李 為劉 偉鄒君君

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208；3湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005）

胃癌是消化道腫瘤之一。根據(jù)全國腫瘤登記中心收集的腫瘤登記資料評估，我國胃癌每年的新發(fā)病例約為41.0萬，發(fā)病率居消化道腫瘤的第1位，占全球胃癌發(fā)病人數(shù)的42.6%，每年死亡病例約為29.4萬，死亡率僅次于肝癌，居消化道腫瘤死亡人數(shù)的第2位，胃癌的發(fā)生與長期的幽門螺桿菌感染密切相關(guān)［1-2］。人參皂苷是人參、西洋參及人參制劑中的主要活性成分，其可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯、凋亡及分化、增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的免疫、抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等［3-4］。人參皂苷Rg5屬于原人參二醇人參皂苷，研究表明，人參皂苷Rg5可顯著誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞G0/G1細(xì)胞周期阻滯，并可通過升高Bax、Caspase-6、Caspase-7蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡；此外，人參皂苷Rg5可誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞和MS751細(xì)胞凋亡［5-6］。但是人參皂苷Rg5對胃癌的作用尚未見報道，本研究通過體外實驗探討人參皂苷Rg5對胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖、凋亡作用，并探討其誘導(dǎo)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 試藥及儀器 人參皂苷Rg5（維克奇生物科技公司，批號：wkq16051102）。 RPMI-1640 培養(yǎng)基（公司：GIBCO。批號：31800022），胎牛血清（公司：GIBCO。 批號：10099141），蛋白免疫印跡常規(guī)試劑購于賽默飛世爾公司，Bax （批號：5023S）、Bcl-2 （批號：15071S）、βactin（批號：3700S）一抗購自 cell signaling 公司，二抗抗體購自賽默飛世爾公司（批號：A32733）；二氧化碳型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國New Brunswick公司，型號：Galaxy 170R），離心機(jī)（德國 eppendrof公司，型號：Centrifuge 5810 R），酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃酶標(biāo)儀，型號為MK3），蛋白質(zhì)電泳儀器 （美國Bio-Rad公司，型號：Mini-PROTEAN），凝膠成像系統(tǒng)（Syngene公司，型號：GBOX），流式細(xì)胞分析儀（美國BD公司，型號：Cytomics FC500）。1.3 細(xì)胞培養(yǎng) BGC-823細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行試驗。

1.4 干預(yù)方法 取對數(shù)生長期的胃癌BGC-823細(xì)胞1×105個/mL密度的單細(xì)胞懸液，接種到96孔板中，每孔100 μL，然后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，并將人參皂苷Rg5稀釋于不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，將不同濃度人參皂苷 Rg5溶液（0、6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L）依次加到預(yù)先鋪好細(xì)胞的96孔板上，每孔100 μL，設(shè)置5個平行孔。藥物分別處理24、48 h后，每孔加入20 μL CCK8溶液，設(shè)置加入相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK8溶液，同時設(shè)置不加藥物的對照組和只含培養(yǎng)基的空白組，將培養(yǎng)板在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度，計算各組細(xì)胞活力：各組細(xì)胞活力=各組吸光度/溶劑空白對照組吸光度×100%。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）細(xì)胞凋亡。取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×107/L接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化后收集，于室溫下1000 r/min離心5 min棄上清，PBS洗滌2次，1000 r/min離心5 min，75%冰乙醇固定24 h，400目篩網(wǎng)過濾1次，1000 r/min離心5 min棄上清，PBS洗滌1次，分別加入0.5 mL PI染色液，37℃避光溫浴30 min，隨后以4℃或冰浴避光存放。染色，24 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀在激光波長488 nm處檢測熒光強(qiáng)度及散射情況。2）Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。各組細(xì)胞分別培養(yǎng)48 h后，使用賽默飛世蛋白裂解液RIPA（強(qiáng)）提總蛋白，賽默飛世公司BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。取40 μg/孔蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，5%BSA室溫封閉2 h，分別加入適量稀釋后抗體 Bax（1∶5000）、Bcl-2（1∶5000）、β-actin（內(nèi)參，1∶10000），放置 4 ℃冰箱，搖床上孵育過夜；吐溫與三乙醇胺緩沖鹽水溶液（TBST）洗滌（15 min×3次），分別加入山羊抗小鼠（1∶5000）二抗，室溫?fù)u床勻速孵育 1 h，TBST 洗滌（15 min×2 次），TBS 洗滌（15 min×1次），加入適量增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）發(fā)光試劑，暗室內(nèi)曝顯影，圖像分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗及組間方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布及方差齊性，采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布、方差分析，采用Kruska-Wallis H進(jìn)行統(tǒng)計處理；組間兩兩比較采用LSD法。檢驗水準(zhǔn)為0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組BGC-823細(xì)胞存活率比較 見表1。CCK-8法檢測結(jié)果表明：與空白組相比，人參皂苷Rg5各劑量組的24、48 h存活率均下降；與空白組比較，人參皂苷Rg56.25 μmol/L 24、48 h存活率雖下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；人參皂苷 Rg512.50、25.0 μmol/L 24 h存活率下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而人參皂苷 Rg512.50、25.0 μmol/L 48 h 存活率、50.0、100.0 μmol/L 24 h存活率下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；50.0、100.0 μmol/L 48 h 存 活 率 、200.0 μmol/L 24、48 h存活率均下降，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）。 人參皂苷 Rg5處理 24、48 h后的 IC50分別為200.0 μmol/L 和 100.0 μmol/L。

