索金紅，牟海軍，劉曉娟，姚福祥*，楊文廣

(1.通遼職業(yè)學院，內蒙古 通遼　028000； 2.齊齊哈爾醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院呼吸科，黑龍江 齊齊哈爾　161000； 3.內蒙古通遼市醫(yī)院藥劑科，內蒙古 通遼　028000)

柏子仁為柏科植物側柏的種仁，具有養(yǎng)心氣，潤腎燥，益智寧神；燒瀝，澤頭發(fā)，治疥癬的功效[1]。近年來研究表明，柏子仁含柏子仁甙、柏木醇、雙萜類成分，還含脂肪油約14%，并含少量揮發(fā)油、皂苷、維生素A和蛋白質等，脂肪油的主要成分為不飽和脂肪酸，占62.39%[2]。因此無論是祖國醫(yī)學理論還是現(xiàn)代醫(yī)學研究均提示柏子仁有促進學習記憶的作用。但是柏子仁是否對阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)有治療和預防作用以及治療和預防的分子機制是什么，目前還未見文獻報道，因此需要進一步探索，為傳統(tǒng)醫(yī)藥的深入開發(fā)利用提供理論基礎。本研究的目的就是通過Wistar大鼠雙側大腦海馬注射Aβ1- 42建立AD動物模型，著重探討SPS對AD模型鼠認知功能及海馬組織氧化性損傷與抗氧化作用的影響，進一步闡明SPS對AD的神經(jīng)保護作用機制和神經(jīng)保護作用效果。

1　材料和方法

1.1　實驗動物

SPF級雌性Wistar大鼠60只，24周齡，體重(300±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011]，實驗在通遼職業(yè)學院實驗中心及合約協(xié)作單位醫(yī)學院完成[SYXK(蒙)2016-0003]。所有使用的動物依照國家實驗動物使用的相關規(guī)定獲得學校實驗動物倫理委員會的批準(倫理審查證號2017002)。所有大鼠先用Morris水迷宮實驗初篩，去除先天癡呆、體力差、游泳姿勢不良、視力困難者，剩下的即為合格大鼠，所有合格大鼠按照自然條件喂養(yǎng)，給予充足的食物和水，動物在實驗動物房中籠養(yǎng)，每籠3只，實驗室保證良好的通風及濕度，室溫保持在23℃。

1.2　主要試劑及儀器

超氧化物歧化酶試劑盒(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(GSH)、丙二醛試劑盒(MDA)(南京建成生物工程研究所，批號： 20160829， 20160801， 20160801)；UV754紫外可見分光光度計(上海奧析科學儀器有限公司)；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢博士德)；Bcl-2、survivin、Bax、Fas、caspase-3(武漢博士德)；二抗(武漢博士德)；5082型酶標儀(TECAN)；Bio-Rad Model 785型電轉移儀。

1.3　實驗方法

1.3.1動物分組

選取20只經(jīng)Morris水迷宮實驗篩選的正常無癡呆合格大鼠為正常對照組，將每只大鼠放于鼠腦立體定位儀上，雙側海馬穿刺，每側各一次性注入生理鹽水5 μL，穿刺坐標為(以Bregma點為0點，AP 3.0 mm，ML 2.0 mm，DV 2.9 mm)，另選取50只合格大鼠，將每只大鼠放于鼠腦立體定位儀上，雙側海馬穿刺，穿刺坐標為(以Bregma點為0點，AP 3.0 mm，ML 2.0 mm，DV 2.9 mm)，雙側海馬各一次性注射凝聚態(tài)Aβ1 425 μL，術后1周將50只大鼠應用Morris水迷宮實驗篩選AD模型大鼠40只(選定標準為以正常對照組大鼠逃避潛伏期平均值的95%可信區(qū)間上限值為標準，將超出上限值者確定為AD模型造模成功)。將造模成功的AD模型大鼠隨機分為模型組和SPS干預組，每組20只。正常對照組和模型組給予生理鹽水5 mL+羧甲基纖維素鈉(500 mg/kg)灌胃，持續(xù)30 d，SPS干預組每天給予生理鹽水5 mL+SPS(300 mg/kg)灌胃[3]，持續(xù)30 d，每天喂養(yǎng)飲食及飼養(yǎng)條件與造模前一樣，30 d后進行水迷宮實驗，然后斷頭取腦(含海馬)進行實驗。

