靳慧征,王 振,丁亞男 (1.河南建筑職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南 鄭州 450007；.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院,農(nóng)田生態(tài)保育與污染防控安徽省重點實驗室,安徽 合肥 30036)

隨著人工濕地技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于低碳氮比廢水(如垃圾滲濾液、畜禽養(yǎng)殖廢水、食品廢水等)的處理,復(fù)氧能力的不足和有機(jī)碳源的匱乏已成為制約其高效脫氮的瓶頸[1-2].為此,諸多研究均在嘗試通過一定的技術(shù)手段和調(diào)控措施改變?nèi)斯竦刂袀鹘y(tǒng)的微生物脫氮途徑(即微生物硝化/反硝化作用)[3],進(jìn)而緩解溶解氧(DO)和有機(jī)碳源對人工濕地脫氮性能的制約.

強(qiáng)化人工濕地中基于亞硝化的全程自養(yǎng)脫氮(Completely Autotrophic Nitrogen Removal Over Nitrite, CANON)作用,構(gòu)建CANON型人工濕地反應(yīng)體系已成為當(dāng)前人工濕地強(qiáng)化脫氮研究的熱點之一[4].CANON作用依賴于好氧氨氧化菌(AOB)和厭氧氨氧化菌(anammox)的相互作用關(guān)系:AOB在有氧條件下將 NH4+-N氧化成NO2--N并消耗O2,從而為anammox創(chuàng)造了缺氧環(huán)境;anammox則在缺氧條件下把前者生成的NO2--N與未參與氧化的NH4+-N轉(zhuǎn)化成N2,并生成少量的 NO3--N[5].相比于傳統(tǒng)脫氮技術(shù),CANON作用可節(jié)省63%的耗氧量和將近100%的外加有機(jī)碳源[6].由于人工濕地填料層中生物膜結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部微環(huán)境相對復(fù)雜,使得該系統(tǒng)可分別為AOB和anammox提供其合適的微環(huán)境,使其擁有各自合適的生態(tài)位,這便為人工濕地中CANON作用的發(fā)生和強(qiáng)化提供了可能.通常認(rèn)為,濕地填料層中 DO濃度與分布的調(diào)控是CANON型人工濕地在構(gòu)建過程中的關(guān)鍵參數(shù)[7].在前期相關(guān)研究中,研究者們通過改進(jìn)濕地系統(tǒng)運(yùn)行方式(如采取分流、設(shè)置飽和層等)或優(yōu)化其結(jié)構(gòu)(如填充高性能填料、改變填料填充方式等)等措施調(diào)控填料層中的 DO濃度與分布,使CANON作用在人工濕地中得到了不同程度的強(qiáng)化[7-12].然而,上述手段的采用卻均會引起濕地系統(tǒng)建設(shè)運(yùn)行費用的增加及其操作方式的復(fù)雜化,不利于該技術(shù)的工程化應(yīng)用.

近年來,潮汐流人工濕地(TFCW)作為一種間歇式進(jìn)水的新型人工濕地系統(tǒng)得到了重視和應(yīng)用[13].其中,TFCW填料層中DO濃度及分布的變化可通過調(diào)節(jié)系統(tǒng)的排水速率(vd)來實現(xiàn)[14].因此,如能為TFCW設(shè)置較為適宜的vd,便可在其填料層中形成較佳的限氧微環(huán)境,進(jìn)而可為系統(tǒng)中CANON作用的強(qiáng)化提供有利條件.值得注意的是,由于vd是由TFCW的排水閥進(jìn)行調(diào)節(jié),則該措施在實施過程中的操作便相對簡便,且不會明顯增加 CANON型人工濕地的建設(shè)運(yùn)行費用,有助于該系統(tǒng)構(gòu)建方式的改進(jìn).

