吳云波，張維強(qiáng)，魏智民，張國慶，劉哲峰，焦順昌

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤科，北京 100853;2.中央軍事委員會聯(lián)合參謀部警衛(wèi)局保健處)

·臨床研究·

晚期非小細(xì)胞肺癌患者化療前后淋巴細(xì)胞亞群的變化

吳云波1，張維強(qiáng)2，魏智民2，張國慶1，劉哲峰1，焦順昌1

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤科，北京 100853;2.中央軍事委員會聯(lián)合參謀部警衛(wèi)局保健處)

[摘要]目的分析125例晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者2周期一線化療前后21項(xiàng)淋巴細(xì)胞亞群變化情況。方法用三標(biāo)熒光抗體對125例NSCLC患者接受紫杉+鉑類、培美曲塞+鉑類或其他方案2周期一線化療前后外周血21項(xiàng)淋巴細(xì)胞亞型進(jìn)行標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測并分析結(jié)果，用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析化療前后淋巴細(xì)胞亞群的變化，并分析不同化療方案對淋巴細(xì)胞亞群的影響是否存在差異。結(jié)果晚期NSCLC患者化療后CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD29+、CD3+HLA-DR+、45RO+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD28+、CD8+CD28-細(xì)胞在外周血淋巴細(xì)胞中的百分比例較化療前明顯升高，自然殺傷細(xì)胞(CD3-CD16+或56+)、CD19+細(xì)胞百分比則明顯降低(P<0.05)。亞組分析結(jié)果顯示接受不同化療方案化療后患者CD19+、CD25+、Treg這三種淋巴細(xì)胞亞群在外周血中的百分比存差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；紫杉+鉑類組CD19+細(xì)胞百分比最低，培美+鉑類組則最高；培美+鉑類組CD25+和Treg細(xì)胞的百分比最低，其他化療方案組則最高；除上述三種淋巴細(xì)胞亞群外，其余亞群在外周血中的百分比在不同化療方案組患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論2個周期一線化療使得晚期NSCLC患者體液免疫功能下降，但患者的細(xì)胞免疫功能處于增強(qiáng)狀態(tài)；紫杉+鉑類方案對患者的體液免疫功能的減低作用相對明顯，而培美曲塞+鉑類方案對機(jī)體的免疫抑制作用要低于紫杉+鉑類方案以及其他化療方案。

[關(guān)鍵詞]癌,非小細(xì)胞肺;抗腫瘤聯(lián)合化療方案;淋巴細(xì)胞亞群;免疫系統(tǒng)現(xiàn)象

既往眾多研究表明，CD3+細(xì)胞代表總T淋巴細(xì)胞，CD3+CD4+細(xì)胞代表輔助/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th)，CD3+CD8+細(xì)胞則代表記憶/效應(yīng)性T細(xì)胞(Tc)。這三種細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞亞群分析中占有非常重要的地位，既往有很多研究通過分析這三種細(xì)胞在外周血中的變化來評價患者的免疫功能。但是外周血中這三種細(xì)胞表面同樣存在很多不同的CD分子，說明它們都不是單一的細(xì)胞群，而是由許多特征和功能各異的亞群所組成的[1-3]。隨著免疫學(xué)研究的發(fā)展，更多的淋巴細(xì)胞亞群，比如CD45RA、CD45RO、CD28、HLA-DR、Treg(CD4+CD25+)細(xì)胞等陸續(xù)被研究者發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞在機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)方面同樣起著非常重要的作用。同時，越來越多的學(xué)者也逐漸意識到，僅分析CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的變化并不能客觀、準(zhǔn)確和全面地反映機(jī)體免疫功能變化情況。因此，本研究對125例晚期NSCLC患者化療前后外周血21項(xiàng)淋巴細(xì)胞亞群的表型進(jìn)行了檢測和分析，以期發(fā)現(xiàn)化療對患者免疫功能的影響。