1.3.2學習記憶能力測試[4]

用藥30 d后，全部60只大鼠進行Morris水迷宮實驗，測定大鼠的空間學習和記憶能力。水迷宮測試房間保持安靜、清潔，整個測試期間，實驗環(huán)境保持恒定。Morris水迷宮直徑120 cm，高60 cm，水深25 cm(高出站臺1 cm)，水溫控制在22℃～26℃，設置4個象限，站臺置于第3象限。池壁、水及平臺均用墨汁染黑不見水下平臺。迷宮上方安裝攝像頭，采集圖像輸入計算機。

1.3.3海馬組織MDA、GHS含量及SOD活力測定[5]

將正常對照組、模型組、SPS干預組全部60只大鼠用20%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速斷頭取出完整大腦。將大鼠腦置冰盤上，于解剖顯微鏡下仔細剝除腦膜，沿中線胼胝體切成兩半，將半腦翻過，從腹側面掀開大腦皮層，暴露靠近小腦側的里面月牙狀組織，即為海馬，用彎鑷取出。保留海馬組織，用濾紙吸干水分，天平稱重，然后加組織重量9倍的4℃生理鹽水，制成組織勻漿液，冷凍離心機2500 r/min離心10 min，取離心后的上清液用生理鹽水按1∶9稀釋成1%的海馬組織勻漿溶液。將準備好的海馬組織上清液取樣，放在95℃水浴箱中40 min，然后放入離心機中3500 r/min離心10 min，取離心后的上清液，測各管吸光度。含量測定(nmol/mgprot)=(測定管吸光度-空白管吸光度)÷(標準管吸光度-空白管吸光度)×標準管濃度(nmol/mL)÷蛋白含量(mgprot/mL)。SOD活力(U/mgprot)=(對照管吸光度-測定管吸光度) ÷(對照管吸光度×50%)×反應液總體積÷取樣量(mL) ÷ 蛋白含量(mgprot/mL)。

1.3.4Western Blotting

將3組大鼠海馬組織從液氮罐中取出，取出的3組海馬組織塊先用冷PBS洗滌3次，去除血污，剪成小塊放在勻漿器中，加入細胞裂解液，冰上放置30 min， 4℃ 15 000 r/min 5 min離心，得到的上清為蛋白樣品，然后應用BCA法檢測樣本蛋白濃度。電泳及電轉、抗體檢測，嚴格按照試劑盒說明步驟進行。

1.4　統(tǒng)計學方法

2　結果

2.1　Morris水迷宮實驗結果

模型組所有大鼠在5 d內學會尋找平臺，潛伏期較正常對照組和SPS干預組明顯延長(P< 0.01)。模型組搜索時間較正常對照組、SPS組搜索時間明顯延長；模型組搜索距離百分比較正常對照組、SPS干預組搜索距離百分比明顯降低(P< 0.01)；SPS干預組較正常對照組搜索時間明顯延長，SPS干預組較正常對照組搜索距離百分比明顯降低(P< 0.01)(見表1)。

2.2　3組大鼠海馬MDA、GSH含量及SOD活力的比較

3組大鼠海馬MDA、GSH含量及SOD活力的比較見表2，SPS干預組MDA含量明顯低于模型組，而高于正常對照組(P< 0.01)；GSH含量SPS干預組明顯高于模型組，低于正常對照組(P< 0.01)；SOD活力SPS干預組明顯高于模型組，低于正常對照組(P< 0.01)。

表1　3組大鼠Morris水迷宮實驗結果比較

注：與正常對照組比較，aP< 0.01；與 SPS 干預組比較，bP< 0.01。

Note. Compared with the normal control group，aP< 0.01. Compared with the SPS intervention group，bP< 0.01.

