范子瑞，胡佳妃，江瑞妮，楊星玲，金火喜*

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022）

牛磺酸又稱牛膽酸，是一種含硫的非蛋白氨基酸，在體內(nèi)以游離狀態(tài)存在，具有廣泛的生理功能，如促進(jìn)嬰幼兒腦組織和智力發(fā)育、增強(qiáng)人體免疫、增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力等[1-8]，在臨床上已被廣泛應(yīng)用于心血管疾病、糖尿病、眼部疾病等一系列疾病的治療[9-11]。牛磺酸的分布十分廣泛，哺乳動(dòng)物的主要臟器，如：心臟、腦、肝臟中含量較高[12-14]；海洋生物，特別是海魚、貝類，如墨魚、牡蠣、海螺、蛤蜊等?；撬岷孔顬樨S富[15-18]。

生物體內(nèi)牛磺酸的生物合成途徑較為復(fù)雜，其中通過半胱氨酸雙加氧酶催化半胱氨酸形成半胱亞磺酸，再經(jīng)半胱亞磺酸脫羧酶催化脫羧生成亞牛磺酸，最后氧化成牛磺酸是最主要的途徑[19-23]。相比于哺乳動(dòng)物，雖然海洋生物體內(nèi)?；撬岷糠浅ＸS富，但對(duì)其合成途徑中的關(guān)鍵酶（半胱氨酸雙加氧酶和半胱亞磺酸脫羧酶）的研究則鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。據(jù)此，本研究以牛磺酸主要途徑中的半胱氨酸雙加氧酶為對(duì)象，通過建立快速靈敏的分析方法來評(píng)價(jià)不同種類海洋生物體內(nèi)半胱氨酸雙加氧酶的活性。目前，對(duì)海洋生物體內(nèi)半胱氨酸雙加氧酶活性進(jìn)行廣泛的檢測(cè)和篩選等相關(guān)工作在國內(nèi)尚屬空白。本研究的結(jié)果可為后續(xù)進(jìn)一步明確海洋生物體內(nèi)?；撬岬暮铣赏緩教峁﹨⒖家罁?jù)。

向從海洋生物組織樣品中提取的初酶液中加入底物半胱氨酸，適宜條件下反應(yīng)，通過檢測(cè)反應(yīng)液中產(chǎn)物半胱亞磺酸的含量可定量分析樣品中半胱氨酸雙加氧酶的活性。高效液相色譜法檢測(cè)氨基酸的含量，常常采用柱前衍生法，主要有異硫氰酸苯酯衍生法、單磺酰氯衍生法[24]、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）衍生法[25-28]等。異硫氰酸苯酯衍生氨基酸需要專門的衍生裝置和無水環(huán)境，有毒且易于降低柱壽，單磺酰氯試劑價(jià)格又相對(duì)昂貴，OPA衍生法則安全簡便。本實(shí)驗(yàn)采用OPA為衍生劑，甲醇-乙酸鈉為流動(dòng)相，擬建立峰形良好、快速準(zhǔn)確的半胱亞磺酸含量檢測(cè)方法，利用該方法分析不同海洋生物中半胱氨酸雙加氧酶的活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白瓜子、貽貝和白蛤等海洋生物購于舟山市樂購超市。

半胱氨酸、半胱亞磺酸、OPA、甲醇、硼酸、氫氧化鈉、乙酸鈉、乙硫醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫化鈉 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、SHZ-88A水浴恒溫振蕩器 蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FS-1高速勻漿機(jī) 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

0.4 mol/L硼酸鈉緩沖液配制：稱取2.48 g硼酸和1.41 g氫氧化鈉，用蒸餾水定容至100 mL。衍生試劑配制：用1 mL甲醇溶解0.01 g的OPA，再加入0.01 mL乙硫醇，用0.4 mol/L的硼酸鈉緩沖液定容至10 mL，在冰箱中密封避光保存。pH 7.4磷酸緩沖溶液配制：準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉0.081 mol，磷酸二氫鈉0.019 mol，定容至500 mL。半胱亞磺酸標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg/mL）配制：準(zhǔn)確稱取0.05 g半胱亞磺酸，用pH 7.4磷酸緩沖液定容至50 mL。