化療是包括非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)在內(nèi)的諸多惡性實(shí)體腫瘤的綜合治療過程中非常重要的一種抗腫瘤治療方法。化療藥物的細(xì)胞毒作用由于缺乏選擇性，使得這些藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，對機(jī)體正常的細(xì)胞也有殺傷作用。有許多研究報道認(rèn)為化療可降低機(jī)體免疫功能[4-6]，進(jìn)而削弱機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生[7]。但是亦有學(xué)者認(rèn)為化療可通過調(diào)變腫瘤抗原、調(diào)整機(jī)體免疫格局而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫功能[8-12]。為明確化療對機(jī)體免疫功能的影響，本研究采用前瞻性隊(duì)列研究的方式，對125例晚期NSCLC患者化療前后外周血21項(xiàng)淋巴細(xì)胞亞群的表型進(jìn)行了檢測，以此分析晚期NSCLC患者免疫功能變化情況。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2008年11月至2013年12月中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤科收治的均經(jīng)組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查診斷明確的125例晚期NSCLC患者。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)疾病分期為ⅢB期或Ⅳ期，既往未行化療；(2)有影像學(xué)可評估病灶，根據(jù)實(shí)體瘤療效評估標(biāo)準(zhǔn)(RECIST 1.1)，至少有一個單徑可測量病灶，其最長徑采用螺旋CT測量≥10 mm；對于任何接受過放療的病灶均不能作為靶病灶；(3)年齡在18～75歲，預(yù)期生存時間大于12周；(4)ECOG狀態(tài)評分為0～2分；(5)器官功能水平必須符合下列要求：中性粒細(xì)胞絕對計數(shù)(ANC) ≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L，血紅蛋白≥90 g/L；肝臟：血清膽紅素≤1.5倍正常值上限。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)≤2.5倍正常值上限；腎臟：血清肌酐≤1.5倍正常值上限；肌酐清除率≥50 mL/min；(6)簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有影像學(xué)或是腦脊液病檢證實(shí)的脊髓、脊膜或是腦膜的腫瘤轉(zhuǎn)移(無癥狀的腦轉(zhuǎn)移除外)；(2)任何不穩(wěn)定系統(tǒng)性疾病(包括活動性感染，控制不佳高血壓，不穩(wěn)定型心絞痛，充血性心力衰竭，肝、腎或代謝性疾病)；(3)在5年內(nèi)患有任何其他惡性腫瘤(完全治愈的宮頸原位癌或基底細(xì)胞或鱗狀上皮細(xì)胞皮膚癌除外)。

研究對象按照NCCN指南中推薦的給藥劑量給予多西他賽/紫杉醇+順鉑/卡鉑、培美曲塞二鈉+順鉑/卡鉑和其他方案(包括吉西他濱+順鉑/卡鉑、長春瑞濱+順鉑/卡鉑、依托泊苷+順鉑/卡鉑等)化療。入組研究對象的年齡為(52.9±11.1)歲，其余臨床特征見表1。該研究由中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3 材料 試驗(yàn)所用CD8-FITC/CD4-PE/CD3-PC5標(biāo)記三色熒光素抗體及其同型陰性對照，CD3-FITC/CD56-PE/CD16-PC5標(biāo)記三色熒光素抗體及其同型陰性對照，CD8-FITC、CD45RO-FITC、CD28-FITC、CD29-FITC、CD25-PE、CD45RA-PE、HLA-DR-PE、CD8-ECD、CD19-ECD、CD3-PC5、CD4-PC7標(biāo)記單色熒光素抗體及FITC、PE、ECD、PC5、PC7單色同型陰性對照均購自美國Bechman-Coulter公司。Q-prep自動溶血儀、Cytometer FC 500 MPL 流式細(xì)胞儀亦購自美國Bechman-Coulter公司。

