呂睿麗，楊 巍，劉 寶，張美善

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 長春 130118； 2.東北師范大學(xué)表觀遺傳學(xué)教育部重點實驗室，吉林 長春 130024)

通過有性生殖產(chǎn)生的子代繼承了來自父、母雙親本的兩套染色體組.按照孟德爾遺傳規(guī)律，子代中來自雙親本的等位基因應(yīng)均等表達.雖然絕大多數(shù)基因遵循這個表達規(guī)律，但在哺乳動物和開花植物中，也有少部分基因只表達源自某一親本的等位基因，而另一親本的等位基因完全或部分沉默，即子代基因組根據(jù)親本來源選擇表達(擇親表達)，這種現(xiàn)象稱為基因組印跡，具有這種特殊表達模式的基因稱為印跡基因[1].植物中無論是正交還是反交，印跡基因均只有來自某一親本的等位基因表達.只有來自母本等位基因表達(父本等位基因沉默)的基因稱為母本印跡基因(maternally expressed imprinted gene，MEG)；只有來自父本等位基因表達(母本等位基因沉默)的基因稱為父本印跡基因(paternally expressed imprinted gene，PEG)[1-2].隨著高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的普及應(yīng)用，人們已從擬南芥、水稻、玉米、高粱和蓖麻等植物中識別出了幾百個印跡基因[3-7].Zhang等[8]和Waters等[5]從以玉米自交系B73和Mo17為親本材料制備的F1正反雜交種授粉后10 ～14 d的胚乳中，分別獲得了179個(68個MEG和111個PEG)和100個(54個MEG和46個PEG)印跡基因.開花植物基因組印跡的發(fā)生部位主要是發(fā)育種子的胚乳，印跡基因主要在種子器官特異表達[3-8].Waters等[5]分析了71個印跡基因在不同組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)其中31個基因(20個MEG和11個PEG)顯示胚乳特異表達或優(yōu)先表達，說明MEG更傾向于胚乳特異表達模式.

印跡基因可被熱脅迫誘導(dǎo)表達.擬南芥印跡基因SDS具有胚乳特異表達、在營養(yǎng)器官沉默的表達特性.當(dāng)植株受到熱脅迫時，擬南芥幼葉中SDS基因會被脅迫刺激而激活表達；脅迫越強，誘導(dǎo)表達效果也越顯著.SDS基因的誘導(dǎo)表達有利于植株抵抗脅迫[9].

在組織培養(yǎng)過程中，植物外植體在含有植物激素的培養(yǎng)基中失去原有的分化狀態(tài)，形成無規(guī)律的細胞團，即愈傷組織.對于植物來說，組織培養(yǎng)是強脅迫[10].許多研究表明，組織培養(yǎng)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生可遺傳的遺傳變異和表觀遺傳變異，稱為體細胞克隆變異.植物體細胞克隆變異可導(dǎo)致基因組中很多基因的表達模式發(fā)生改變[10-12].

本實驗以玉米F1正反雜交種幼胚為外植體，誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)愈傷組織；選取前人在文獻中報道的20個玉米印跡基因(10個MEG和10個PEG)[5，8]，研究了在不同繼代培養(yǎng)時間(0，3，5，9和12個月)的愈傷組織中發(fā)生的印跡基因的表達變異，以為體細胞克隆變異機制及印跡基因功能研究提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 植物材料

玉米自交系親本B73(B)和Mo17(M)種植于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗地.以人工授粉方法制造F1正反雜交種BM(B73 × Mo17，B73為母本、Mo17為父本)和MB(Mo17 × B73，Mo17為母本、B73為父本).授粉后18 d，從田間選取BM和MB的穗，迅速拿到實驗室，用鑷子取胚和胚乳，用液氮冷凍，儲存于-70℃冰箱備用.葉片材料取自3葉期植株.不同植物材料的取樣均設(shè)置3個重復(fù).