1.3.2 半胱亞磺酸分析方法建立

吸取半胱亞磺酸標(biāo)樣250 μL于1.5 mL離心管中，加入一定量的衍生劑，搖勻，在37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，立刻進(jìn)樣20 μL，通過高效液相色譜進(jìn)行分析，記錄其峰面積及其保留時(shí)間。根據(jù)峰形、保留時(shí)間等指標(biāo)對(duì)檢測(cè)波長、衍生劑量、衍生時(shí)間、流動(dòng)相比例、流速等條件進(jìn)行優(yōu)化。初始條件：色譜柱XDB-C18，甲醇-乙酸鈉（65∶35，V/V），半胱亞磺酸與衍生劑物質(zhì)的量比1∶2，流速1 mL/min，衍生時(shí)間2 min，波長315 nm。

1.3.3 半胱亞磺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將半胱亞磺酸標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg/mL）用超純水依次稀釋成0.4、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/mL 6 個(gè)質(zhì)量濃度梯度。各取250 μL于1.5 mL離心管中，按照1.3.2節(jié)所述步驟，在最優(yōu)條件下對(duì)半胱亞磺酸質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。以半胱亞磺酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 精密度實(shí)驗(yàn)

分別取0.01、0.1 mg/mL和0.4 mg/mL的半胱亞磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2節(jié)所述步驟，在最優(yōu)條件下對(duì)半胱亞磺酸質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定。每種質(zhì)量濃度平行測(cè)定5 次，記錄峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 樣品中半胱氨酸雙加氧酶活性檢測(cè)

取20 g洗凈的海洋生物組織（肉、內(nèi)臟、鰓等），加入2.5 倍體積磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/L，pH 7.4），在冷水循環(huán)控溫下，勻漿30 min后4 ℃、8 000 r/min離心20 min，去沉淀。上清液采用硫酸銨鹽析（飽和度70%，溫度4 ℃）4 h，10 000 r/min離心15 min，棄上清液。沉淀中加入50 mL磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/L，pH 7.4），并置于同種緩沖液中透析12 h，中途更換一次緩沖液。實(shí)驗(yàn)組取透析后的初酶液1 mL，加入0.05 mol/L半胱氨酸溶液1 mL，再加入0.05 mol/L硫化鈉溶液0.2 mL。另取初酶液1 mL，加入1 mL磷酸鹽緩沖液和0.2 mL 0.05 mol/L硫化鈉溶液，作為對(duì)照組。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均于37 ℃、120 r/min條件下反應(yīng)2 h。取250 μL反應(yīng)液于0.5 mL離心管內(nèi)，按照1.3.2節(jié)方法檢測(cè)產(chǎn)物半胱亞磺酸的含量。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化生成1 μg半胱亞磺酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長選擇

以甲醇-乙酸鈉為流動(dòng)相，在不同波長下對(duì)半胱亞磺酸衍生物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)波長為280 nm時(shí)，半胱亞磺酸與相鄰峰未達(dá)到基線分離，分離效果差；當(dāng)波長為315 nm時(shí)，半胱亞磺酸衍生物有最大吸收峰，且與相鄰峰的分離得到改善，達(dá)到基線分離，保留時(shí)間為1.46 min；當(dāng)波長增加到360 nm時(shí)，又出現(xiàn)新的相鄰峰，難以與半胱亞磺酸峰完全分離；當(dāng)波長繼續(xù)提高到430 nm時(shí)，出現(xiàn)倒型峰，峰形極差。故選擇315 nm為后續(xù)半胱亞磺酸的檢測(cè)波長。

圖1 不同波長下半胱亞磺酸色譜圖Fig.1 Chromatograms of cysteine sulf i nate at different wavelengths

2.2 流動(dòng)相比例選擇

選用甲醇與0.05 mol/L的乙酸鈉作為流動(dòng)相，分別選擇體積比30∶70、40∶60、50∶50、65∶35和80∶20進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如表1所示，在不同的體積比下，半胱亞磺酸與相鄰峰均能達(dá)到基線分離，但保留時(shí)間隨著甲醇比例的增加而縮短，吸收峰面積則先減小后增大。在半胱亞磺酸質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL下，當(dāng)甲醇-乙酸鈉（30∶70，V/V）時(shí)，半胱亞磺酸保留時(shí)間為2.18 min，峰面積為1 284；當(dāng)甲醇-乙酸鈉（50∶50，V/V）時(shí)，半胱亞磺酸保留時(shí)間為1.47 min，峰面積為993；當(dāng)甲醇和乙酸鈉體積比提高到80∶20時(shí)，半胱亞磺酸保留時(shí)間為1.46 min，峰面積為1 361。以吸收峰面積（峰面積最大）及保留時(shí)間長短（保留時(shí)間最短）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定流動(dòng)相：甲醇-乙酸鈉（80∶20，V/V）。

