宋志明，余舒杰，鞏貴宏，楊建濤，張海波，錢孝賢,4*

(1.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)科，河南 開封475001；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院 心內(nèi)科， 廣東 廣州510630；3.河南大學(xué)衰老與疾病研究所，河南 開封475001；4.中山大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，廣東 廣州510630)

老化是一種與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的日益進展的退行性過程。而炎癥反應(yīng)被認為是人類老化過程中起到核心作用，無論是自然性老化還是諸多老年相關(guān)性疾病，如動脈硬化、阿爾茨海默病和腫瘤等。炎癥狀態(tài)是心血管事件的風(fēng)險因子，且隨著人類年齡的增長炎癥基因的表達逐漸增加。

在抗衰老治療策略中，控制炎癥被證實為一個關(guān)鍵措施。而年齡相關(guān)性系統(tǒng)性炎癥是導(dǎo)致許多慢性疾病的共同機制，特異性的抑制促炎因子能夠減少年齡相關(guān)性慢性疾病的發(fā)生和發(fā)展。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1能夠保護過氧化氫誘導(dǎo)的細胞衰老[1]。同時，減少氧化應(yīng)激和炎癥能夠逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的細胞衰老[2]。本研究旨在考察人參皂苷Rb1對于老年鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激的作用，并探討其對主動脈內(nèi)皮功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

Rb1購自于成都普菲德生物技術(shù)有限公司。NO檢測試劑盒、分型SOD活性及MDA檢測試劑盒購自于南京建成生物公司。ICAM-1及MCP-1 Elisa試劑盒購自于BD公司。RNA提取Iso Plus試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。RevertAid逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及DyNAmo ColorFlash SYBR GREEN qPCR Kit購自于美國Thermo公司。異丙醇、無水乙醇等為國產(chǎn)優(yōu)級純，購自廣州化學(xué)試劑廠。引物由美國Life Technologies公司設(shè)計并合成。

1.2 動物分組及處理

40只雌性C57BL/6小鼠購自于中山大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于中山大學(xué)北校區(qū)動物實驗中心。實驗動物分為四組：①年輕對照組(3月，10只，Young)：每天腹腔注射無菌PBS；②老年P(guān)BS組(22月，10只，PBS old)：每天腹腔注射無菌PBS；③老年Rb1低劑量組(22月，10只，L Rb1)：按照10 mg Rb1/kg體重腹腔注射；④老年Rb1高劑量組(22月，10只，H Rb1)：按照20 mg Rb1/kg體重腹腔注射。進行腹腔注射時常規(guī)用酒精棉球消毒注射區(qū)域皮膚，腹腔注射總共持續(xù)6周。

1.3 動物標(biāo)本采集

小鼠接受6周的處理，繼續(xù)飼養(yǎng)3天后處死并收取標(biāo)本。共有10只老年小鼠在標(biāo)本采集前死亡，其中PBS old組死亡4只，L Rb1組死亡3只，H Rb1組死亡3只。所有小鼠給予10%水合氯醛600 mg/kg體重進行麻醉。

1.3.1血清的采集

小鼠麻醉后，用無齒彎鑷拔出眼球進行取血。為防止毛發(fā)造成的溶血，提前用眼科剪剪去眼球周圍的毛發(fā)。將盛有血的EP管放在管架上靜置1小時，之后以3 000 rpm離心10分鐘吸取上清，保存于-80℃冰箱備用。

1.3.2主動脈血管的剝離

眼球取血后將小鼠固定在手術(shù)臺上。用彎剪剪開小鼠皮膚，暴露出內(nèi)部臟器。先摘除肝臟、腎臟及肺臟等器官，然后剝離主動脈周圍的組織使血管游離出來。盡可能近心臟部位剪斷升主動脈，向下在髂總動脈分叉處剪斷，保存于-80℃冰箱用于后續(xù)RNA的提取。