目前,國內(nèi)外關(guān)于通過調(diào)控系統(tǒng) vd進(jìn)而強(qiáng)化TFCW 中 CANON作用的研究尚鮮見報道.為此,本研究以TFCW為試驗裝置,探究了不同vd條件下系統(tǒng)脫氮性能及其微生物特性的變化,并對TFCW宏觀工藝運(yùn)行性能和微觀生物學(xué)特征之間的關(guān)系進(jìn)行了初步解析.期望通過此研究,可為CANON型人工濕地的設(shè)計及工程化應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

TFCW 試驗裝置位于溫室內(nèi)(T≈25℃),各裝置表面積約為314cm2(φ≈20cm).濕地填料層孔隙率為40.30%(即其有效體積為10.12L),厚度則為80cm:下層(70～80cm)為礫石支撐層(填充粒徑:10～15mm);上層(0～70cm)為廢磚塊填料層(填充粒徑:2～5mm).濕地中種植蘆葦,蘆葦數(shù)量為64株/m2.TFCW 頂部設(shè)置有穿孔管,以此作為系統(tǒng)的進(jìn)水管,出水管則設(shè)置于距試驗裝置底部 5cm處.濕地裝置側(cè)壁按不同高度設(shè)置有4個取樣管,該取樣管主要用于填料樣品的采集.TFCW 開始運(yùn)行之前,以污水處理廠的二沉池污泥作為接種污泥,對填料進(jìn)行3個月的掛膜.而后,系統(tǒng)進(jìn)入后續(xù)試驗階段.

1.2 運(yùn)行方式

TFCW按照潮汐流運(yùn)行方式連續(xù)運(yùn)行(圖1),每天運(yùn)行 3個周期,每個周期 8h:周期之初將10.00L進(jìn)水由進(jìn)水管泵入系統(tǒng)中(t=10min);而后,填料層處于淹水狀態(tài)并反應(yīng)6.0h;反應(yīng)結(jié)束后,通過出水管將系統(tǒng)排空;而后系統(tǒng)進(jìn)入閑置期,即一個周期共包括進(jìn)水期、淹水期、排水期和閑置期4個階段.該過程中 TFCW 的水力負(fù)荷(HLR)為0.96m3/(m2·d).

本研究設(shè)置了5種不同的vd值,分別為2.00,1.00,0.67,0.50和0.40L/min(即系統(tǒng)的排水期時長分別為5,10,15,20和25min,對應(yīng)的閑置期時長分別為105,100,95,90和85min),以期通過改變系統(tǒng)的vd進(jìn)而調(diào)控TFCW填料層中的DO含量.按照vd值的不同可將 TFCW 劃分為 5組,分別定義為:T-A (vd=2.00L/min),T-B (vd=1.00L/min),T-C(vd=0.67L/min),T-D (vd=0.50L/min)和 T-E (vd=0.40L/min),各系統(tǒng)在試驗期間共運(yùn)行了360d.

圖1 TFCW的構(gòu)型與運(yùn)行方式Fig.1 Configuration and operation schematic of each TFCW

1.3 進(jìn)水水質(zhì)

試驗用水為安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園區(qū)內(nèi)生活污水.原水經(jīng)沉淀處理后,取上清液作為TFCW的進(jìn)水.其中,進(jìn)水中TSS濃度為(65.12±24.51)mg/L,COD濃度為(279.40±37.72)mg/L,BOD濃度為(128.13±32.57)mg/L,NH4+-N 濃度為(35.54±1.80) mg/L,NO2--N 濃度為(2.80±0.57)mg/L,NO3--N濃度為

(1.72±0.18)mg/L,TN 濃度為(42.97±2.85) mg/L,TP 濃度為(8.64±2.39)mg/L,進(jìn)水 pH 值為(7.74±0.58).

1.4 分析方法

1.4.1 水樣采集及分析方法 每天采集 TFCW進(jìn)出水水樣進(jìn)行分析.待各組TFCW運(yùn)行穩(wěn)定后,在系統(tǒng)淹水期內(nèi)每隔 60min采集填料層中的水樣,以期監(jiān)測典型周期內(nèi)各系統(tǒng)中污染物的實時變化特征.水樣中COD、TN、NH4+-N、NO3--N、NO2--N和TP的測定方法均參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》[15]中的標(biāo)準(zhǔn)方法,各系統(tǒng)填料層中DO濃度的測定則采用多功能水質(zhì)分析儀(Multi 340i, WTW)進(jìn)行原位測定.

1.4.2 填料樣品的采集 待各組TFCW運(yùn)行穩(wěn)定后,分別對各系統(tǒng)進(jìn)行填料樣品的采集.在采集過程中,從每個系統(tǒng)的各個取樣管中采集填料樣品,混合均勻后以備后續(xù)相關(guān)分析.

1.4.3 亞硝化活性、硝化活性與反硝化活性測定 各系統(tǒng)中填料層樣品的亞硝化活性、硝化活性與反硝化活性測定均參照文獻(xiàn)[16-17]中的方法進(jìn)行.

