陳姝穎，李海毅，李昭陽(yáng)

(吉林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130012)

隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，納米材料已廣泛應(yīng)用到工業(yè)、農(nóng)業(yè)和畜牧養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域，進(jìn)入環(huán)境中的納米材料逐年增加，同時(shí)也不可避免地進(jìn)入到水體中，[1]特別是銀納米粒子，一種常用的抗菌性納米粒子.在眾多抗菌材料中，無(wú)機(jī)含銀納米抗菌材料具有較廣的抗菌范圍，殺菌能力很強(qiáng)并且對(duì)環(huán)境的毒性效應(yīng)較低，是目前使用范圍最大的抗菌材料之一[2].然而隨著納米銀的大量使用，其在環(huán)境中的影響和作用機(jī)制也引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注[3-5].

以往，研究人員對(duì)納米銀(AgNPs)進(jìn)行了許多的體外毒性實(shí)驗(yàn)及其毒性作用機(jī)制的探討.有研究[6-7]表明，納米銀包被材料的種類和直徑大小可能對(duì)其毒害效果產(chǎn)生影響；針對(duì)不一樣的細(xì)胞類型，例如對(duì)放線菌、細(xì)菌、真菌，其毒害效果也有所差異.B?hmert等[8]發(fā)現(xiàn)納米銀會(huì)產(chǎn)生活性氧和超氧陰離子，這些活性物質(zhì)可以氧化細(xì)胞膜和脂質(zhì)導(dǎo)致生物體細(xì)胞的受損和死亡.納米銀的毒性作用與納米顆粒的粒徑大小有關(guān)，Choi等[9]發(fā)現(xiàn)納米銀的粒徑小于5 nm 時(shí)對(duì)細(xì)菌的毒性最強(qiáng).硝化細(xì)菌在自然環(huán)境的氮循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，而在水生態(tài)系統(tǒng)中由于納米銀的進(jìn)入對(duì)硝化細(xì)菌產(chǎn)生的影響情況還知之甚少，所以本文研究了在不同AgNPs濃度、pH和天然有機(jī)質(zhì)的條件下，納米銀對(duì)水體中硝化細(xì)菌的影響，以為水環(huán)境中納米銀的毒性效應(yīng)研究提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

納米銀(AgNPs，1 mg/mL，粒徑≤15 nm)購(gòu)自廣州艾普納米科技有限公司；硝化細(xì)菌購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心.實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室配水，供試水體的基本性質(zhì)見(jiàn)表1.

表1 供試水體基本性質(zhì)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將細(xì)菌樣品分散到配制的供試水體中，混勻后逐級(jí)稀釋至適當(dāng)倍數(shù).取100 μL稀釋液涂布于斯蒂芬遜培養(yǎng)基平板上，恒溫(25℃)恒濕培養(yǎng)，通過(guò)菌落數(shù)和稀釋倍數(shù)計(jì)算出實(shí)際菌量.所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行2次重復(fù).

抑菌率(%)=100×(空白對(duì)照組菌量-處理組菌量)/空白對(duì)照組菌量.

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和圖表制作采用 IBM SPSS Statistics 19，Microsoft Office Excel 2010和OriginPro8.SR3軟件.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同質(zhì)量濃度的納米銀對(duì)硝化細(xì)菌活性的影響

將一定量硝化細(xì)菌加入到AgNPs質(zhì)量濃度分別為0，5，10，15和20 μg/mL的1 mL水體中，混勻后分別取出100 μL在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，pH=7.2.在培養(yǎng)的第0，2，4，6，8和10天分別計(jì)數(shù).AgNPs對(duì)硝化細(xì)菌活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖1.

由圖1可見(jiàn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間未添加AgNPs水體的空白對(duì)照組硝化細(xì)菌的數(shù)量均高于添加組，且差異均顯著；AgNPs質(zhì)量濃度為0和5 μg/mL的兩個(gè)處理組隨著處理時(shí)間的增加硝化細(xì)菌的數(shù)量先增加后降低，這是由于土壤中一開(kāi)始有可供應(yīng)硝化細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，隨著硝化細(xì)菌的增加，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，細(xì)菌產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)和饑餓導(dǎo)致數(shù)量減少.AgNPs質(zhì)量濃度為10，15，20 μg/mL的3個(gè)處理組，硝化細(xì)菌的數(shù)量呈先下降、后上升、再下降的變化趨勢(shì)，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于最初AgNPs的質(zhì)量濃度較高，對(duì)硝化細(xì)菌的毒性較大，進(jìn)而導(dǎo)致硝化細(xì)菌死亡；隨后硝化細(xì)菌產(chǎn)生抗性并進(jìn)行繁殖，數(shù)量有所回升；而后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少又導(dǎo)致數(shù)量再次下降.由此可知，AgNPs對(duì)硝化細(xì)菌有一定的抑制作用.AgNPs與生物分子相似而且粒徑細(xì)小，很容易被生物攝入細(xì)胞內(nèi)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，擾亂細(xì)胞的正常代謝循環(huán)；同時(shí)，也可以溶解出相應(yīng)的金屬離子，造成一定的毒性.AgNPs對(duì)硝化細(xì)菌活性的抑制情況見(jiàn)圖2.

