王啟船,王 青,萬里新,屈中玉,趙得堡,朱 昆

(1.南陽市中心醫(yī)院 腫瘤1科,河南 南陽473009;2.南陽市中心醫(yī)院 供應(yīng)室二部,河南 南陽473009; 3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 藥學(xué)部,吉林 長春130033)

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占到80%以上，且絕大部分確診時(shí)已到晚期，5年生存率低于10%[1]。尋找一種高特異性與敏感性的分子標(biāo)志物以提高NSCL早期診斷治療、改善患者預(yù)后就顯得尤為重要[2，3]。相關(guān)研究表明，微小RNA是一種高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，在NSCLC分化、浸潤與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用[4]。微小RNA-204(miR-204)作為一種新的致癌基因或抑癌基因，在鼻咽癌、肝癌等腫瘤組織均為明顯低表達(dá)狀態(tài)，且與腫瘤分期及預(yù)后明顯相關(guān)[5，6]，也有學(xué)者報(bào)道m(xù)iR-204可通過抑制腫瘤細(xì)胞A549的增殖發(fā)揮抗腫瘤作用[7]，但目前還少有對癌細(xì)胞H252影響的文獻(xiàn)報(bào)道?；诖朔N背景，本文通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的方法，分析miR-204在NSCLC中的表達(dá)及對H252癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月-2016年12月醫(yī)院手術(shù)治療的NSCLC患者72例肺癌及相應(yīng)癌旁組織(距肺癌組織>5 cm)標(biāo)本，男38例，女34例；年齡43-72歲，平均(55.36±6.12)歲；TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期28例，Ⅲ期24例，Ⅳ期8例。排除術(shù)前放化療或分子靶向治療者，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。標(biāo)本切除后立即保存于液氮中，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，整個(gè)操作過程遵循無酶原則。

1.2 細(xì)胞與主要試劑

人非小細(xì)胞肺癌H252細(xì)胞株：中科院上海生物研究所細(xì)胞庫；F-12K培養(yǎng)基與胎牛血清：美國Gibco公司；RNA提取盒、逆轉(zhuǎn)試劑盒：美國Omega公司；Marke、SYBR實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒：大連寶生物工程有限公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒：美國BD公司；miR-204模擬物、miR-204抑制物、miR-204及U6 引物：上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 非小細(xì)胞肺癌H252細(xì)胞細(xì)胞株使用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：370C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱。參照Lipofectamine 3000說明書，轉(zhuǎn)染分為對照組、陰性對照組、miR-204模擬組、miR-204抑制組，將各組轉(zhuǎn)染物轉(zhuǎn)染入H252細(xì)胞。

1.3.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，按照100 μl/孔(約含1×104個(gè)細(xì)胞)接種到96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24、48、72 h、96 h后，每孔(每組6個(gè)平行孔)加入μlCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于450 nm波長酶標(biāo)儀上檢測各孔吸光度，重復(fù)3次，取各孔平均值作為細(xì)胞相對增殖水平。

1.3.3細(xì)胞凋亡檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h，取1×105個(gè)細(xì)胞，800 r/min離心5 min棄上清液，加入0.5 ml結(jié)合液重懸細(xì)胞使細(xì)胞密度達(dá)到1×105個(gè)細(xì)胞/ml，隨后加入Annxin V-FITC(5 μl)混勻，避光室溫孵育15 min。加Propidium Iodide(5 μl)混勻，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，重復(fù)3次，計(jì)算凋亡率。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) RNA提取采用Trizol法，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃5 s，60℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)水平：△CtmiR-204-CtU6，△△Ct=△CtT-△CtN。miR-204、U6引物系列見表1。

表1 miR-204、U6基因qRT-PCR引物系列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織及正常組織miR-204相對表達(dá)比較

肺癌組織miR-204的mRNA相對表達(dá)水平為(2.38±0.42)，癌旁組織miR-204的mRNA相對表達(dá)水平為(5.46±0.54)。肺癌組織miR-204的mRNA相對表達(dá)水平明顯低于癌旁組織mRNA相對表達(dá)水平(t=11.028,P<0.01)。

2.2 不同臨床特征患者miR-204相對表達(dá)比較

不同性別、年齡患者miR-204相對表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Ⅲ-Ⅳ期、腫瘤直徑≥3 cm、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移肺癌患者miR-204相對表達(dá)明顯低于Ⅰ-Ⅱ期、腫瘤直徑<3 cm、淋巴結(jié)未發(fā)生轉(zhuǎn)移者(P<0.05,P<0.01)。見表2。

