葉圣榮 施琳琦 李 丹 王雪雅 周興輝

（浙江省臺州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 臺州 317523）

腎臟缺血/再灌注（I/R）損傷是指處于缺血狀態(tài)下的腎臟組織恢復(fù)氧供應(yīng)或血流灌注后，腎臟組織出現(xiàn)損傷不能恢復(fù)至正常狀態(tài)的一種病理生理現(xiàn)象，常常發(fā)生在腎部分切除術(shù)、腎移植手術(shù)及心臟復(fù)蘇、心臟手術(shù)等較復(fù)雜的手術(shù)過程中［1］。研究表明，腎臟I/R不僅會導(dǎo)致急性腎功能衰竭，也是影響腎移植術(shù)后腎臟組織存活和功能恢復(fù)的危險(xiǎn)因素之一，嚴(yán)重者甚至造成死亡［2］。研究發(fā)現(xiàn)，缺血可導(dǎo)致腎臟組織缺氧，氧化應(yīng)激損傷、一氧化氮失衡可能參與腎缺血/再灌注損傷的發(fā)生過程，腎臟缺血缺氧可抑制腎功能作用，導(dǎo)致活性氧、一氧化氮等代謝產(chǎn)物累積，造成腎損傷［3］。傳統(tǒng)中藥黃芩具有瀉火解毒、清熱燥濕等功效，已有研究證明黃芩苷、黃芩莖葉總黃酮等成分對I/R損傷具有保護(hù)作用［4-5］，但其另一主要成分漢黃芩苷在腎I/R損傷中的作用尚不清楚。本研究通過構(gòu)建腎I/R大鼠模型，觀察漢黃芩苷對腎I/R模型大鼠腎功能及腎組織NF-κB/iNOS/NO通路的影響，旨在探究其保護(hù)I/R腎損傷的分子機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康SPF級SD大鼠70只，體質(zhì)量（180±10） g，7～8 周，上海邦耀生物公司，許可證號：SCXK（滬）-2013-0002。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，飲食，術(shù)前12h禁食不禁水。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器 漢黃芩苷（純度＞98%，批號H-019），購自成都瑞芬思生物公司；烏司他丁注射液 （批號H19990133），購自廣東天普生化醫(yī)藥公司；4%多聚甲醛、戊二醛、戊巴比妥鈉、HE染色試劑盒、蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒，購自上海生工生物技術(shù)公司；CAT試劑盒、SOD試劑盒、GSH試劑盒、MDA試劑盒、iNOS試劑盒、NO試劑盒，購自碧云天公司；DAB顯色試劑盒，購自中杉金橋公司；Anti-NF-κB、Anti-GAPDH，美國CST公司；AU5800全自動(dòng)生化檢測儀，購自美國Beckman Coulter公司；石蠟烤片機(jī)、切片機(jī)等，德國Leica公司；普通光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad公司等。

1.3 分組與造模 實(shí)驗(yàn)分組：按照隨機(jī)數(shù)表法將70只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、烏司他丁組及漢黃芩苷低、中、高劑量組，其中假手術(shù)組10只，其他各組每組12只。模型制備：參照文獻(xiàn)中制備腎I/R模型大鼠的方法進(jìn)行操作［6］。術(shù)前給予大鼠2.5%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，于腹部正中切口，暴露腎蒂，采用無創(chuàng)血管夾將左側(cè)腎蒂夾閉，維持腎臟缺血狀態(tài)45 min后移開血管夾，實(shí)現(xiàn)血液再灌注，同時(shí)手術(shù)摘除右側(cè)腎臟，迅速縫合手術(shù)切口，消毒后放回動(dòng)物房。術(shù)中、術(shù)后維持大鼠體溫均在（37±0.5）℃。假手術(shù)組不夾閉左側(cè)腎蒂僅打開腹腔后縫合。模型制備過程中，無動(dòng)物死亡，模型制備成功，術(shù)后正常給予常規(guī)飼養(yǎng)。藥物處理：漢黃芩苷低、中、高劑量組大鼠于術(shù)前7 d，定時(shí)給予漢黃芩苷 5、25、75 mg/（kg·d）灌胃治療；烏司他丁組大鼠于術(shù)前7 d，定時(shí)給予烏司他丁5 mg/（kg·d）灌胃治療；假手術(shù)組及模型組于術(shù)前7 d，定時(shí)給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃，再灌注24 h后，給予各大鼠2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，取腹主動(dòng)脈血5 mL用于腎功能檢測；立即取出大鼠左側(cè)腎臟，洗凈后對稱切半，一半置于4%多聚甲醛中固定，制備石蠟切片，用于HE染色和組織病理學(xué)觀察；一半切碎后分成兩份，置于液氮中速凍，-80℃保存。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 1）各組大鼠腎功能檢測。將血液標(biāo)本于4℃條件下3000 r/min離心10 min，取上清液置于全自動(dòng)生化檢測儀中測定血清肌酐（Scr）與血尿素氮（BUN）的含量。 2）蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察腎組織病理形態(tài)變化。大鼠腎組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化處理。按照HE法染色流程對切片進(jìn)行染色，中性膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下，觀察大鼠腎組織形態(tài)并采用半定量病理評估法對大鼠腎小管損傷程度進(jìn)行評價(jià)［6］。3）CAT 活性、SOD 活性、GSH 含量、 MDA 含量、iNOS含量、NO水平的測定。大鼠腎冷凍組織取出，制備腎組織勻漿液，嚴(yán)格按照過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒、一氧化氮合酶（iNOS）檢測試劑盒、一氧化氮（NO）檢測試劑盒操作說明書對腎組織勻漿液中CAT活性、SOD活性、GSH含量、MDA含量、iNOS活性、NO水平進(jìn)行測定。4）蛋白印記（WB）法檢測NF-κB蛋白表達(dá)水平。大鼠腎冷凍組織在液氮中研磨，加入1.2 mL蛋白裂解液，按照細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書，分別提取各組大鼠腎組織細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白總量。SDS-凝膠電泳后，半干法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；5%脫脂奶粉，封閉1 h；分別加入一抗 Anti-NF-κB-p65、Anti-GAPDH（1∶500），4 ℃孵育過夜；加入二抗（1∶5000），室溫孵育 1 h。 經(jīng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測，Tanon軟件拍攝圖像并進(jìn)行半定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組腎I/R大鼠腎功能指標(biāo)比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠Scr、BUN水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，漢黃芩苷低、中、高劑量組大鼠Scr、BUN水平均顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。