表1 流動(dòng)相比例對(duì)半胱亞磺酸檢測(cè)的影響Table1 Effect of mobile phase composition on detection of cysteine sulf i nate

2.3 流動(dòng)相流速選擇

流動(dòng)相流速太慢，目標(biāo)物質(zhì)保留時(shí)間延長，峰形變寬；流速太快則會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)尚未完全檢測(cè)，峰面積變小。本實(shí)驗(yàn)選擇波長315 nm，甲醇-乙酸鈉（80∶20，V/V）為流動(dòng)相，考察不同流速（0.8、1.0、1.5、1.8、2.0 mL/min）對(duì)半胱亞磺酸（0.1 mg/mL）檢測(cè)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同流速下半胱亞磺酸均有良好的分離效果，但保留時(shí)間和峰面積均隨流速的增大而減?。ū?）。綜合考慮峰面積和保留時(shí)間，選擇1.0 mL/min為最終流動(dòng)相的流速。

表2 流動(dòng)相流速對(duì)半胱亞磺酸檢測(cè)的影響Table2 Effect of mobile phase fl ow rate on detection of cysteine sulf i nate

2.4 衍生劑用量的選擇

衍生劑用量對(duì)半胱亞磺酸的檢測(cè)有一定影響，衍生劑太少，反應(yīng)不完全，峰面積較??；衍生劑太多則不僅會(huì)導(dǎo)致藥品的浪費(fèi)，而且會(huì)影響峰形。本實(shí)驗(yàn)分別選擇不同量的衍生劑（半胱亞磺酸和衍生劑物質(zhì)的量比為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3），以峰面積和峰形為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定衍生劑的最適用量。如圖2所示，隨著衍生劑用量的增加，半胱亞磺酸峰面積也逐漸增加，但當(dāng)衍生劑與底物物質(zhì)的量比超過2∶1時(shí)，繼續(xù)增加衍生劑用量峰面積不再增加，這說明衍生劑已經(jīng)過量。此外，衍生劑與底物物質(zhì)的量比達(dá)到3∶1時(shí)，半胱亞磺酸峰形較寬，且出現(xiàn)裂縫現(xiàn)象。所以，最終選擇底物半胱亞磺酸與衍生劑物質(zhì)的量比為1∶2。

圖2 衍生劑用量對(duì)半胱亞磺酸峰面積的影響Fig.2 Effect of derivatizing agent on peak area of cysteine sulf i nate

2.5 衍生時(shí)間的選擇

半胱亞磺酸與衍生試劑反應(yīng)迅速，靈敏度高，但衍生產(chǎn)物并不穩(wěn)定，衍生時(shí)間過長，產(chǎn)物分解，峰面積減小。如圖3所示，隨著衍生時(shí)間的延長，峰面積從1 min時(shí)的1 305增加到3 min時(shí)的2 031。繼續(xù)延長衍生時(shí)間至5 min，峰面積下降至1 340，這說明衍生物已經(jīng)部分分解。所以，本實(shí)驗(yàn)采用衍生時(shí)間為3 min。

圖3 衍生時(shí)間對(duì)峰面積的影響Fig.3 Effect of derivatization time on peak area of cysteine sulf i nate

2.6 半胱亞磺酸測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

在上述最優(yōu)條件下，以半胱亞磺酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制得半胱亞磺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)半胱亞磺酸在10～400 μg/mL范圍時(shí)，半胱亞磺酸質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程y=17.92x-129.3，R2= 0.998。

2.7 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 精密度測(cè)試結(jié)果Table3 Results of precision test

選擇3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的半胱亞磺酸標(biāo)樣，分別為低質(zhì)量濃度（10 μg/mL）、中質(zhì)量濃度（100 μg/mL）和高質(zhì)量濃度（400 μg/mL），同一樣品重復(fù)測(cè)定5 次，峰面積見表3。此3 種質(zhì)量濃度的半胱亞磺酸標(biāo)樣相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.4%、3.3%和0.9%，說明該方法精密度較高，具有良好的重復(fù)性。

