(jié)后給予卵泡刺激素150IU進(jìn)行控制性超促排卵，促排期間根據(jù)卵泡發(fā)育情況調(diào)整Gn用量，共Gn9d，Gn總量1575IU，共獲卵27枚，其中MⅡ期卵子19枚。通過(guò)胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)法授精，受精后卵子置于瑞典vitrolife卵裂期培養(yǎng)液中，在濕化37℃美國(guó)cook三氣培養(yǎng)箱(5%CO2，5%O2和90%N2)中孵育至第3d。選擇第3d 2PN卵裂胚胎行透明帶激光輔助孵化打孔，繼續(xù)培養(yǎng)至第5d和第6d，共形成10枚可利用囊胚，分別為5BB×7，5BC×3，均行活檢?；顧z后囊胚利用玻璃化冷凍技術(shù)[1]進(jìn)行胚胎冷凍保存，待檢測(cè)結(jié)果出來(lái)后擇期胚胎復(fù)蘇移植?；顧z后囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞通過(guò)Sureplex法全基因組擴(kuò)增，利用擴(kuò)增后產(chǎn)物對(duì)β地中海貧血的致病基因HBB基因及HLA基因的STR位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析。在活檢的10枚囊胚中，El、E2、E3、E5、E7、E9、E10 為攜帶致病基因的雜合型，E8為完全正常胚胎。E4、E6為重型β地貧基因型。同時(shí)E1、E3 HLA配型相符。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2?；颊哂?017年7月行凍胚復(fù)蘇移植周期治療，移植胚胎El后獲得臨床持續(xù)妊娠，妊娠18+3周時(shí)抽羊水進(jìn)行β地貧產(chǎn)前基因診斷為βIVS-2-654/βN，HLA基因分型與先證者配對(duì)成功，與PGD-HLA結(jié)果一致，核型分析未見(jiàn)明顯異常，13，18，21，X/Y染色體未見(jiàn)非整倍體數(shù)目異常。目前已順利分娩并成功行造血干細(xì)胞移植 （hemopoietic stem celltransplantation，HSCT）治療。

表1 SNP位點(diǎn)分布

表2 囊胚檢測(cè)結(jié)果

2 討論

目前重型β地中海貧血，臨床上治療手段有限，患者只能通過(guò)長(zhǎng)期輸血及去鐵治療來(lái)維持生命，而且反復(fù)多次輸血會(huì)增加血源性疾病傳播的危險(xiǎn)，對(duì)患者和家庭造成沉重精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。迄今為止唯一的根治方法是HSCT治療，但由于配型合適的供者難尋，并且移植費(fèi)用昂貴，大部分患者難以得到救治。有血緣關(guān)系且配型相符的供者比非親緣或配型不符的供者能明顯提高受者HSCT后的生存率，但大部分有HSCT需求的患者無(wú)法獲得親緣且配型相符的造血干細(xì)胞。PGD是以體外受精—胚胎移植技術(shù)（IVF-ET）為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)植入前的胚胎進(jìn)行遺傳病的分子診斷，選擇沒(méi)有疾病表型的胚胎移植[8]。它能有效避免被動(dòng)妊娠遺傳病患兒流產(chǎn)或引產(chǎn)給夫婦帶來(lái)的痛苦。本病例應(yīng)用PGD-HLA技術(shù)獲得了有血緣關(guān)系且配型相符的供者。目前胎兒各項(xiàng)生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)均正常，成為江西省PGD-HLA技術(shù)的首例獲益者，填補(bǔ)了江西省PGD技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域的空白。PGD-HLA技術(shù)可有效為有β地中海貧血先證者的家庭提供優(yōu)生的選擇，在獲得健康新生兒的同時(shí)，也為先證者提供了HSCT治療的機(jī)會(huì)。

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