江泓慧 李 波，2* 馬 躍，2 徐艷春，2*

(1.東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040;2.國家林業(yè)局野生動植物檢測中心，哈爾濱，150040)

灰狼(Canis lupus)發(fā)源于距今300多萬年前的更新世，由湯氏熊分化為現(xiàn)代犬屬動物［1］。狗(Canis familiaris)是狼的近親，通過對狼和狗表現(xiàn)型和基因型的研究發(fā)現(xiàn)狼是狗的野生祖先［2－3］，即狗由早期人類從灰狼馴化而來［4］，馴養(yǎng)始于亞洲，距今不超過16300年［5］。狼和狗具有相同的染色體組型，可以雜交并產(chǎn)生后代，有學者將二者描述為同一物種［6］。

狼作為數(shù)量有限的野生動物受到眾多國家法律保護，已被列入《世界自然保護聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》，在世界范圍內(nèi)受到嚴格的保護和管理，禁止非法捕殺及販賣。狗則被視為人類的伴侶動物，不被野生動物相關(guān)法律保護。狼皮、牙、胃等在非法市場具有較大的需求，非法偷獵，走私狼產(chǎn)品在中國境內(nèi)和周邊地區(qū)時有發(fā)生。當執(zhí)法部門查獲相關(guān)的狼產(chǎn)品時，嫌疑人為逃避法律懲罰經(jīng)常謊稱其產(chǎn)品來源于狗。為打擊非法偷獵、走私活動，保護野生狼的種群，急需建立一套有效的狼與狗鑒別方法。

傳統(tǒng)的物種鑒別方法可以分為宏觀和微觀兩種。宏觀鑒別中的形態(tài)學［7］及行為學［8－9］方法是快速且準確的。但通常需要涉案檢材有完整的特征。當所繳獲物品為動物的內(nèi)臟或局部組織時，則需要采取微觀的分子生物學技術(shù)進行鑒別。其中，最常見的是利用線粒體DNA(mtDNA)作為分子標記的方法。多拷貝的mtDNA沒有基因重組現(xiàn)象，嚴格遵循母系遺傳，其進化速率是單拷貝核基因的5～10倍［10］，它是動物系統(tǒng)發(fā)育分析和物種識別常用的工具。通過mtDNA，包括線粒體細胞色素b基因(Cyt b)及控制區(qū)［11－13］等對狼和狗的研究始于20世紀。最近的犬科動物分子系統(tǒng)學研究發(fā)現(xiàn)犬屬的狼和狗等為系統(tǒng)樹中獨立的分支，其分支時間較赤狐(Vulpes vulpes)、藍狐(Alopex lagopus)和貉(Nyctereutes procyonoides)早［14］，驗證了狼和狗具有較其他犬科動物更為親近的關(guān)系。也有研究比較了狼和狗線粒體全基因組的結(jié)構(gòu)特點，并進一步探索其物種起源與進化［15］。

在物種識別方面，有人利用mtDNA控制區(qū)對克羅地亞境內(nèi)狼和狗進行鑒別，結(jié)果證明該段序列可以成功將狼和狗鑒別開來［16］。由此，本研究比對中國境內(nèi)及周邊國家狼和狗mtDNA控制區(qū)序列，通過序列差異比較和系統(tǒng)發(fā)育分析探索利用控制區(qū)對狼和狗進行物種鑒別的可行性。該分子方法的建立可以豐富狼和狗鑒別手段，為動物法醫(yī)學相關(guān)鑒別提供助力［17］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來源于國家林業(yè)局野生動植物檢測中心保存的狼和狗肌肉組織樣本。全部樣本來源于中國境內(nèi)。其中56份樣本為狗，18份樣本為狼。另有來源于日本、蒙古、阿富汗等國的24條狗mtDNA控制區(qū)序列，8條狼 mtDNA控制區(qū)序列及2條外群灰狐(Urocyon cinereoargenteus)mtDNA控制區(qū)序列下載自GenBank。經(jīng)統(tǒng)計共108份試驗材料，80份來自于狗，26份來自于狼，2份來自于灰狐。本實驗所用全部試驗材料信息詳見表1。

1.2 DNA提取

肌肉組織采用AxyPrep基因組DNA提取試劑盒(康寧生命科學有限公司，吳江)提取，于－20℃條件下保存。

1.3 PCR擴增

使用引物 DL 14和 DH 7［18］擴增目標 mtDNA片段。PCR擴增體系為50 μl，包含10 ng模版DNA，1×EasyTaq Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司，北京)及上下游引物各200 nM。使用Eppendorf Mastercycler Pro PCR儀進行擴增，擴增條件為:94℃預變性5 min，隨后35個循環(huán)(94℃/30 s，50℃/30 s，72℃/60 s)，最終72℃保溫5 min。采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(康寧生命科學有限公司，吳江)，按照操作手冊進行純化回收。

1.4 數(shù)據(jù)分析

純化產(chǎn)物由哈爾濱新?；蛏镉邢薰纠?730測序儀采用一代測序技術(shù)測定，以引物DL 14單向測序進行分析測定。用MEGA 5軟件對所測序列進行比對，截取并保留序列約676 bp的片段，分析單倍型成對序列遺傳距離;用Arlequin 3.5.2.2［19］分析單倍型頻率;用dnasp 5分析多態(tài)位點，單倍型多樣性和核酸多樣性;用IQ－TREE和MrBayes3.2.6軟件分別構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹和貝葉斯樹，選擇兩個灰狐單倍型為外群。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