表1 各組腎I/R大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）

表1 各組腎I/R大鼠腎功能指標(biāo)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與漢黃芩苷低劑量組比較，※P＜0.05；與漢黃芩苷中劑量組比較，△P＜0.05。下同。

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2.2 各組腎I/R大鼠腎組織結(jié)構(gòu)的比較 見圖1，表2。如圖1所示，假手術(shù)組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)完整、腎小管結(jié)構(gòu)清晰、腎間質(zhì)無水腫、管腔無管型；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎小管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)上皮細(xì)胞水腫、脫落、小管結(jié)構(gòu)腫脹、小管腔凝固壞死等病變；漢黃芩苷低、中、高劑量組大鼠腎細(xì)胞組織損傷程度減輕，腎小管的上皮細(xì)胞腫脹、脫落及凝固壞死等病變損傷減輕。病理評分結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的腎組織病理評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，漢黃芩苷低、中、高劑量組大鼠腎組織病理評分均顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。

圖1 各組腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的比較（HE染色，400倍）

2.3 各組腎I/R大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織中CAT、SOD活性、GSH含顯著降低，MDA含量顯著升高 （P＜0.05）；與模型組比較，漢黃芩苷低、中、高劑量組大鼠腎組織中CAT、SOD活性、GSH含顯著升高，MDA含量顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。

表2 各組腎I/R大鼠腎組織病理評分比較（分，±s）

表2 各組腎I/R大鼠腎組織病理評分比較（分，±s）

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表3 各組大鼠腎組織中CAT活性、SOD活性、GSH含量、MDA含量比較（±s）

表3 各組大鼠腎組織中CAT活性、SOD活性、GSH含量、MDA含量比較（±s）

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2.4 各組腎I/R大鼠腎組織中NF-κB表達(dá)的影響見圖2和表4。如圖2所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織細(xì)胞質(zhì)中NF-κB蛋白水平顯著下降，細(xì)胞核中NF-κB蛋白水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，漢黃芩苷低、中、高劑量組大鼠腎組織細(xì)胞質(zhì)中NF-κB 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞核 NF-κB 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。

圖2 各組腎I/R大鼠腎組織NF-κB蛋白表達(dá)的比較

表4 各組大鼠腎組織NF-κB蛋白表達(dá)的比較（±s）

表4 各組大鼠腎組織NF-κB蛋白表達(dá)的比較（±s）

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2.5 各組腎I/R大鼠腎組織中iNOS活性、NO水平的比較 見表5。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織中iNOS活性、NO水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，漢黃芩苷低、中、高劑量組大鼠腎組織中iNOS活性、NO水平明顯降低（P＜0.05），呈劑量依賴效應(yīng)。