1.4 檢測樣本的制備 所有患者均于第1周期化療前1天以及第2周期化療后第20天清晨空腹取EDTA-Na2外周靜脈抗凝血2～3 mL。T淋巴細(xì)胞亞群檢測前取患者EDTA-Na2抗凝血100 μL，分別加入各表型相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體10 μL，振蕩混勻后避光20 min，應(yīng)用Q-prep自動溶血儀溶血，5 min后應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

表1 125例非小細(xì)胞肺癌患者的臨床特征

1.5 流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞表型 利用流式細(xì)胞儀分析功能軟件進(jìn)行雙參數(shù)獲得數(shù)據(jù)分析。激光光源為15 mW的氬離子激光，波長為488 nm。測定前用質(zhì)控微球(直徑5 μm,Immunothech)調(diào)校儀器，以保證其熒光檢測的CV值<2%。計數(shù)10 000個細(xì)胞，每個標(biāo)本用同型抗體作自身陰性對照，然后檢測各細(xì)胞表型的陽性表達(dá)率。

2 結(jié)果

2.1 化療前后T淋巴細(xì)胞亞群變化情況 經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，晚期NSCLC癌患者化療后CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD29+、CD3+HLA-DR+、45RO+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD28+、CD8+CD28-細(xì)胞在外周血淋巴細(xì)胞中的百分比例較化療前明顯升高，自然殺傷細(xì)胞(NK)(CD3-CD16+或56+)、CD19+細(xì)胞百分比則明顯降低(P<0.05)；而NKT(CD3+CD16+或56+)、CD29+、CD25+、Treg(CD4+CD25+)、HLA-DR+、CD3+HLADR-、45RA+、CD8+CD28+以及CD4+/CD8+比值在化療前后的變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 125例非小細(xì)胞肺癌患者化療前后淋巴細(xì)胞亞群在外周血中百分比例變化情況

2.2 亞組分析結(jié)果 在亞組分析中我們分析了不同化療方案對研究對象T淋巴細(xì)胞亞群的影響。結(jié)果顯示：接受不同化療方案化療后患者CD19+、CD25+、Treg這三種淋巴細(xì)胞亞群在外周血中的百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；紫杉+鉑類組CD19+細(xì)胞百分比最低，培美+鉑類組則最高；培美+鉑類組CD25+和Treg細(xì)胞的百分比最低，其他化療方案組則最高；除上述三種淋巴細(xì)胞亞群外，其余亞群在外周血中的百分比在不同化療方案組患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同化療方案對非小細(xì)胞肺癌患者淋巴細(xì)胞亞群在外周血中百分比例的影響

3 討論

本研究的結(jié)果顯示，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)一線方案化療后，晚期NSCLC患者外周靜脈血中的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD29+、CD3+HLA-DR+、45RO+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD28+、CD8+CD28-細(xì)胞百分比較化療前明顯升高，CD19+和NK細(xì)胞百分比則明顯降低(P<0.05)。其余9項(xiàng)淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)，包括NKT(CD3+CD16+或56+)、CD29+、CD25+、Treg(CD4+CD25+)、HLA-DR+、CD3+HLADR-、45RA+、CD8+CD28+以及CD4+/CD8+比值化療前后的變化則差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