1.4.4 熒光原位雜交(FISH)分析 采用FISH技術(shù)對各系統(tǒng)生物膜中AOB和anammox的相對數(shù)量及分布進(jìn)行分析.試驗中所用到的寡核苷酸探針均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.從各系統(tǒng)填料層中分別取樣后,生物膜樣品的預(yù)處理可參照文獻(xiàn)[18]中所述方法.而后,對預(yù)處理后的樣品進(jìn)行雜交,雜交方法主要參考文獻(xiàn)[19]中所述方法.所用探針和雜交條件則如表 1所示.雜交后樣品用激光共聚焦顯微鏡 LSM 510META(Zeiss, Germany)觀察,FISH 圖片則用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics, America)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析.

1.4.5 脫氮功能基因定量分析 使用土壤DNA試劑盒(D5625-01Omega USA)對各系統(tǒng)生物膜中的DNA進(jìn)行提取純化.提取后的DNA產(chǎn)物經(jīng)紫外分光光度計測定核酸濃度和純度,置于冰箱中-20℃保存.基于提取的 DNA 樣品,對其中的bacterial 16S rRNA以及生物脫氮過程中的關(guān)鍵功能基因(即amoA、anammox 16S rRNA、nxrA、narG、napA、nirS、nirK、qnorB和nosZ)進(jìn)行熒光定量PCR測定.熒光定量PCR分析使用的儀器為 Applied Biosystems StepOneTM,試驗采用SYBR Green I熒光染料法進(jìn)行測試,擴(kuò)增體系如下:10μL SYBR Green I PCR master mix (Applied Biosystems, USA)、8μL DEPC 處理水(Applied Biosystems)、正反向引物各0.5μL、DNA模板1μL,共20μL.每種功能基因的引物種類及反應(yīng)條件均參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行.

表1 FISH分析中所用探針及雜交條件Table 1 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes during the analysis of FISH

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析.采用單因素(one-way ANOVA)進(jìn)行方差分析,采用利用逐步線性回歸模型解析氮素轉(zhuǎn)化速率與相關(guān)脫氮功能基因的定量響應(yīng)關(guān)系.利用 Origin 8.5軟件作圖.文中相關(guān)污染物的去除率、去除負(fù)荷、累積速率及累積率均參照文獻(xiàn)[21]中的方法進(jìn)行計算.圖中相關(guān)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差.

2 結(jié)果與分析

2.1 vd對TFCW運(yùn)行效能的影響

表2 不同vd條件下TFCW對污染物的去除效果(mg/L)Table 2 Contaminants removal of TFCW under vd constraints(mg/L)

不同vd條件下各組TFCW對進(jìn)水中污染物的去除效果如表2所示.由表2可知,5種vd條件下各系統(tǒng)出水中TSS的平均濃度均低于20.00mg/L,鑒于進(jìn)水中TSS的濃度偏低[≈ 65.12±4.51]mg/L],試驗期間各 TFCW 對 TSS的去除率均維持在(73.89±0.37)%.各組TFCW對COD和BOD的去除率均較高,平均去除率均大于 90%.研究表明,人工濕地對有機(jī)物的去除主要依靠植物的吸收和填料層中微生物的作用[1],而 vd的減小并未對有機(jī)物的去除產(chǎn)生影響,即各系統(tǒng)在試驗階段均有著良好的有機(jī)物去除效果.各組TFCW對TP的去除效果均較佳(表 2),平均去除率可達(dá)(91.71±0.35)%.填料的吸附沉淀作用通常被認(rèn)為是人工濕地系統(tǒng)除磷的最主要途徑,篩選具有較強(qiáng)磷素吸附能力的填料是保障濕地系統(tǒng)高效除磷的關(guān)鍵[22].王振等[23]研究表明,廢磚塊對磷素的最大理論吸附容量可達(dá)0.594mg/g,是一種較為理想的人工濕地除磷填料.為此,TFCW 中廢磚塊的填充有效地保證了其對TP的高效去除,vd的變化亦未對TFCW的除磷效果產(chǎn)生顯著影響.

