涂飛云 劉 俊 韓衛(wèi)杰 黃 挺 黃曉鳳*

(1.江西省林業(yè)科學(xué)院，南昌，330013;2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川省瀕危野生動物保護(hù)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都，610064)

微衛(wèi)星又稱為簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats，SSRs)，是指由1～6個(gè)核苷酸為基本組成單元的串聯(lián)重復(fù)序列［1］，廣泛存在于真核生物和原核生物基因組中［2］。微衛(wèi)星具有分布廣、選擇中性、多態(tài)性高、共顯性遺傳等特點(diǎn)，是比較理想的分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、個(gè)體識別、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析以及疾病研究等。

食蟹猴(Macaca fascicularis)分類上屬猴科(Cercopithecidae)猴屬物種，是被列入CITES附錄Ⅱ的保護(hù)物種，也被當(dāng)作靈長類動物模型應(yīng)用于生物醫(yī)藥及疾病研究。關(guān)于微衛(wèi)星標(biāo)記用于食蟹猴群體遺傳多樣性有少量的報(bào)道。李瑞生等［3］利用15個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)分析了食蟹猴群體間的遺傳多樣性。禹文海等［4］利用19個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對恒河猴(Macaca mulatta)遺傳多樣性水平進(jìn)行了評估。劉歡［5］利用微衛(wèi)星標(biāo)記我國籠養(yǎng)的食蟹猴種群的遺傳多樣性。皮道元等［6］利用11個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了4個(gè)食蟹猴群落的遺傳多樣性。有關(guān)食蟹猴全基因組微衛(wèi)星數(shù)量及分布特征研究，有助于篩選和開發(fā)更多的微衛(wèi)星標(biāo)記。本研究分析了食蟹猴各重復(fù)類型微衛(wèi)星數(shù)量、分布以及微衛(wèi)星數(shù)量與染色體GC含量、微衛(wèi)星GC含量的關(guān)系，旨在為食蟹猴微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選和開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 研究方法

1.1 基因組序列

雌性食蟹猴全基因組下載自ftp:∥ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Macaca_fascicularis/，基因組全長大小約為2.92 Gb，未定位到染色體上的序列約93.3 Mb，占整個(gè)基因組序列的1.96%。

1.2 數(shù)據(jù)分析

利用微衛(wèi)星搜索及統(tǒng)計(jì)軟件MSDB(2.4版本)對全基因組微衛(wèi)星進(jìn)行搜索［7］，搜索設(shè)置為默認(rèn)模式，即Perfect Search，最小重復(fù)次數(shù)分別是12、7、5、4、4和4。同時(shí)，利用編制的perl腳本將可循環(huán)的SSR序列及其互補(bǔ)的SSR序列合并為一類，如ACT重復(fù)拷貝類別，可以與之合并為一類的重復(fù)拷貝類別是TGA、CTA、GAT、TAC和ATG。為了研究微衛(wèi)星豐度和密度與染色體GC含量，微衛(wèi)星GC含量的關(guān)系，本研究利用DNASTAR中的EditSeq計(jì)算序列GC含量。

2 結(jié)果

2.1 食蟹猴各重復(fù)類型微衛(wèi)星分布特征

食蟹猴基因組中微衛(wèi)星總數(shù)為1284929個(gè)，長度是26044651 bp，占全基因組的0.890%。食蟹猴基因組微衛(wèi)星的平均豐度(451.3個(gè)/Mb)和平均密度(9118.7 bp/Mb)。食蟹猴基因組不同重復(fù)類型微衛(wèi)星表現(xiàn)為單堿基(56.74%)＞四堿基(16.72%)＞二堿基(16.67%)＞三堿基(5.96%)＞五堿基(3.35%)＞六堿基(0.56%)。食蟹猴基因組不同染色體上微衛(wèi)星數(shù)量上，以1號最多，其次是3號、2號，最少的是18號、19號。

2.2 食蟹猴染色體微衛(wèi)星豐度、密度與GC含量關(guān)系

食蟹猴基因組染色體上微衛(wèi)星豐度與染色體GC含量呈顯著線性正相關(guān)(r=0.838，P＜0.01)，微衛(wèi)星密度和染色體GC含量呈正相關(guān)(r=0.819，P＜0.01)。本研究同樣調(diào)查了食蟹猴基因組各染色體上微衛(wèi)星豐度、密度和微衛(wèi)星GC含量的關(guān)系，各染色體上微衛(wèi)星豐度與其微衛(wèi)星GC含量呈顯著線性負(fù)相關(guān)(r=－0.876，P＜0.01)，各染色體上SSR密度和各染色體上微衛(wèi)星GC含量同樣呈顯著線性負(fù)相關(guān)(r= －0.849，P ＜0.01)。

表1 食蟹猴不同染色體上不同重復(fù)類型微衛(wèi)星數(shù)量的分布特點(diǎn)Tab.1 Distribution of SSRs in each chromosome of Macaca fascicularis