2.8 樣品中半胱氨酸雙加氧酶的活性檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)選擇了幾種有代表性海洋生物，對(duì)其不同組織中胱氨酸雙加氧酶的活性進(jìn)行了檢測(cè)。取一定量海產(chǎn)品組織，經(jīng)洗凈、勻漿、鹽析和透析后得粗酶液。取粗酶液加入一定量的底物半胱氨酸，一定條件下反應(yīng)后檢測(cè)反應(yīng)液中半胱亞磺酸的含量（具體過程見1.3.5節(jié)），從而評(píng)價(jià)樣品中半胱氨酸雙加氧酶的活性。由圖4可知，樣品反應(yīng)液中半胱亞磺酸的檢測(cè)受到其他組分一定程度上的干擾，但總體上分離度尚可，后續(xù)實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步改進(jìn)。

圖4 樣品反應(yīng)液色譜圖Fig.4 Chromatogram of cysteine sulfonate produced by crude cysteine dioxygenase

通過對(duì)各組織樣品反應(yīng)液中半胱亞磺酸進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)其質(zhì)量濃度計(jì)算半胱氨酸雙加氧酶活性，結(jié)果如表4所示。貝類、蝦類、蟹類和海洋魚類體內(nèi)均檢測(cè)到半胱氨酸雙加氧酶的活性，其中南美白對(duì)蝦體內(nèi)半胱氨酸雙加氧酶活性高達(dá)28.9 U。白蛤、蛤蜊和梭子蟹中半胱氨酸雙加氧酶活性也較高。對(duì)大黃魚、海鱸魚和美國紅魚不同組織中半胱氨酸雙加氧酶的活性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同組織中半胱氨酸雙加氧酶的活性有顯著差異。一般來說，魚體內(nèi)臟，特別是肝臟中半胱氨酸雙加氧酶的活性明顯高于其他組織，而鰓中半胱氨酸雙加氧酶的活性則最低。此外，腸和肌肉組織中半胱氨酸雙加氧酶的活性也較高。

表4 不同海洋生物組織中半胱氨酸雙加氧酶活性的測(cè)定Table4 Determination of cysteine dioxygenase activity in different marine organisms

海洋生物是?；撬岬奶烊粚殠?，尤其是海洋貝類、甲殼類、魚類等，其體內(nèi)含有十分豐富的?；撬醄29]。據(jù)文獻(xiàn)[30]報(bào)道，?；撬嵩诓煌M織中的含量差異較大。一般來說，魚體內(nèi)臟，尤其是肝臟中?；撬岷枯^高，而鰓中則含量較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在海洋生物的不同組織中，半胱氨酸雙加氧酶活性的大小與文獻(xiàn)報(bào)道的?；撬岷康姆植枷嚓P(guān)聯(lián)，表明半胱氨酸雙加氧酶是?；撬嵘锖铣赏緩街械年P(guān)鍵酶，其活性的大小間接決定了?；撬岷康母叩?。所以，檢測(cè)海洋生物不同組織中半胱雙加氧酶的活性，可一定程度上評(píng)估其牛磺酸的合成能力。若再結(jié)合其他相關(guān)酶活性的檢測(cè)，可定性分析不同海洋生物體內(nèi)?；撬岬暮铣赏緩?，為揭示牛磺酸的合成機(jī)制提供一定的參考基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了半胱亞磺酸的高效液相色譜分析方法。采用OPA柱前衍生法，檢測(cè)波長315 nm，以甲醇-乙酸鈉（8∶2，V/V）為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，半胱亞磺酸與衍生試劑物質(zhì)的量比為1∶2，衍生時(shí)間3 min，半胱亞磺酸出峰時(shí)間為1.46 min。該方法在10～400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2＞0.99），相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～6.4%。利用該方法檢測(cè)不同海產(chǎn)品組織中半胱氨酸雙加氧酶的活性。檢測(cè)結(jié)果表明，不同的海洋生物中半胱氨酸雙加氧酶活性差異較大，其中南美白對(duì)蝦中活性最高，而不同組織中則以肝臟中活性最高，鰓中活性最低。該研究表明，海洋生物體內(nèi)牛磺酸的合成極有可能是通過半胱氨酸雙加氧酶途徑，其活性的大小一定程度上決定了海洋生物體內(nèi)牛磺酸的水平。

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