表2　3組大鼠海馬MDA、GHS含量及SOD活力的比較

注：與正常對照組比較，aP< 0.01；與 SPS 干預組比較，bP< 0.01。

Note. Compared with the normal control group，aP< 0.01. Compared with the SPS intervention group，bP< 0.01.

表3　3 組大鼠海馬組織凋亡相關因子蛋白表達比較(相對光密度)

注：與正常對照組比較，aP< 0.01；與 SPS 干預組比較，bP< 0.01。

Note. Compared with the normal control group，aP< 0.01. Compared with the SPS intervention group，bP< 0.01.

2.3　3組大鼠海馬Bcl-2、Survivin、Bax、Fas、Caspase-3蛋白的表達

SPS干預組Bcl-2蛋白表達較模型組上升，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)；同時與對照組比較Bcl-2蛋白表達下降(P< 0.05)，而模型組較對照組明顯下降，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)。SPS干預組survivin蛋白表達較模型組上升，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)；同時與對照組比較survivin蛋白表達下降(P< 0.05)，而模型組較對照組明顯下降，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)。SPS干預組Bax蛋白表達較模型組下降，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)；同時與對照組比較Bax蛋白表達上升(P< 0.05)，而模型組較對照組明顯上升，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)。SPS干預組Fas蛋白表達較模型組下降，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)；同時與對照組比較Fas蛋白表達上升(P< 0.05)，而模型組較對照組明顯上升，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)。SPS干預組caspase-3蛋白表達較模型組下降，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)；同時與對照組比較caspase-3蛋白表達上升(P< 0.05)，而模型組較對照組明顯上升，兩者比較差異有顯著性(P< 0.01)(見表3和圖1)。

圖1　SPS對模型鼠海馬Bcl-2、Survivin、Bax、Fas、Caspase-3蛋白表達的影響Fig.1　Effect of SPS on the expression of Bcl-2, survivin, Bax, Fas and caspase-3 proteins in the hippocampus of model rats

3　討論

AD模型組搜索時間較正常對照組明顯延長，兩組比較具有明顯的統(tǒng)計學差異。其表現(xiàn)主要體現(xiàn)為學習記憶功能的損害，與臨床上阿爾茨海默病病人的表現(xiàn)相符，結合我們應用的Aβ1- 42注射模型說明Aβ?lián)p害是阿爾茨海默病發(fā)病的主要機制，也進一步說明此模型可以作為探索AD病因、尋找AD治療藥物較理想的模型。因此我們采取此模型是符合阿爾茨海默病的發(fā)病機制并且其臨床表現(xiàn)也符合人類AD的臨床表現(xiàn)，為我們下一步的實驗奠定了可靠的模型基礎。在我們的實驗中還發(fā)現(xiàn)，進行Morris水迷宮試驗測試中比較具有統(tǒng)計學差異，這也說明SPS對阿爾茨海默病模型鼠的認知功能具有保護作用。余正文等[6-8]通過活性篩選發(fā)現(xiàn)，柏子仁石油醚提取物對雞胚背根神經(jīng)節(jié)突起的生長有輕度促生長作用。這些物質的促生長作用有兩種可能性：一是促進神經(jīng)生長因子NGF的合成、分泌及釋氧化應激反應對神經(jīng)元具有直接的毒性作用。由于AD患者中內源性氧化作用增強，而內源性和外源性的抗氧化作用減弱，加上中樞神經(jīng)系統(tǒng)豐富的脂質成分，因此神經(jīng)元細胞膜極易遭受自由基的損傷，導致膜的結構破壞和幾種乙醛產(chǎn)物的產(chǎn)生；同時自由基的幾種成分，特別是羥自由基可以直接破壞核酸，導致染色體的斷裂、底物的改變，進而導致蛋白質的變性；此外自由基也可以直接破壞線粒體呼吸鏈，導致線粒體的變性。這三種因素導致神經(jīng)元的凋亡甚至是死亡，這可能是導致AD患者神經(jīng)元丟失的原因。另外氧化應激還與其他致病因素協(xié)同作用進一步加重AD的病理過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，SPS干預組MAD的含量與模型組比較明顯降低，說明SPS具有抑制氧化應激反應的能力，從而進一步抑制活性自由基的產(chǎn)生。由于自由基生成減少，由自由基直接造成的神經(jīng)元細胞膜、DNA的直接損傷以及線粒體呼吸鏈的損傷會明顯減少，神經(jīng)元的凋亡必然減少，從而發(fā)揮其神經(jīng)元保護作用。本研究還發(fā)現(xiàn)SPS干預組GSH的含量和SOD活力均較模型組明顯升高，這進一步說明SPS不僅可以通過調節(jié)自由基的代謝，也同時可以調節(jié)氧化還原反應，加速自由基的清除，減少自由基在神經(jīng)元內的蓄積，從而對AD模型鼠的海馬神經(jīng)元具有保護作用。但是SPS是直接從基因水平調節(jié)氧化應激及抗氧化系統(tǒng)的蛋白質代謝還是間接的作用尚不清楚。筆者推測SPS的作用機制如下：由于SPS促進神經(jīng)生長因子NGF合成、分泌及釋放，且其具有神經(jīng)生長因子功能，能在基因水平促進抗氧化系統(tǒng)蛋白質的合成，從而促進清除自由基，其亦可通過促進線粒體呼吸鏈相關蛋白質的合成抑制自由基產(chǎn)生；SPS具有拮抗神經(jīng)炎癥的作用，可減輕神經(jīng)元損害[9-10]。