2.3 食蟹猴重復(fù)拷貝類別分析

食蟹猴有208種重復(fù)拷貝類別。出現(xiàn)次數(shù)最多的10種重復(fù)拷貝類別見表2，其中排名前5位的拷貝類別依次是A、AC、AAAT、AG、AT(表2)。食蟹猴微衛(wèi)星，其中單堿基以A占絕對優(yōu)勢，二堿基AC占優(yōu)勢，其次是AG，三堿基以AAT、AAC數(shù)量多，四堿基則以AAAT占優(yōu)勢，五堿基AAACA，六堿基AAACAA最多。

表2 出現(xiàn)次數(shù)最多的10種重復(fù)拷貝類別Tab.2 The ten SSRs repeat type motifs occurs most frequently

3 討論

本研究利用生物信息學(xué)方法搜索、統(tǒng)計(jì)、分析了食蟹猴全基因組微衛(wèi)星數(shù)量、分布特征。食蟹猴全基因組中微衛(wèi)星總數(shù)為1284929，其序列長度占全基因組的0.890%。食蟹猴微衛(wèi)星序列長度所占比例高于偶蹄目(Artiodactyla)某些物種(如豬Sus scrofa、牛Bos taurus、牦牛 Bos mutus、水牛 Bubalus bubalis、綿羊Ovis aries、山羊Capra hircus和藏羚羊Pantholops hodgsonii)［8－11］、食肉目(Carnivora) 的大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)、北極熊(Ursus maritimus)［12］和靈長目(Primates)的恒河猴［13］，但低于嚙齒目(Rodentia)的大鼠(Rattus norvegicus) 和小鼠(Mus musculus)［14－15］?？梢姡承泛锶蚪M微衛(wèi)星較為豐富。

大量的研究表明染色體長度與其微衛(wèi)星數(shù)量呈顯著線性正相關(guān)［8－9，12－13，15］，本研究同樣支持該結(jié)論。另外，本研究調(diào)查了各染色體長度與不同重復(fù)類型微衛(wèi)星數(shù)量的關(guān)系，表明染色體長度與單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基微衛(wèi)星數(shù)量都呈顯著線性正相關(guān)(P＜0.01)，進(jìn)一步支持 Hancock［16］等的假說，反映了不同重復(fù)類型微衛(wèi)星在染色體上分布具有隨機(jī)性。

GC含量是生物體核酸序列重要組成部分，其含量的變化與基因密度、重復(fù)元件分布等密切相關(guān)［17－18］。Qi等［19］研究表明牛、綿羊、山羊全基因組微衛(wèi)星豐度、密度與染色體上GC含量顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)，而牦牛、水牛、藏羚羊未發(fā)現(xiàn)相關(guān)關(guān)系。本研究表明食蟹猴基因組微衛(wèi)星豐度、密度與染色體上GC含量呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)，這可能是物種差異或個(gè)體差異引起的，但需要更多的研究來證實(shí)。另外，食蟹猴染色體上微衛(wèi)星豐度、密度與微衛(wèi)星GC含量呈顯著線性負(fù)相關(guān)(P＜0.01)，與恒河猴的結(jié)果一致［13］。

本研究微衛(wèi)星以單堿基A數(shù)量最多，與豬、牛和綿羊、大熊貓和北極熊結(jié)果一致［8－9］，而有別于某些嚙齒動物以二堿基占優(yōu)勢［15，20］。不同重復(fù)優(yōu)勢拷貝類型，除四堿基外，其余單堿基、二堿基、三堿基、五堿基、六堿基的優(yōu)勢拷貝類型與恒河猴是一致的［13］，其原因可能是食蟹猴和恒河猴的親緣關(guān)系近［21］，在歷史上可能發(fā)生過雜交［22］。

有研究表明四堿基微衛(wèi)星比二堿基、三堿基更為準(zhǔn)確和可靠［23－24］。與恒河猴相比，食蟹猴四堿基微衛(wèi)星數(shù)量高于二堿基;Bonhomme等［25］利用15個(gè)現(xiàn)代人的微衛(wèi)星標(biāo)記對13個(gè)猴科物種實(shí)現(xiàn)了跨物種應(yīng)用，其中9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記為四堿基微衛(wèi)星。因此，猴科動物中應(yīng)用四堿基建庫可能是不錯(cuò)的選擇。

目前，利用生物信息學(xué)方法對基因組進(jìn)行搜索，篩選穩(wěn)定的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)有較好的應(yīng)用。Huang等［24］利用生物信息學(xué)方法對大熊貓基因組微衛(wèi)星進(jìn)行了搜索，并從四堿基微衛(wèi)星中挑選設(shè)計(jì)出160對微衛(wèi)星引物，最終篩選出15對穩(wěn)定的微衛(wèi)星多態(tài)性引物。都玉蓉等［26］同樣基于生物信息學(xué)方法對藏羚羊基因組進(jìn)行了微衛(wèi)星進(jìn)行掃描，并從隨機(jī)挑選出的100個(gè)微衛(wèi)星座位中，篩選到8個(gè)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)。本研究對食蟹猴的全基因組微衛(wèi)星進(jìn)行了搜索、統(tǒng)計(jì)與分析，期望能用于食蟹猴多態(tài)性微衛(wèi)星篩選。

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