圖2 淹水期各TFCW填料層中的DO濃度變化Fig.2 Variations of DO concentrations in the bed of each TFCW during the flood phase

vd的變化可顯著影響TFCW的脫氮性能.結(jié)合表2、圖2和圖3可知,當(dāng)vd為2.00L/min時,典型周期內(nèi)T-A填料層中的DO濃度在淹水期之初高達(dá)(4.33±0.31)mg/L,而后,約 97.69%的 DO在淹水期被消耗,系統(tǒng)出水中 DO的平均濃度降至(0.10±0.03)mg/L.充足的 DO 有利于系統(tǒng)硝化能力的提高,此時T-A的亞硝化活性和硝化活性分別為(7.77±1.86)和(4.87±1.15) mg(O2)/[kg(填料)·h],其對進(jìn)水中 NH4+-N 的去除負(fù)荷可達(dá)(101.70±4.92)mg/(L·d),即進(jìn)水中95.38%的NH4+-N可被氧化.然而,由于系統(tǒng)填料層中的DO濃度過高,進(jìn)水中有機(jī)碳源較為匱乏且BOD5/N(≈2.98)亦較低,T-A的反硝化能力受到抑制,其反硝化強(qiáng)度 僅 為 (1.18±0.31)mg(NOx--N)/[kg(填 料 )·h].T-A對TN的去除效果亦不理想,其對TN的去除負(fù)荷僅為(2.22±1.07)mg/(L·d),系統(tǒng)出水中的氮素主要以 NO3--N 為主,濃度高達(dá)(34.49±2.50)mg/L,NO2--N 積累率(NAR)則為(14.44±5.32)%.當(dāng) vd為1.00L/min時,淹水期之初T-B填料層中的DO濃度較T-A有所下降[≈(2.97±0.64)mg/L].此條件下系統(tǒng)的亞硝化活性為(7.68±2.95)mg(O2)/[kg(填 料 )·h],但 其 硝 化 強(qiáng) 度 卻 降 至 (1.80±0.40)mg(O2)/[kg(填料)·h].相應(yīng)地,T-B 對 NH4+-N的去除負(fù)荷雖高達(dá)(101.88±8.96)mg/(L·d),但出水中NO2--N的濃度顯著升高[≈(28.85±7.30)mg/L],系統(tǒng)的 NAR 增至(72.25±3.17)%.究其原因,應(yīng)與T-B中亞硝酸鹽氧化菌(NOB)的生長受到抑制有關(guān)[24].另一方面,相較于T-A,T-B對TN的去除負(fù)荷并無顯著改善[≈(9.12±3.06)mg/(L·d)],系統(tǒng)的反硝化能力亦較弱,其反硝化活性為(1.30±0.22)mg(NOx--N)/[kg(填料)·h].隨著 vd繼續(xù)降至0.67L/min,T-C填料層中的DO濃度在淹水期之初進(jìn)一步下降[≈(1.64±0.24)mg/L],即系統(tǒng)中形成了較為嚴(yán)格的限氧環(huán)境,此時T-C的硝化活性較T-A和T-B進(jìn)一步降低,其亞硝化活性亦有降低,但系統(tǒng)對 NH4+-N 的去除負(fù)荷仍舊達(dá)(101.31±6.78) mg/(L·d).值得注意的是,雖然T-C的反硝化活性僅為(1.34±0.36)mg(NOx--N)/[kg(填料)·h],但系統(tǒng)對 TN 的去除負(fù)荷卻增至(84.00±7.36)mg/(L·d).與T-B相比,T-C出水中NO2--N的濃度降至(7.34±3.34)mg/L,系統(tǒng)的 NAR 亦降至(49.03±10.12)%.當(dāng)vd設(shè)置為0.50L/min時,穩(wěn)定運(yùn)行期間T-D對 TN與 NH4+-N的去除負(fù)荷分別可達(dá)(116.79±13.16)和(102.75±4.35)mg/(L·d).與其他 4組TFCW相比,T-D的脫氮性能達(dá)到最佳.系統(tǒng)填料層中的 DO濃度在淹水期之初約為(1.01±0.15)mg/L,其亞硝化活性、硝化活性和反硝化活性分別為(4.53±0.73)mg(O2)/[kg(填料)·h]、(0.66±0.16)mg(O2)/[kg( 填 料 )·h]和 (1.23±0.32)mg(NOx--N)/[kg(填料)·h].基于上述試驗結(jié)果推斷,在進(jìn)水中有機(jī)碳源匱乏且填料層嚴(yán)格限氧的條件下,CANON作用極有可能在TFCW中得以發(fā)生和強(qiáng)化.然而,當(dāng)vd繼續(xù)降低至0.40L/min時,淹水期之初 T-E填料層中的 DO濃度僅為(0.53±0.10)mg/L,由此導(dǎo)致 T-E的亞硝化活性僅為(2.24±0.76)mg(O2)/[kg(填料)·h],系統(tǒng)的硝化活性與反硝化活性亦處于相對較低的水平,分別為(0.23±0.08)mg(O2)/[kg(填 料 )·h]和 (1.35±0.34)mg(NOx--N)/[kg(填料)·h].此時 T-E 的脫氮性能較T-D出現(xiàn)下降,其TN和NH4+-N的去除負(fù)荷分別為(97.65±14.20)和(83.10±12.05) mg/(L·d),系統(tǒng)出水中 NH4+-N 的濃度高達(dá)(7.84±4.23)mg/L.此試驗結(jié)果表明,過低的vd會使TFCW的復(fù)氧能力遭到過分削弱,隨之會引起系統(tǒng)中短程硝化效果的惡化,進(jìn)而影響TFCW的脫氮性能.