1.2 愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)

取授粉后18 d的玉米幼嫩種子，先用表面活性劑清洗(去除表面張力)，再用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺上用70%的酒精進行表面消毒30 s，無菌水沖洗2次后用0.1%的HgCl2溶液浸泡滅菌8 min，然后用無菌水反復(fù)沖洗5～6次.在超凈工作臺上用鑷子剝?nèi)シN皮，取出幼胚，將幼胚盾片朝上分別接種于N6E誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6 3.99 g/L + 2，4-D 2 mg/L + 肌醇 0.1 g/L + 脯氨酸 2.76 g/L + 水解酪蛋白 0.1 g/L + 3 %蔗糖 + 0.68 %瓊脂，pH=5.8)和馬鈴薯培養(yǎng)基(馬鈴薯用200 g/L無菌水煮沸20 min后過濾，加5 %蔗糖、0.68 %瓊脂，調(diào)pH=5.8)；每個三角瓶中接種10個幼胚，置于25℃人工氣候箱進行暗培養(yǎng).約15 d后長出愈傷組織，把一部分愈傷用液氮冷凍，儲存于-70℃冰箱(0繼代時間愈傷組織).同時，將愈傷組織分別轉(zhuǎn)移到N6繼代培養(yǎng)基(N6 3.99 g/L + 2，4-D 2 mg/L + 肌醇 0.1 g/L + 3%蔗糖 + 0.68 %瓊脂，pH=5.8)和馬鈴薯繼代培養(yǎng)基(馬鈴薯用200 g/L無菌水煮沸20 min 后過濾，加5 %蔗糖、0.68 %瓊脂，pH=5.8)，置于25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng).繼代頻率為每隔14～20 d繼代一次，每2～3個月取愈傷組織冷凍，并儲存于-70℃冰箱，直到用于總RNA提取.愈傷組織的取樣設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)的愈傷組織分別取自不同的三角瓶.

1.3 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

總RNA提取按照Invitrogen公司Trizol試劑說明書進行.取1 μL總RNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度計(Thermo Scientific，http：//www.nanodrop.com)測定RNA濃度和質(zhì)量.各樣品RNA質(zhì)量濃度為0.5～1.5 μg/μL，D(260)/D(280)=1.9～2.0，符合反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)要求.另外，用經(jīng)DEPC處理的水制備1.0%瓊脂糖凝膠，鑒定RNA的完整性.

取提取的總RNA 2 μg，用DNaseⅠ(TransGen Biotech)進行去基因組DNA處理，以O(shè)ligo(dT)為下游引物進行反轉(zhuǎn)錄，具體方法參照TransGen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransGen Biotech，http：//www.transgen.com.cn)說明書進行.

從Zhang等和Waters等[5，8]報道的玉米印跡基因中隨機選出20個印跡基因，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(見表1).同時，以玉米肌動蛋白基因Actin(ID：GRMZM2G126010)設(shè)計參照引物進行PCR，調(diào)整各個樣品的起始量進行均一化.Actin基因的正反向引物序列分別為CCTGAAGATCACCCTGTGCT和GCAGTCTCCAGCTCCTGTTC.PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃初始變性2 min；然后，95℃30 s，60℃40 s，72℃40 s，25～30次循環(huán)(對不同引物，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果調(diào)整循環(huán)數(shù))；最后72℃延伸8 min.PCR反應(yīng)體系為20 μL，使用的試劑購自Takara公司.RT-PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖進行凝膠電泳.基因功能注釋信息查詢NCBI數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)和MaizeGDB(https：//www.maizegdb.org/)(見表2).

表1 玉米印跡基因RT-PCR引物序列

表2 玉米印跡基因功能注釋信息和參考文獻

注：*表示MEG為母本印跡基因；**表示PEG為父本印跡基因.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同繼代培養(yǎng)時間玉米愈傷組織中母本印跡基因的表達變異

本研究用于組織培養(yǎng)的基因型為玉米兩個正反F1雜交種：B73 × Mo17(BM)和Mo17 × B73(MB).由于許多印跡基因只在種子器官表達，在營養(yǎng)器官沉默，本試驗把種子器官(胚、胚乳)作為實材，把營養(yǎng)器官(葉片)作為參照.首先檢測在5個不同繼代培養(yǎng)時間(0，3，5，9，12個月)愈傷組織中10個玉米MEG的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4個MEG出現(xiàn)不同程度的表達變異.其中，胚乳特異表達的GRMZM2G147226基因在繼代培養(yǎng)9個月(BM)和12個月(BM和MB)的愈傷中出現(xiàn)微弱的激活表達；胚、胚乳特異表達的GRMZM2G370991基因在0繼代培養(yǎng)時間的BM愈傷組織、繼代培養(yǎng)9個月(MB)和12個月(BM和MB)的愈傷中出現(xiàn)微弱的激活表達(見圖1、表3).除了激活表達，印跡基因的體細胞克隆表達變異也出現(xiàn)了基因沉默變異，如在胚、胚乳和葉片中都有表達的GRMZM2G033413基因，在繼代培養(yǎng)9個月(MB)和12個月(BM和MB)的愈傷中出現(xiàn)了基因沉默的現(xiàn)象.GRMZM2G169695基因則在繼代培養(yǎng)3個月和5個月的愈傷中出現(xiàn)了基因沉默的現(xiàn)象(見圖1、表3).從正反雜交種之間的變異情況來看，只有2個基因(GRMZM2G147226和GRMZM2G370991)在個別年齡的愈傷組織中存在差異.