從本研究的結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)：2個周期的一線化療后，NSCLC患者的體液免疫功能有所下降，因?yàn)榉从硻C(jī)體的體液免疫功能的CD19+細(xì)胞的百分比化療后是明顯降低的。但是2周期的化療后患者不僅傳統(tǒng)的CD3+、CD4+和CD8+T細(xì)胞的百分比經(jīng)化療后明顯升高，其他多個反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能的T淋巴細(xì)胞亞群(CD4+CD29+、CD3+HLA-DR+、45RO+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+和CD28+T細(xì)胞)的百分比亦明顯升高。CD4+CD29+被認(rèn)為是輔助誘導(dǎo)T細(xì)胞，有研究認(rèn)為CD4+CD29high細(xì)胞與Th1細(xì)胞緊密相關(guān)。該類細(xì)胞在炎癥部位經(jīng)炎性物質(zhì)或炎性因子的刺激可活化，進(jìn)而通過分泌IFN-γ和TNF-α上調(diào)機(jī)體的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)患者免疫功能[13]。CD4+CD29+記憶性細(xì)胞是免疫功能缺陷是否會發(fā)生的的預(yù)測性指標(biāo)之一，有學(xué)者認(rèn)為該類細(xì)胞的消減是機(jī)體免疫功能降低的早期標(biāo)志之一[14]。另外，CD45RO+T細(xì)胞被稱為“記憶性”T細(xì)胞，CD45RO+T細(xì)胞的亞群CD4+CD45RO+T細(xì)胞又被稱為輔助誘導(dǎo)細(xì)胞。當(dāng)這群細(xì)胞再次接觸相同的抗原后可被迅速活化、增殖，進(jìn)而釋放IL-2、IL-4、IFN-γ等Th1類細(xì)胞因子，可輔助B淋巴細(xì)胞快速合成和分泌IgG抗體，從而增強(qiáng)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫。亦有研究結(jié)果顯示，腫瘤免疫微環(huán)境中CD45RO+T細(xì)胞富集患者的預(yù)后要明顯優(yōu)于CD45RO+T細(xì)胞缺乏的患者。而HLA-DR+細(xì)胞則在一定程度上反映了機(jī)體T淋巴細(xì)胞的活化程度，HLA-DR+細(xì)胞百分比越高提示淋巴細(xì)胞的活化程度越高[15-16]。CD4+CD29+、CD3+HLA-DR+、45RO+、CD4+CD45RO+和CD28+T細(xì)胞的升高表明機(jī)體細(xì)胞免疫功能處于增強(qiáng)狀態(tài)。而CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞則被認(rèn)為是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，多項(xiàng)研究結(jié)果顯示該類細(xì)胞可通過抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫功能而與多種惡性腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[17-18]。本研究結(jié)果顯示Treg細(xì)胞的百分比化療前后并無明顯變化，由此提示負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的情況在2周期化療后并未出現(xiàn)。

眾所周知，不同的化療藥物其毒副作用不盡相同。那么不同的化療方案對晚期NSCLC患者免疫功能的影響是否存在差異呢？為此本研究進(jìn)行了亞組分析。亞組分析結(jié)果顯示，接受不同化療方案化療后患者CD19+、CD25+、Treg這三種淋巴細(xì)胞亞群在外周血中的百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余亞群在外周血中的百分比在不同化療方案組患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這一結(jié)果提示不同的化療方案對晚期NSCLC患者整體免疫功能的影響的差異并不顯著。因?yàn)樽仙?鉑類組CD19+細(xì)胞百分比最低，而培美曲塞+鉑類組則最高，故紫杉+鉑類方案可能對患者的體液免疫功能的減低作用相對明顯，而培美曲塞+鉑類方案降低體液免疫功能的影響相對較弱。而因培美+鉑類組CD25+和Treg細(xì)胞的百分比最低，其他化療方案組則最高，故可認(rèn)為培美曲塞+鉑類方案對機(jī)體的免疫抑制作用要低于紫杉+鉑類方案以及其他化療方案。

本研究顯示，2個周期的一線標(biāo)準(zhǔn)方案的化療并未降低晚期NSCLC患者的細(xì)胞免疫功能，相反患者經(jīng)化療后其整體免疫功能還處于增強(qiáng)狀態(tài)；不同的化療方案對晚期NSCLC患者整體免疫功能的影響差異不大；培美曲塞+鉑類方案對機(jī)體的免疫抑制作用要低于紫杉+鉑類方案以及其他化療方案。