圖3 不同vd條件下TFCW的亞硝化活性、硝化活性和反硝化活性Fig.3 The potential nitritation activities, potential nitrification activities and potential denitrification activities of the TFCWs under vd constraints

2.2 FISH分析結(jié)果

為考察不同 vd條件下各 TFCW 生物膜中AOB和 anammox的富集情況,分別在各系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行期對其進(jìn)行生物膜樣品的采集,固定后用相應(yīng)的特異性熒光探針(Nso190、PLA46和AMX820)進(jìn)行雜交.圖 4表明,當(dāng) vd分別為 2.00和 1.00L/min時,T-A和 T-B生物膜樣品中AOB(綠色)的豐度均較高,但并未檢測到雜交PLA46或AMX820探針的anammox(紅色).結(jié)合2.1中試驗結(jié)果可知,兩組系統(tǒng)此時均可在一定程度上視為硝化生物濾池.當(dāng) vd＜1.00L/min后,TFCW填料層中的限氧環(huán)境不斷增強(qiáng),與上述兩組系統(tǒng)相比,T-C和 T-D生物膜樣品中anammox的豐度均顯著提高,AOB的豐度則有所下降,但下降趨勢并不顯著.此條件下兩種功能微生物較高的菌群豐度可為系統(tǒng)中 CANON作用的強(qiáng)化提供保障.研究表明[25],在CANON反應(yīng)體系中,AOB和 anammox通常分別位于生物膜的外層和內(nèi)層,如此可以保證CANON系統(tǒng)較為理想的脫氮性能.然而,亦有研究指出[26],在某些CANON系統(tǒng)中,AOB和anammox之間并無明顯的空間分布差異,二者混在一起生長.本文所得的試驗結(jié)果便與后者類似.值得注意的是,較T-C和T-D而言,AOB和anammox的菌群豐度在T-E中均顯著下降.由此可推斷,當(dāng) vd＜0.50L/min時,TFCW 的復(fù)氧能力會遭到過分削弱,系統(tǒng)中AOB和anammox的增殖與富集相繼會受到影響,進(jìn)而不利于系統(tǒng)脫氮.該結(jié)果亦與 2.1中的試驗結(jié)果相對應(yīng).

2.3 vd對TFCW中脫氮功能基因豐度的影響

待各組TFCW運(yùn)行穩(wěn)定后,分別測定了各系統(tǒng)中脫氮功能基因的豐度(圖5).圖5表明,各系統(tǒng)中 bacterial 16S rRNA基因拷貝數(shù)均維持在(1.20×109～1.30×109)copies/g,即 vd的變化并未顯著影響TFCW中的微生物總量.通常認(rèn)為,穩(wěn)定且充足的微生物量可為TFCW中CANON作用的強(qiáng)化提供保障[8].