另外，有6個MEG未顯示任何變異.其中，具有胚乳或(和)胚特異表達特性(葉片中不表達)的5個MEG(GRMZM2G073700，GRMZM2G062650，GRMZM2G118205，GRMZM2G014119和GRMZM2G150134)，在各個時期愈傷組織中都沒有任何激活；而GRMZM2G374088基因則在不同器官及不同時期愈傷組織中都顯示了高表達(見圖1、表3).

圖1 10個玉米母本印跡基因(MEG)在不同繼代培養(yǎng)時間愈傷組織中的表達結(jié)果

表達模式愈傷組織有無變異及變異類型母本印跡基因(MEG)父本印跡基因(PEG)胚乳特異表達有變異,愈傷表達激活GRMZM2G147226GRMZM2G127160GRMZM2G449489胚、胚乳特異表達有變異,愈傷表達激活GRMZM2G370991AC191534.3_FG003GRMZM2G028366胚、胚乳和葉片均表達有變異,愈傷表達沉默GRMZM2G033413GRMZM2G169695GRMZM2G006732胚乳特異表達無變異,愈傷不表達GRMZM2G073700GRMZM2G062650GRMZM2G091819胚、胚乳特異表達無變異,愈傷不表達GRMZM2G118205GRMZM2G014119胚特異表達無變異,愈傷不表達GRMZM2G150134胚、胚乳和葉片均表達無變異,愈傷表達GRMZM2G374088GRMZM2G138382GRMZM2G103909GRMZM2G447406GRMZM5G845175

2.2 不同繼代培養(yǎng)時間玉米愈傷組織中父本印跡基因的表達變異

對10個玉米父本印跡基因(PEG)在正反F1雜交種BM和MB 5個不同繼代培養(yǎng)時間(0，3，5，9，12個月)的愈傷組織中表達情況的分析表明，有50%的PEG出現(xiàn)了不同程度的表達變異，而且相對于MEG，PEG的基因表達變異更加明顯.具體來說，有2個PEG (GRMZM2G127160和GRMZM2G449489)只在胚乳中特異表達，而在胚和葉片中不表達，但是在9個月和12個月繼代培養(yǎng)的愈傷組織中都有少量激活表達(見圖2、表3)；2個胚和胚乳特異表達的PEG(AC191534.3_FG003和GRMZM2G028366)分別在5個月MB和9，12個月繼代培養(yǎng)的愈傷組織中出現(xiàn)了明顯的激活表達(見圖2、表3)；在胚、胚乳和葉片中都有表達的基因GRMZM2G006732在不同時期的愈傷組織中均出現(xiàn)了基因沉默，或表達極其微弱(見圖2、表3).

在無變異的5個PEG中，只有GRMZM2G091819屬胚乳特異表達基因，另外4個PEG(GRMZM2G138382，GRMZM2G103909，GRMZM2G447406和GRMZM5G845175)在不同器官及不同時期的愈傷中都有表達，尤其是GRMZM2G447406和GRMZM5G845175基因在不同器官及不同時期愈傷組織中均有相似的較高表達(見圖2、表3).

3 討論

在近年來常用的mRNA含量測定技術(shù)中，雖然熒光實時定量PCR方法的應(yīng)用越來越廣泛，但事實上，如果只需評估樣品之間基因表達水平的相對差異，半定量RT-PCR(semi quantitative reverse transcription PCR，SqRT-PCR)技術(shù)則完全可以滿足實驗要求.與經(jīng)典的檢測基因的表達方法如Northern印跡、RNA酶保護分析等相比，半定量RT-PCR法具有專一性好、快速簡便、費用低等優(yōu)點.尤其是在需要檢測不同器官之間表達差異顯著的基因時，比起熒光實時定量PCR方法，半定量RT-PCR方法能夠更直觀地顯示基因表達是否存在器官特異性，以及是否發(fā)生激活或沉默.本實驗的研究目的是為了檢測玉米印跡基因在不同培養(yǎng)時間的愈傷組織中的表達變異，而印跡基因在不同組織之間表達差異顯著，所以本研究采用了半定量RT-PCR方法分析了基因表達.