圖1 不同濃度AgNPs對(duì)硝化細(xì)菌的影響

由圖2可見(jiàn)，硝化細(xì)菌的抑制率隨添加的AgNPs質(zhì)量濃度的增加而增大.AgNPs質(zhì)量濃度為20 μg/mL時(shí)，在第2天硝化細(xì)菌的抑制率就達(dá)到了95%，在第10天達(dá)到了98%；AgNPs為5 μg/mL時(shí)，硝化細(xì)菌的抑制率在第4天才達(dá)到最大，為32.74%.所以高濃度和低濃度的AgNPs都會(huì)對(duì)硝化細(xì)菌造成一定的抑制作用.從圖2還可以看出，AgNPs質(zhì)量濃度為15和20 μg/mL時(shí)抑制率先增加然后逐漸達(dá)到平穩(wěn)，說(shuō)明硝化細(xì)菌對(duì)高濃度的AgNPs抵制能力較弱，進(jìn)而很快受了抑制；而在AgNPs質(zhì)量濃度為5和10 μg/mL時(shí)，硝化細(xì)菌的抑制率都是先增加后降低然后再增加，說(shuō)明低濃度的AgNPs，對(duì)硝化細(xì)菌一開(kāi)始有一定的抑制作用，但隨著時(shí)間增加硝化細(xì)菌產(chǎn)生了抗性，進(jìn)而繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖數(shù)量增多，到后期在AgNPs和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少的雙重作用下，細(xì)菌數(shù)量再一次降低，進(jìn)而導(dǎo)致抑制率又上升.謝小保等[10]研究了納米銀粒子對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的影響機(jī)制發(fā)現(xiàn)，納米銀粒子通過(guò)破壞細(xì)胞壁產(chǎn)生孔洞后進(jìn)入周質(zhì)空間，導(dǎo)致細(xì)胞膜成分滲漏，在破壞細(xì)胞膜的同時(shí)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，對(duì)細(xì)胞造成損傷；Kim等[11]研究了納米銀對(duì)白色念珠菌的作用，也發(fā)現(xiàn)了納米銀會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并對(duì)細(xì)胞內(nèi)的DNA和細(xì)胞質(zhì)造成傷害，導(dǎo)致細(xì)菌最終死亡.還有學(xué)者[12]研究了納米銀對(duì)大腸桿菌的影響，發(fā)現(xiàn)納米銀濃度會(huì)影響大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)脫氫酶的活性，并且隨著納米銀濃度的增高而降低.Abbasi等[13]的研究表明，納米銀產(chǎn)生的活性氧既可以直接對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生強(qiáng)氧化作用使細(xì)胞死亡，同時(shí)活性氧還可以對(duì)呼吸酶產(chǎn)生一定的抑制作用，間接導(dǎo)致細(xì)菌死亡.

2.2 納米銀對(duì)不同pH水體硝化細(xì)菌活性的影響

水體的pH是影響水體中微生物活動(dòng)的重要理化性質(zhì)之一，pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)對(duì)微生物的活性產(chǎn)生影響.而pH對(duì)AgNPs的環(huán)境行為也有一定的影響.將細(xì)菌分別加入到pH為3，5，7，9和11的AgNPs質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的水樣中，混勻后取出100 μL進(jìn)行培養(yǎng).培養(yǎng)溫度為25℃.在培養(yǎng)的第0，2，4，6，8和10天分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3.不添加AgNPs時(shí)，pH對(duì)硝化細(xì)菌也有一定的抑制作用，抑制情況如圖4所示.