研究表明,amoA和 anammox bacterial 16S rRNA分別是參與NH4+-N轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因[27-28],而 nxrA則是參與 NO2--N氧化過程的關(guān)鍵基因[29].由圖 5可知,T-A 中的 amoA、nxrA和anammox bacterial 16S rRNA基因拷貝數(shù)分別為6.41×105、1.73×104和 7.00×102copies/g.其中,amoA和nxrA的基因拷貝數(shù)顯著高于anammox bacterial 16S rRNA的基因拷貝數(shù).結(jié)合2.1中結(jié)果可知,硝化作用應(yīng)是T-A中NH4+-N去除的主要途徑.當(dāng)vd設(shè)置為1.00L/min時,T-B中的amoA和anammox bacterial 16S rRNA基因拷貝數(shù)較T-A 中無顯著變化,分別為 6.80×105和 8.30×102copies/g, anammox bacterial 16S rRNA基因拷貝數(shù)仍保持在較低水平,但nxrA基因拷貝數(shù)卻顯著下降至8.09×103copies/g.隨著vd的降低,T-B填料層中的 DO濃度較 T-A出現(xiàn)降低,導(dǎo)致 NOB的生長受到抑制,NOB數(shù)量亦下降,從而引起了nxrA基因拷貝數(shù)的下降.相比于 T-A和 T-B,當(dāng)vd設(shè)置為0.67L/min時,T-C中的amoA基因拷貝數(shù)下降至5.17×105copies/g,nxrA基因拷貝數(shù)亦繼續(xù)降至 1.87×103copies/g,而 anammox bacterial 16S rRNA 基因拷貝數(shù)此時卻增至 9.68×104copies/g.該試驗結(jié)果進(jìn)一步證實,隨著填料層中限氧環(huán)境的進(jìn)一步增強(qiáng),T-C中的厭氧氨氧化作用開始得到強(qiáng)化,從而有利于系統(tǒng)中 CANON作用反應(yīng)體系的構(gòu)建.當(dāng)vd為0.50L/min時,T-D中的amoA、nxrA和anammox bacterial 16S rRNA基因拷貝數(shù)分別為 3.45×105、7.50×102和2.59×105copies/g,此時TFCW中的CANON作用可得到最大限度的強(qiáng)化,系統(tǒng)的脫氮性能隨之達(dá)到最佳.當(dāng)vd設(shè)為0.40L/min時,與T-D相比,T-E中的amoA和anammox bacterial 16S rRNA基因拷貝數(shù)出現(xiàn)明顯下降,分別為 1.64×105和1.51×105copies/g,該系統(tǒng)對TN和NH4+-N的去除負(fù)荷較 T-D 亦出現(xiàn)下降.基于前述結(jié)果,當(dāng)過低的vd嚴(yán)重削弱TFCW的復(fù)氧能力時,會造成系統(tǒng)填料層中DO濃度的相對不足,使得amoA基因拷貝數(shù)降低,CANON反應(yīng)隨之便無法得到最大程度的強(qiáng)化.

圖4 穩(wěn)定運(yùn)行階段TFCW中生物膜樣品的FISH圖Fig.4 FISH images of the biofilm samples in TFCWs during the stabilization stage

反硝化過程是反硝化菌將NO3--N最終還原為 N2的生物化學(xué)過程,該過程可表述為[30]:NO3--N→NO2--N→NO→N2O→N2.參與上述 4步還原過程的關(guān)鍵基因分別為 narG、napA、nirK、nirS、qnorB和nosZ.其中,narG和napA均可編碼 NO3--N 還原酶的催化中心,是參與反硝化過程第一步還原反應(yīng)(NO3--N→NO2--N)的 2種關(guān)鍵基因[31];而亞硝酸鹽還原酶 Nir催化NO2--N還原為NO的過程則通常是反硝化過程的限速步驟,也是區(qū)別于其他硝酸鹽代謝的標(biāo)志性反應(yīng)[32].亞硝酸鹽還原酶包括細(xì)胞色素型(由nirS基因編碼)和Cu型(由nirK基因編碼),對nirS和nirK基因的定量研究能夠準(zhǔn)確反映出系統(tǒng)中反硝化菌群的豐度[33].另外,qnorB和nosZ基因分別編碼 NO還原酶和 N2O還原酶的催化中心[34-35],分別是參與反硝化過程第3步和第4步還原反應(yīng)的關(guān)鍵基因.由圖 5可知,各 TFCW 中narG、napA、nirS、nirK、qnorB和nosZ基因拷貝數(shù)均維持在較低水平且并無顯著變化,即vd的下降雖使得TFCW的復(fù)氧能力不斷遭到削弱,但并未顯著提高系統(tǒng)的反硝化性能.究其原因,應(yīng)與進(jìn)水中較低的 BOD5/N(≈2.98)有關(guān).由此亦可推斷,生物反硝化作用對各TFCW脫氮的貢獻(xiàn)并不顯著.