此外,據(jù)文獻(xiàn)研究報道推論營養(yǎng)不良是免疫缺陷的原因[19],在肺癌患者中這可能導(dǎo)致抗腫瘤免疫細(xì)胞滲透差。因此，這可以解釋低前清蛋白水平對長期生存率的強(qiáng)烈的負(fù)面影響。此外，炎癥狀態(tài)(先前存在或伴隨)隨著肺癌的增加，能量消耗增加可能導(dǎo)致營養(yǎng)不良。已經(jīng)證明腫瘤內(nèi)密度高的MDC和CD8+T淋巴細(xì)胞與改善預(yù)后相關(guān)[20-21]。營養(yǎng)狀況也是肺癌患者生存的一個決定性因素[22-23]，Alifamo等[24]研究結(jié)果表明患有全身性炎癥和營養(yǎng)不良狀況可能影響腫瘤內(nèi)免疫組織和患者的生存率。腫瘤免疫微環(huán)境也已被證明是在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤[25]長期預(yù)后的重要因素：特別是在NSCLC，高水平的成熟樹突狀細(xì)胞和CD8+淋巴細(xì)胞被認(rèn)為是強(qiáng)有力的預(yù)后因素[26-27]。本實(shí)驗(yàn)尚存在一些不足，忽略了營養(yǎng)狀況對免疫狀況的影響，存在營養(yǎng)風(fēng)險或營養(yǎng)不足的肺癌患者，經(jīng)過化療后，免疫狀況受到干擾，需要進(jìn)一步分析營養(yǎng)狀態(tài)。

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Analysisonthechangesoflymphocytesubsetsamongcolorectalcarcinomapatientsbeforeandafterthechemotherapy

WuYunbo*，ZhangWeiqiang,WeiZhimin,ZhangGuoqing,LiuZhefeng,JiaoShunchang

(*DepartmentofClinicalOncology,GeneralHospitalofPLA,Beijing100853,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the differences of 21 lymphocyte subsets before and after 2 cycles of chemotherapy in patients with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC) patients.Methods21 peripheral blood lymphocyte subsets from 125 advanced non-small cell lung cancer patients before and after 2 cycles of first-line chemotherapy drugs of paclitaxel with cisplatin or carboplatin (TC/TP),pemetrexed with cisplatin or carboplatin (PC/PP) or other chemotherapy regimens were detected by three immune-fluorescence staining and the flow cytometry (FCM).The differences of these lymphocyte subsets percentage were analyzed statistically with SPSS 17.0 software.ResultsAfter chemotherapy,the percentage of CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD4+CD29+,CD3+HLA-DR+,45RO+,CD4+CD45RA+,CD4+CD45RO+,CD28+,CD8+CD28-cells in peripheral blood of advanced NSCLC patients were significantly increased,while the percentage of NK (CD3-CD16+or 56+) and CD19+cells was significantly decreased compared to that before chemotherapy (P<0.05).After chemotherapy,the percentage of CD19+cells was notably low in the TC/TP group compared with that in the PC/PP group and other chemotherapy groups,while it was notably high in the PC/PP group compared with that in TC/TP group and other chemotherapy groups (P<0.05).The percentage of CD25+and Tregcells was decreased significantly in PC/PP treatment group,and increased significantly in other chemotherapy groups(P<0.05).In addition,there were no significant differences in the percentage of other lymphocyte subsets in different chemotherapy groups.Conclusions2 cycles of first-line chemotherapy drugs lowered the humoral immune ability and enhanced the cellular immune ability of the advanced NSCLC patients.The suppression of TC/TP chemotherapy regimen on humoral immunity is more notable compared to PC/PP chemotherapy regimen.The immunosuppressive effect of PC/PP is weaker than TC/TP.

[Keywords]Carcinoma,non-small-cell Lung;Antineoplastic combined chemotherapy protocols;Lymphocyte subsets;Immune system phenomena

中圖分類號：R734.2

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2018.03.026

基金項(xiàng)目：中央保健委保健專項(xiàng)科研課題(14BJZ47)

作者簡介：吳云波,主治醫(yī)師，Email:332163033@qq.com

2018-03-22)