圖3 AgNPs對(duì)不同pH水體硝化細(xì)菌活性的抑制率

由圖3可見(jiàn)，低pH值條件下AgNPs對(duì)硝化細(xì)菌的抑制率較強(qiáng)，而在高pH值條件下AgNPs對(duì)硝化細(xì)菌的抑制率有所減弱.在pH=3和pH=5時(shí)，抑制率在第6天達(dá)到最大，分別為96.97%和93.86%；而pH=11時(shí)，抑制率先上升再降低，在第6天達(dá)到最大為60.48%，而在第10天降到54.83%.由圖4可見(jiàn)，不同的pH對(duì)硝化細(xì)菌也有一定的影響.當(dāng)pH=7時(shí)，對(duì)硝化細(xì)菌先有一定的抑制作用，而隨著時(shí)間的增加對(duì)硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖有一定的促進(jìn)作用，但變化波動(dòng)范圍不大，在0.05%左右波動(dòng)；而其他pH條件對(duì)硝化細(xì)菌也有一定的抑制作用，但是抑制率均在10%以內(nèi)，pH=3時(shí)，抑制率在第2天為7.84%，之后趨于平緩.所以綜上可以看出抑制硝化細(xì)菌的主要因素不是pH.

有研究[14]表明，低pH值條件下金屬納米顆粒易于金屬離子釋放，而高pH值條件則容易發(fā)生團(tuán)聚.在pH值較低時(shí)，AgNPs釋放大量的Ag+，較高濃度的Ag+會(huì)與細(xì)菌相互作用，對(duì)硝化細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生毒性和脅迫導(dǎo)致細(xì)胞破裂和死亡，而Ag+和AgNPs的復(fù)合作用導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌的毒性加強(qiáng)；pH值較高時(shí)，由于AgNPs發(fā)生團(tuán)聚，降低了AgNPs與細(xì)菌接觸的概率，毒性作用減弱，從而導(dǎo)致硝化細(xì)菌抑制率降低.

圖5 水中添加腐殖酸AgNPs對(duì)硝化細(xì)菌活性的抑制率

2.3 納米銀對(duì)腐殖酸水體中硝化細(xì)菌活性的影響

天然有機(jī)質(zhì)是水體和土壤環(huán)境中植物或微生物殘骸經(jīng)過(guò)一定的生物過(guò)程而廣泛存在的一類復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)[15].有研究表明，自然環(huán)境中存在的天然有機(jī)質(zhì)會(huì)影響納米顆粒物在環(huán)境中的行為[16].在pH=7.2，AgNPs質(zhì)量濃度為10 μg/mL條件下，細(xì)菌培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，本實(shí)驗(yàn)研究了腐殖酸的存在是否影響AgNPs對(duì)水體硝化細(xì)菌的抑制作用，結(jié)果見(jiàn)圖5.體系中腐殖酸的濃度固定為50 mmol/L(以C計(jì)).

由圖5可見(jiàn)，水體中添加腐殖酸明顯降低了AgNPs對(duì)硝化細(xì)菌的抑制作用，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加硝化細(xì)菌的抑制率先增加，在第4天抑制率達(dá)到最高，為13.38%；隨后抑制率降低，第10天的抑制率僅為6.35%.由此可以看出，環(huán)境中廣泛存在的天然有機(jī)質(zhì)腐殖酸能夠影響納米顆粒物對(duì)水體中微生物的毒害作用.有研究[17]表明，納米顆粒物的表面電荷會(huì)受到天然有機(jī)質(zhì)的影響，天然有機(jī)質(zhì)可以增強(qiáng)納米顆粒物膠體的熱穩(wěn)定性以及提供靜電斥力和空間位阻穩(wěn)定納米顆粒物膠體，從而可以使納米顆粒物在水體環(huán)境中產(chǎn)生的團(tuán)聚現(xiàn)象趨于穩(wěn)定，并且降低納米顆粒物對(duì)水體中生物的毒性.還有研究[18]發(fā)現(xiàn)，納米顆粒物的表面包被了天然有機(jī)質(zhì)，在水環(huán)境中減少了納米顆粒和生物的接觸概率，相應(yīng)降低了納米顆粒對(duì)水體生物的毒害作用.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，AgNPs在質(zhì)量濃度0～20 μg/mL范圍內(nèi)均對(duì)硝化細(xì)菌有抑制作用，且濃度越高抑制率越高.低pH值條件下AgNPs易于金屬離子釋放，對(duì)硝化細(xì)菌的抑制率較高；而高pH值條件下AgNPs容易發(fā)生團(tuán)聚，對(duì)硝化細(xì)菌的毒性作用減弱.腐殖酸能夠促使水體中AgNPs的團(tuán)聚趨于穩(wěn)定，并且還能夠包覆AgNPs降低對(duì)硝化細(xì)菌的毒性作用.

[參 考 文 獻(xiàn)]

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