圖5 不同vd條件下TFCW中相關(guān)脫氮功能基因的變化Fig.5 Absolute abundance of nitrogen transformation functional genes in the TFCW under vd constraints

2.4 TFCW中氮素轉(zhuǎn)化與脫氮功能基因的響應(yīng)關(guān)系

基于2.1和2.3中的試驗結(jié)果,利用逐步線性回歸模型解析了TFCW中各形態(tài)氮素轉(zhuǎn)化速率與相關(guān)脫氮功能基因豐度的定量響應(yīng)關(guān)系(表3).由表3可知,4組回歸模型的R2值均大于0.932.

TN去除速率[v(TN)]主要受3個變量的影響,即(anammox 16S rRNA/amoA)、bacterial 16S rRNA和(nxrA/bacteria 16S rRNA).前2組變量均與 v(TN)呈正相關(guān)關(guān)系,而(nxrA/bacteria 16S rRNA)則與 v(TN)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.如前所述,CANON作用依賴于AOB和anammox的相互作用關(guān)系,且 CANON作用的強(qiáng)化有利于系統(tǒng) TN去除效率的提高,變量(anammox 16S rRNA/amoA)便在一定程度上體現(xiàn)了TFCW中CANON作用的強(qiáng)弱.該作用越強(qiáng),v(TN)便越高.bacterial 16S rRNA則表明TFCW中微生物量的增加會促進(jìn)系統(tǒng)對TN的去除效果.而由變量(nxrA/bacteria 16S rRNA)可知,功能基因nxrA相對豐度的增加會導(dǎo)致系統(tǒng)中 NO2--N 的進(jìn)一步氧化,隨之不利于 CANON反應(yīng)的進(jìn)行.該回歸方程表明,CANON作用是各TFCW中TN去除的主要途徑,填料層中 DO濃度的調(diào)控則是保障系統(tǒng)中CANON反應(yīng)順利進(jìn)行的關(guān)鍵.

NH4+-N 去除速率[v(NH4+-N)]主要受(amoA/bacteria 16S rRNA)和(anammox 16S rRNA/amoA)兩個變量的影響,且其均與 v(NH4+-N)呈正相關(guān)關(guān)系.如前所述,amoA基因是參與好氧氨氧化過程的關(guān)鍵基因,其豐度變化可在一定程度上反映出系統(tǒng)對 NH4+-N的去除效果.而變量(anammox 16S rRNA/amoA)則表明CANON作用也是TFCW中NH4+-N去除的主要途徑之一.由此可知,TFCW中NH4+-N的去除主要依靠短程硝化作用和CANON作用2種途徑.

[(narG+napA)/amoA]、[nxrA/(nirS+nirK)]和(anammox 16S rRNA/amoA)是影響NO3--N累積速率[v(NO3--N)]的3個變量.其中,[nxrA/(nirS+nirK)]和(anammox 16S rRNA/amoA)均與v(NO3--N)呈正相關(guān)關(guān)系,而[(narG+napA)/amoA]則與v(NO3--N)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.由于amoA與nxrA均是參與硝化過程的關(guān)鍵基因,此 2種基因豐度的增加有利于TFCW中NO3--N的累積,而narG、napA、nirS和nirK均是參與反硝化過程的關(guān)鍵基因,上述 4種基因豐度的增加則會促進(jìn)系統(tǒng)中NO3--N的還原.另外,(anammox 16S rRNA/amoA)表明CANON作用也可引起系統(tǒng)中NO3--N累積.由此回歸方程可知,硝化作用和 CANON作用是造成TFCW中NO3--N累積的主要原因,而反硝化作用則是系統(tǒng)中 NO3--N 去除的主要途徑,此結(jié)果亦與Wang等[36]的研究結(jié)論一致.

另外,NO2--N累積速率[v(NO2--N)]主要受到(anammox 16S rRNA/amoA)和(amoA/nxrA)兩個變量的影響.其中,變量(amoA/nxrA)與v(NO2--N)呈正相關(guān)關(guān)系,而變量(anammox 16S rRNA/amoA)與v(NO2--N)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系.此方程表明,硝化作用與CANON作用是參與TFCW中NO2--N轉(zhuǎn)化的兩種主要途徑.此結(jié)果亦體現(xiàn)了系統(tǒng)填料層中生物膜結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部微環(huán)境的復(fù)雜性.