表1 各組BGC-823細(xì)胞存活率比較（%，±s）

表1 各組BGC-823細(xì)胞存活率比較（%，±s）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

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2.2 各組BGC-823細(xì)胞凋亡率比較 見表2。分別用高濃度人參皂苷Rg5（100 μmol/L）、低濃度人參皂苷Rg5（50 μmol/L）作用于 BGC-823 細(xì)胞 48 h 后觀察細(xì)胞凋亡情況。與空白組比較，低濃度人參皂苷Rg5組凋亡比率升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組比較，高濃度高濃度人參皂苷Rg5組凋亡比率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高濃度人參皂苷Rg5組細(xì)胞的凋亡比率高于低濃度人參皂苷Rg5組比率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組BGC-823細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

表2 各組BGC-823細(xì)胞凋亡率比較（%，±s）

與人參皂苷 Rg5溶液 50.00 μmol/L 組比較，▲P＜0.05。

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2.3 各組BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2蛋白比較 見圖1，表3。與空白組比較，低濃度人參皂苷Rg5組Bax蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）；高濃度人參皂苷Rg5組Bax蛋白表達(dá)升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）；與低濃度人參皂苷Rg5組比較，高濃度人參皂苷Rg5組Bax蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與空白組比較，低濃度人參皂苷Rg5組Bcl-2蛋白表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；高濃度人參皂苷Rg5組Bcl-2蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與低濃度人參皂苷Rg5組比較，高濃度人參皂苷Rg5組Bcl-2蛋白表達(dá)降低升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 各組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

表3 各組BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2蛋白比較（±s）

表3 各組BGC-823細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2蛋白比較（±s）

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3 討 論

中醫(yī)學(xué)無胃癌一說，根據(jù)其癥狀多將其歸屬于“胃脘痛”“積聚”“胃反”的范疇，多由于正氣虧損，加之長期飲食不節(jié)、情志內(nèi)傷、瘀毒互結(jié)，導(dǎo)致胃失和降，脾胃功能失常，運(yùn)化失司所致；而正氣虧虛、臟腑功能失調(diào)是本病發(fā)生的內(nèi)在因素［7-8］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，諸多補(bǔ)益藥中提取的有效成分均具有抗腫瘤作用，而人參皂苷Rg5便是其中一員。研究表明，人參皂苷Rg5可治療食管癌、宮頸癌、乳腺癌，其抑制食管癌、宮頸癌、乳腺癌的作用機(jī)制均是通過抑制其腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯、凋亡實現(xiàn)的［5-6，9］。

細(xì)胞凋亡又被稱為程序性細(xì)胞死亡，其過程包括細(xì)胞降解DNA和蛋白質(zhì)，分裂成凋亡小體的片段。細(xì)胞凋亡是組織穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，受激活和抑制途徑相互作用的調(diào)控。細(xì)胞凋亡的逃避促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此現(xiàn)有的抗癌藥物多通過激活細(xì)胞死亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡達(dá)到治療目的［10-11］。Bcl-2家族蛋白是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)家族，由促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白組成，而Bcl-2是Bcl-2家族蛋白中重要的抑制細(xì)胞死亡因子，其過度表達(dá)可抑制細(xì)胞的凋亡過程；Bax是Bcl-2家族蛋白中重要的促進(jìn)凋亡因子，諸多腫瘤通過高表達(dá)Bcl-2來逃避細(xì)胞凋亡［12-13］。而Bcl-2家族是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，線粒體凋亡程序可激活Bax，導(dǎo)致線粒體外膜透化，釋放細(xì)胞色素C，激活下游Caspase蛋白家族，使其他膜間隙的蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；而Bcl-2位于線粒體膜上，可阻止細(xì)胞色素C的釋放，抑制細(xì)胞凋亡，且能與線粒體透化劑 Bax、Bak結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14-15］。

本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg5可抑制胃癌BGC-823細(xì)胞的增殖，促進(jìn)BGC-823細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg5可提高細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2蛋白的表達(dá)。說明人參皂苷Rg5促進(jìn)BGC-823細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與升高細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2蛋白的表達(dá)相關(guān)。

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