分析106條狼和狗mtDNA控制區(qū)約676 bp部分序列，共得到47個單倍型結(jié)果，其中12個來源于狼，35個來源于狗，且狼和狗之間沒有共享單倍型。這些單倍型包含了62個(9.17%)多態(tài)位點(表2)。狼有51個多態(tài)位點(7.54%)，狗有33個多態(tài)位點(4.88%)。狼有29個特異多態(tài)位點，狗有11個特異多態(tài)位點，二者占全部多態(tài)位點的64.52%。分析序列核苷酸多樣性(Pi)和單倍型多樣性(Hd)，結(jié)果表明狼 Pi值為 0.015，Hd值為 0.914，狗 Pi值為0.012，Hd值為0.957。狼的單倍型頻率介于3.85%～15.40%之間，狗的單倍型頻率介于1.25% ～10.00%之間(表3)，狼和狗種內(nèi)單倍型頻率主要集中于低頻區(qū)域。表明不同的mtDNA控制區(qū)單倍型在狼和狗各自世系間分布較為均勻，且存在優(yōu)勢單倍型。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

ML和BI方法構(gòu)建的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結(jié)構(gòu)一致，各分支的支持度存在差異(圖1)。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，全部狼和狗的單倍型獨立于外群形成2大分支或世系(支持度為100%)。第一分支中包含3個狼單倍型、8個狗單倍型，其中3個狼單倍型(WN03、AB007373、AB007374，25%)與5個狗單倍型共享同一世系。第二分支中包含36個單倍型(9個狼單倍型、27個狗單倍型)，其中狼單倍型(75%)與狗單倍型分屬不同分支。且狼單倍型 AB007375，WE01和WB01，WB02和 WC05總是獨立成支(支持度 ＞80%)。

3 討論

mtDNA被廣泛用于動物遺傳進化，系統(tǒng)發(fā)育，群體遺傳結(jié)構(gòu)等方面的研究［13，20－23］。分別有研究對青海湖附近18頭狼［13］及24個不同品種共73只狗［24］的mtDNA控制區(qū)序列進行研究。結(jié)果表明同一地區(qū)狼之間及不同品種狗之間mtDNA控制區(qū)均具有廣泛的多態(tài)性，證明二者遺傳多樣性較高。為比較狼和狗mtDNA控制區(qū)單倍型并分析得到更加廣泛的多態(tài)性提供了可能性依據(jù)。本研究分析狼和狗單倍型序列多態(tài)位點的差異，結(jié)果狼有29個特異性位點，狗有11個特異性位點，證明狼和狗之間具有更高的遺傳多樣性。二者的顯著差異是本方法鑒別狼和狗的基礎，說明在mtDNA控制區(qū)676 bp段序列范圍內(nèi)，狼和狗具有各自獨立的進化，為本研究鑒別方法提供了可行性。

利用mtDNA進行動物系統(tǒng)發(fā)育分析，有助于物種的起源［25］及分類地位［26］等方面的研究，對于不同種動物則可進一步對進化多樣性及物種鑒別進行研究。已有研究利用mtDNA控制區(qū)對羊、滇金絲猴(Rhinopithecus bieti)、沙氏下鱵魚(Hyporhamphus sajori)等動物的進化多樣性及物種鑒別［27－31］展開研究。在犬科動物方向，有研究利用mtDNA控制區(qū)對濟州犬與其他犬種的種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行了研究［32］;在利用mtDNA控制區(qū)對克羅地亞地區(qū)的狼和狗進行種間區(qū)分的研究中，系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表示狼和狗具有各自獨立的世系，可以利用此方法鑒別狼和狗［19］。本研究利用全部47個狼和狗單倍型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，在來自中國境內(nèi)及周邊國家的12個狼單倍型中有9個(75%)與狗單倍型均分屬不同分支。這說明系統(tǒng)發(fā)育樹中單倍型的世系分布也具有一定的鑒別力。而另一方面，長期進化發(fā)展及基因交流等原因為狼和狗的基因分化帶來一定的干擾因素，導致少部分狼(25%)和狗具有相似的mtDNA單倍型，使得本方法的鑒別準確度降低。因而根據(jù)狼和狗mtDNA控制區(qū)單倍型在系統(tǒng)發(fā)育樹中的分布結(jié)果鑒別狼和狗，準確率較高，但有無法鑒別的情況存在。

綜合特異性位點和單倍型世系分布分析結(jié)果，推測利用mtDNA控制區(qū)鑒別狼和狗是可行的。但mtDNA母系遺傳的特點使得本方法在雜合子鑒別方面存在障礙，如本研究全部(75%部分和25%部分)狼單倍型個體中是否存在雌狼和雄狗雜交的后代，或者雌狼和雜種后代產(chǎn)生的后代，需要進一步綜合常染色體或Y染色體等遺傳標記［33］進行父系鑒別。綜上，本研究方法對狼和狗的鑒別具有一定的可行性及參考意義，但仍需要更廣泛地選取樣本進行深入研究。

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圖1 基于mtDNA控制區(qū)單倍型構(gòu)建的狼和狗系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of mtDNA control region haplotypes in dogs and wolves

表1 狼和狗線粒體DNA控制區(qū)序列Tab.1 Mitochondrial DNA control region sequences of dogs and wolves

續(xù)表1

表2 狼和狗mtDNA控制區(qū)結(jié)構(gòu)和序列多態(tài)性Tab.2 Structure and sequence polymorphisms in the mtDNA control region of dogs and wolves

表3 狼和狗單倍型頻率Tab.3 Haplotype frequencies of dogs and wolves