表3 TFCW中氮素轉(zhuǎn)化速率與脫氮功能基因的定量響應(yīng)關(guān)系Table 3 Quantitative response relationships between nitrogen transformation rates and functional genes (n=20)

3 討論

在本研究中,由于進(jìn)水中有機(jī)碳源較為匱乏且BOD5/N較低,試驗階段各TFCW的反硝化作用始終受到明顯抑制,但vd的變化卻能顯著影響AOB、NOB和anammox在各系統(tǒng)中的豐度與活性,進(jìn)而可造成各 TFCW 脫氮性能的差異.當(dāng) vd為2.00L/min時,T-A的復(fù)氧能力較強(qiáng),淹水期內(nèi)系統(tǒng)填料層中的DO較為充足,AOB和NOB隨之成為系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌群,從而保障了系統(tǒng)中硝化作用的順利進(jìn)行.然而,由于此時TFCW的反硝化能力較弱,導(dǎo)致該條件下系統(tǒng)的脫氮性能不佳.當(dāng) vd下降至 1.00L/min時,排水速率的減小使T-B的復(fù)氧能力遭到削弱,進(jìn)而導(dǎo)致淹水期內(nèi)填料層中的DO濃度下降.鑒于AOB對DO具有較高的親和力,其菌群數(shù)量此時并未受到明顯影響;而NOB卻由于對DO濃度的變化極為敏感,其活性隨 DO濃度的降低而受到抑制,菌群數(shù)量亦顯著減少,導(dǎo)致 NO2--N的氧化過程受到抑制,進(jìn)而造成系統(tǒng)中的 NO2--N出現(xiàn)了一定程度的積累.而隨著vd的進(jìn)一步降低,T-C填料層在淹水期間長期處于限氧環(huán)境,促進(jìn)了anammox的增殖并保證了短程硝化的發(fā)生與穩(wěn)定,從而實現(xiàn)了系統(tǒng)中CANON作用的強(qiáng)化,提高了T-C的脫氮效能.當(dāng)vd設(shè)置為0.50L/min時,T-D中的CANON作用可得到最大限度的強(qiáng)化,系統(tǒng)的脫氮性能亦達(dá)到最佳.然而,當(dāng)vd進(jìn)一步降至0.40L/min后,TFCW的復(fù)氧能力由于遭到過分削弱導(dǎo)致填料層中的DO濃度過低,使AOB和anammox的數(shù)量和活性均受到抑制,該條件下系統(tǒng)中的 CANON作用便無法得到最大程度的強(qiáng)化,從而造成T-E的脫氮性能較 T-D 有所下降.綜上所述,通過對系統(tǒng) vd的合理設(shè)置可實現(xiàn)TFCW中CANON作用的強(qiáng)化,進(jìn)而完成CANON型人工濕地系統(tǒng)的構(gòu)建.此種濕地系統(tǒng)可彌補(bǔ)人工濕地在處理低碳氮比污水時脫氮效率偏低的缺陷,緩解 DO和有機(jī)碳源對人工濕地脫氮效果的制約.

在試驗過程中,由于 TFCW 試驗裝置的表面積有限,致使?jié)竦刂参镌谙到y(tǒng)脫氮過程中所起的作用較小(數(shù)據(jù)未列出).然而,考慮到在實際工程中植物對于人工濕地中污染物的去除貢獻(xiàn)[2],在后續(xù)的中試研究中,筆者會進(jìn)一步深入考察濕地植物對CANON型人工濕地構(gòu)建過程的影響,以期為新型人工濕地的設(shè)計及工程化應(yīng)用提供幫助.

4 結(jié)論

4.1 vd可顯著影響TFCW中脫氮功能微生物的數(shù)量與活性,進(jìn)而影響其氮素轉(zhuǎn)化速率;

4.2 vd的適當(dāng)降低(即由1.00降至0.50L/min)可使 TFCW 填料層中逐漸形成較為適宜的限氧環(huán)境,有利于anammox的富集與短程硝化的實現(xiàn),進(jìn)而有利于CANON反應(yīng)體系在TFCW中的構(gòu)建.

4.3 當(dāng)vd為0.50L/min時,TFCW中的CANON作用可得到最大限度的強(qiáng)化,系統(tǒng)的脫氮性能達(dá)到最佳,其 TN和 NH4+-N的去除負(fù)荷分別可達(dá)(116.79±13.16)和(102.75±4.35)mg/(L·d).

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