在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)，SPS組海馬組織Bax、Fas、caspase-3的表達較模型組比較明顯降低，兩者比較具有統(tǒng)計學意義，說明SPS具有拮抗凋亡的作用，并且細胞內途徑和細胞外途徑均可以部分拮抗，同時在我們的實驗中也發(fā)現(xiàn)SPS組海馬survivin和Bcl-2的表達明顯升高，說明SPS還有促進拮抗凋亡機制的作用。有研究發(fā)現(xiàn)[11]在新生小豬低氧缺血模型中SPS在10 mg/d應用時可以明顯減少神經(jīng)元細胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)[12]SPS可以明顯減少腦梗死體積百分比，且在海馬和皮層單位面積TUNEL陽性細胞的數(shù)目明顯減少，雖然這兩個實驗是在缺血中發(fā)現(xiàn)的直接證據(jù)，也與我們的實驗結果基本吻合，也從另外一個角度證實了SPS抗神經(jīng)元凋亡的效果。SPS調節(jié)凋亡是從阻止凋亡通路和激活抗凋亡通路發(fā)揮雙重作用，但是SPS抗凋亡的具體機制不是很清楚，推測可能與以下機制有關，一是拮抗海馬神經(jīng)元的氧化應激反應，提高抗氧化系統(tǒng)的活性，這在我們前面的實驗中已經(jīng)被證實；二是SPS可以抑制凋亡相關基因的表達[13]；三是調節(jié)電壓門控鈣通道和興奮性谷氨酸受體，減輕細胞凋亡信號的觸發(fā)因素[14]；四是直接抑制APP的合成；五是抑制了乙酰膽堿酯酶的活性。但是在我們的實驗中也發(fā)現(xiàn)，SPS組海馬組織Bax、Fas、caspase-3的表達與正常對照組比較仍然是較高，survivin和Bcl-2的表達較正常對照組低，這說明AD發(fā)病機制中神經(jīng)元的凋亡是一個多途徑，多因素的結果，SPS還不能完全拮抗凋亡在AD發(fā)病中的作用，這指導

我們在臨床應用中，要聯(lián)合用藥。同時我們實驗中難以選擇一個特異性的凋亡阻滯劑進行對照來進一步評價，需要在下一步實驗中進一步完善。

因此，氧化應激反應的增強和抗氧化應激反應系統(tǒng)的減弱必然參與了阿爾茨海默病的發(fā)病機制，并且貫穿其發(fā)病與發(fā)展的整個過程，SPS在阿爾茨海默病模型鼠中表現(xiàn)出了較好的抗氧化應激反應的作用，這必將為AD的治療帶來新的希望，同時也必將擴展祖國醫(yī)學的深入開發(fā)利用。