2.3 miR-204對人H252細(xì)胞增殖與凋亡的影響

對照組、陰性對照組、抑制物組、模擬物組miR-204的mRNA相對表達(dá)水平為(2.36±0.45)、(2.21±0.42)、(1.02±0.24)、(4.01±0.54)，四組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.124,P<0.01)；模擬物組miR-204的mRNA相對表達(dá)水平明顯高于陰性對照組、抑制物組(t=6.299,11.619,P<0.05,P<0.01)。

24 h，對照組、陰性對照組、抑制物組、模擬物組4組H252細(xì)胞增殖水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；48 h、72 h、96 h，與陰性對照組比較，抑制物組H252細(xì)胞增殖水平明顯升高，模擬物組H252細(xì)胞增殖水平明顯降低(P<0.05,P<0.01)，與抑制物組比較，模擬物組H252細(xì)胞增殖水平明顯降低(P<0.01)。見圖1。

表2 不同臨床特征患者miR-204相對表達(dá)水平比較

與陰性對照組比較，抑制物組H252細(xì)胞凋亡率明顯降低，模擬物組H252細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05,P<0.01)；與抑制物組比較，模擬物組H252細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。見圖2。

3 討論

隨著蛋白組學(xué)與基因水平研究的不斷深入，NSCLC發(fā)病機(jī)制、早期診斷、靶向治療越來越受到學(xué)者的關(guān)注。表皮因子受體(EGFR)是公認(rèn)有效抗癌靶點(diǎn)[8]，Zhen等[9]研究認(rèn)為miRNAs可能在靶向EGFR治療中發(fā)揮著重要的作用。相關(guān)研究表明，miRNAs可通過抑制轉(zhuǎn)錄過程調(diào)控基因表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[10]。能夠通過直接或間接方式抑制ERK1/2、AKT、STAT3表達(dá)，進(jìn)而阻斷EGFR信號通路[11]；miR-134可競爭性結(jié)合EGFR3’-URT，抑制EGFR信號通路活性，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[12]。

圖1 miR-204對人H252細(xì)胞增殖的影響

圖2 miR-204對人H252細(xì)胞凋亡的影響

MiR-204編碼基因位于人類染色體7q32，在脊椎動(dòng)物中為一種高度保守的成熟序列[13]，作為一種新的致癌基因與抑癌基因，廣泛參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展與侵襲過程[14]。如MiR-204高表達(dá)可誘導(dǎo)前列腺衍生上皮因子(PDEF)失控刺激前列腺癌發(fā)生[15]，低表達(dá)與人腎黎明細(xì)胞癌(RCCC)惡性臨床病理特征明顯相關(guān)[16]。蔣義成等[17]研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌患者腫瘤組織miR-204呈明顯低表達(dá)狀態(tài)，且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。本文研究中，NSCLC腫瘤組織miR-204相對表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，且Ⅲ-Ⅳ期、腫瘤直徑≥3 cm、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移肺癌患者miR-204相對表達(dá)明顯低于Ⅰ-Ⅱ期、腫瘤直徑<3 cm、淋巴結(jié)未發(fā)生轉(zhuǎn)移者，與李麗霞等[18]文獻(xiàn)報(bào)道基本相似，提示miR-204的表達(dá)水平與NSCLC惡性病理行為明顯相關(guān)。

許有忠等[19]等通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染與增殖實(shí)驗(yàn)報(bào)道，轉(zhuǎn)染miR-204模擬物組A-549細(xì)胞增殖水平明顯低于陰性對照組、抑制物組，認(rèn)為miR-204作為一種抑癌基因可抑制NSCLC腫瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。H252作為腫瘤細(xì)胞家族一員，也是反應(yīng)NSCLC惡性程度的有效指標(biāo)[20]。本文研究中，通過對照組、陰性對照組、抑制物組、模擬物組分組實(shí)驗(yàn)，48 h、72 h、96 h，模擬物組H252細(xì)胞增殖水平明顯低于陰性對照組、抑制物組，H252細(xì)胞凋亡率明顯高于陰性對照組、抑制物組。所得結(jié)論也支持上述文獻(xiàn)觀點(diǎn)。

本文研究結(jié)果表明，非小細(xì)胞肺癌組織miR-204呈明顯低表達(dá)狀態(tài)，與TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性病理行為明顯相關(guān)。miR-204能抑制H252癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但其作用機(jī)制尚不十分清楚，有待于更多的基礎(chǔ)研究與臨床研究去證實(shí)。

作者簡介：王啟船(1975-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤內(nèi)科及腫瘤微創(chuàng)治療。

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