表5 各組大鼠腎組織中iNOS活性、NO水平的比較（±s）

表5 各組大鼠腎組織中iNOS活性、NO水平的比較（±s）

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3 討 論

I/R損傷指器官組織缺血一段時(shí)間恢復(fù)供血時(shí)，發(fā)生嚴(yán)重組織器官損傷及機(jī)能障礙，是某些疾病致死的重要原因［7］。由于腎臟是一個(gè)血液供應(yīng)十分豐富的器官，對缺血和I/R損傷十分敏感。為改善腎臟缺血/再灌注損傷的發(fā)生，很多學(xué)者針對腎I/R損傷發(fā)生的機(jī)制進(jìn)行了許多研究，如缺血預(yù)處理、縮短缺血時(shí)間、藥物干預(yù)等，以期減輕腎損傷。大量研究表明，黃酮類藥物的預(yù)處理具有減輕多種組織器官I/R損傷的作用［8］，其應(yīng)用前景值得期待。漢黃芩苷是來自黃芩的主要黃酮類成分之一，具有抑制氧化應(yīng)激、降低細(xì)胞凋亡等功能［9］。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，漢黃芩苷可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織中髓過氧化物酶的活性，具有保護(hù)急性肺損傷小鼠肺損傷的作用，可顯著改善小鼠巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞對肺組織的浸潤［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，漢黃芩苷可明顯減輕腎I/R所致腎功能障礙，降低血清中Scr、BUN水平，減輕腎臟組織病理損傷程度，提示漢黃芩苷對腎I/R所致腎功能損傷具有保護(hù)作用，但其作用機(jī)制尚不清楚。

腎組織中氧自由基等活性氧的增加是I/R造成腎組織損傷的主要原因之一，在腎I/R損傷過程中發(fā)揮著重要作用［11］?；钚匝酰≧OS）是具有氧性質(zhì)的一類非?；顫姷幕瘜W(xué)物質(zhì)，包括過氧化氫、超氧陰離子自由基、單線態(tài)氧等多種形式［12］。正常情況下，機(jī)體內(nèi)存在少量ROS，參與正常生理代謝過程，同時(shí)，機(jī)體中存在CAT、SOD、GSH等具有自由基清除活性酶的存在，負(fù)責(zé)監(jiān)控機(jī)體自由基系統(tǒng)，防止多余氧自由基的堆積［13］。當(dāng)機(jī)體發(fā)生腎I/R時(shí)，腎臟功能發(fā)生損傷，機(jī)體在黃嘌呤氧化酶作用下產(chǎn)生大量氧自由基，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出CAT、SOD、GSH等的清除能力，同時(shí)，腎損傷狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)抑制機(jī)體內(nèi)CAT、SOD活性下降，GSH水平降低，清除氧自由基的能力下降，導(dǎo)致氧自由基大量堆積，進(jìn)而與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等發(fā)生氧化作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，造成大量細(xì)胞損傷，進(jìn)而造成機(jī)體組織功能障礙［14］。Wang等發(fā)現(xiàn)，黃芩可通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制心肌細(xì)胞I/R所致細(xì)胞凋亡，保護(hù)機(jī)體損傷［15］。Senthamizhselvan等研究顯示，提奧米素預(yù)處理可通過抑制大鼠心臟組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)改善I/R所致心臟損傷［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎組織中CAT、SOD活性、GSH含顯著降低，MDA含量顯著升高；與模型組比較，漢黃芩苷低、中、高劑量組大鼠腎組織中CAT、SOD活性、GSH含量顯著升高，MDA含量顯著降低，表明漢黃芩苷預(yù)處理可增強(qiáng)腎組織對活性氧的清除能力，降低機(jī)體中脂質(zhì)過氧化物含量，提示漢黃芩苷可能通過抑制機(jī)體氧化應(yīng)激損傷實(shí)現(xiàn)對腎I/R損傷保護(hù)作用。

研究表明，氧化應(yīng)激不僅可以對組織細(xì)胞造成損傷，還能調(diào)節(jié)一系列凋亡相關(guān)基因的激活、表達(dá)及調(diào)控的細(xì)胞自主死亡過程［17］。另外，在氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中產(chǎn)生的ROS可促進(jìn)NF-κB與其抑制蛋白的分離，促進(jìn)NF-κB的釋放和激活，誘導(dǎo)iNOS等基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，iNOS可催化機(jī)體合成大量 NO［18］，NO 水平的失衡也是造成腎I/R損傷的原因之一。董永喜等發(fā)現(xiàn)，辛芍組方可能通過抑制NF-κB通路的活化，抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞 PC12的凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)作用［19］。Lisakovska等研究表明，維生素D3可通過抑制NF-κB/iNOS/NO通路的激活抑制Caspase-3依賴性凋亡和肝細(xì)胞的壞死，保護(hù)潑尼松龍誘導(dǎo)的肝臟損傷［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，腎I/R損傷后，大鼠腎組織細(xì)胞質(zhì)中NF-κB蛋白水平顯著下降，細(xì)胞核中NF-κB蛋白水平明顯升高；與模型組比較，漢黃芩苷低、中、高劑量組大鼠腎組織細(xì)胞質(zhì)中NF-κB蛋白水平顯著升高，細(xì)胞核NF-κB蛋白水平顯著降低，表明漢黃芩苷具有抑制NF-κB核轉(zhuǎn)移、抑制NF-κB/iNOS/NO通路激活的可能，提示漢黃芩苷可能通過抑制NF-κB/iNOS/NO通路發(fā)揮對I/R所致腎損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，漢黃芩苷可能是通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和NF-κB/iNOS/NO通路的激活，實(shí)現(xiàn)對I/R所致腎損傷的保護(hù)作用。

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