本文的研究結(jié)果表明，玉米印跡基因的表達變異在繼代培養(yǎng)9個月和12個月時明顯增加，這與前人的研究結(jié)果相似.薛美鳳等[13]報道，愈傷組織的培養(yǎng)時間是造成體細胞克隆變異和再生植株表型變異的一個重要原因，隨著胚性愈傷組織選擇培養(yǎng)時間的延長和繼代次數(shù)的增多，愈傷細胞感受的脅迫越來越強，體細胞胚變異頻率逐漸升高.

圖2 10個玉米父本印跡基因(PEG)在不同繼代培養(yǎng)時間愈傷組織中的表達結(jié)果

從基因功能注釋來看，在發(fā)生表達變異的4個MEG中，有2個MEG(GRMZM2G370991和GRMZM2G033413)分別被注釋為EIN2(乙烯不敏感2)轉(zhuǎn)運蛋白和脫落酸不敏感類似蛋白(見表2).乙烯和脫落酸是兩種“逆境激素”，在植物遇到逆境脅迫時含量增加，以便植物抵抗不良的環(huán)境條件.愈傷細胞經(jīng)歷離體培養(yǎng)和植物激素等化學(xué)物質(zhì)刺激的“強脅迫”，可能激活與抗逆激素相關(guān)的編碼基因，這也說明玉米印跡基因除了在種子發(fā)育過程中起重要作用以外，在抗脅迫過程中也可能起一定作用.

[參 考 文 獻]

[1] GEHRING M.Genomic imprinting：insights from plants[J].Annual Review of Genetics，2013，47：187-208.

[2] SHA K.A mechanistic view of genomic imprinting[J].Annual Review of Genomics and Human Genetics，2008，9：197-216.

[3] HSIEH T F，SHIN J，UZAWA R，et al.Regulation of imprinted gene expression in Arabidopsis endosperm[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108(5)：1755-1762.

[4] LUO M，TAYLOR J M，SPRIGGS A，et al.A genome-wide survey of imprinted genes in rice seeds reveals imprinting primarily occurs in the endosperm[J].PLoS Genetics，2011，7(6)：e1002125.

[5] WATERS A J，MAKAREVITCH I，EICHTEN S R，et al.Parent-of-origin effects on gene expression and DNA methylation in the maize endosperm[J].The Plant Cell，2011，23(12)：4221-4233.

[6] XU W，DAI M，LI F，et al.Genomic imprinting，methylation and parent-of-origin effects in reciprocal hybrid endosperm of castor bean[J].Nucleic Acids Research，2014，42(11)：6987-6998.

[7] ZHANG M，LI N，HE W，et al.Genome-wide screen of genes imprinted in sorghum endosperm，and the roles of allelic differential cytosine methylation[J].Plant Journal，2016，85(3)：424-436.

[8] ZHANG M，ZHAO H，XIE S，et al.Extensive，clustered parental imprinting of protein-coding and noncoding RNAs in developing maize endosperm[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108(50)：20042-20047.

[9] SANCHEZ D H，PASZKOWSKI J.Heat-induced release of epigenetic silencing reveals the concealed role of an imprinted plant gene[J].PLoS Genetics，2014，10(11)：e1004806.

[10] SMULDERS，KLERK.Epigenetics in plant tissue culture[J].Plant Growth Regulation，2011，63：137-146.

[11] NGEZAHAYO F，XU C，WANG H，et al.Tissue culture-induced transpositional activity of mPing is correlated with cytosine methylation in rice[J].BMC Plant Biology，2009，9：91.

[12] ZHANG M，XU C，YAN H，et al.Limited tissue culture-induced mutations and linked epigenetic modifications in F hybrids of sorghum pure lines are accompanied by increased transcription of DNA methyltransferase and 5-methylcytisine glycosylases[J].Plant Journal，2009，57(4)：666-679.

[13] 薛美鳳，郭余龍，李名揚，等.長期繼代對棉花胚性愈傷組織體胚發(fā)生能力及再生植株變異的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，15(4)：19-21.