1.4 實時熒光定量PCR檢測

于-80 ℃冰箱中取出各組實驗樣品，將主動脈血管置于勻漿器中充分研磨，應(yīng)用RNA提取Iso Plus 試劑提取組織RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再將制備好的cDNA 進行PCR 擴增。

PAI-1引物：上游為5’-TTC AGC CCT TGC TTG CCT C-3’，下游為5’-ACA CTT TTA CTC CGA AGT CGG T-3’；ICAM-1引物：上游為5’-GTG ATG CTC AGG TAT CCA TCC A-3’，下游為5’-CAC AGT TCT CAA AGC ACA GCG-3’；MCP-1引物：上游為5’-TTA AAA ACC TGG ATC GGA ACC AA-3’，下游為5’-GCA TTA GCT TCA GAT TTA CGG GT-3’；β-actin引物：上游為5’-GGC TGT ATT CCC CTC CAT CG-3’，下游為5’-CCA GTT GGT AAC AAT GCC ATG T-3’。反應(yīng)條件為95 ℃ 7 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40 個循環(huán)，用RT-qPCR 反應(yīng)體系擴增，使用SYBR Green RT-qPCR 相對定量的方法，比較各組管家基因β-actin 以及目的基因的循環(huán)閾值(Ct)值，以2-△△Ct值作為mRNA 的相對表達量。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)

以ELISA法檢測各組小鼠血清ICAM-1、MCP-1含量，具體操作均嚴(yán)格參考試劑說明書進行。

1.6 血清SOD及MDA的測定

用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，采用硫代巴比妥比色法(TBA法)測定MDA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.7 NO含量測定

采用試劑盒測定小鼠血清中NO含量，操作過程嚴(yán)格按照說明書進行。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

通過SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進行組間兩兩比較時，若方差齊，采用LSD 檢驗；若方差不齊，采用K-W 檢驗。P<0.05 被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清中ICAM-1、MCP-1含量的比較

圖1結(jié)果顯示與年輕對照組相比，老年對照組小鼠血清中ICAM-1和MCP-1含量均明顯升高；而Rb1高劑量處理組能一定程度上減少ICAM-1和MCP-1含量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組小鼠主動脈組織中ICAM-1、MCP-1 、PAI-1 mRNA表達的比較

為進一步了解Rb1對老年小鼠血管組織中炎癥的影響，我們對主動脈血管中炎癥指標(biāo)的mRNA進行了驗證。結(jié)果顯示與年輕小鼠相比，老年小鼠主動脈血管中的ICAM-1、MCP-1 、PAI-1 mRNA表達均明顯升高。高劑量Rb1使三種基因mRNA表達均下降，而低劑量Rb1可以降低PAI-1 mRNA表達。這些結(jié)果提示老年小鼠主動脈組織中炎癥反應(yīng)增加，而合適劑量的Rb1能夠在一定程度上減輕老年小鼠血管組織的炎癥，見圖2。

*P<0.05 vs.Young group；#P<0.05 vs.PBS old group

*P<0.05 vs.Young group；#P<0.05 vs.PBS old group；&P<0.05 vs.PBS old group

2.3 各組小鼠血清中SOD1及MDA含量的比較

老年對照組小鼠血清中SOD1活性較年輕對照組減低，而MDA含量升高；Rb1高劑量處理組提高了老年鼠體內(nèi)SOD1活性，并減少了MDA的含量(圖3)。這些結(jié)果提示老年小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增高，而高劑量Rb1能減輕老年小鼠的應(yīng)激。

*P<0.05 vs.Young group；#P<0.05 vs.PBS old group

2.4 各組小鼠主動脈組織eNOS mRNA表達及血清NO含量的比較

NO是一個廣泛存在于心血管系統(tǒng)內(nèi)的氣體信號分子，它在調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能方面具有重要作用，是反應(yīng)內(nèi)皮功能的重要分子，而其產(chǎn)生主要收到eNOS的調(diào)控。因此，我們選擇eNOS/NO作為檢測指標(biāo)來了解Rb1對于老年小鼠主動脈血管功能的影響。結(jié)果提示在老年小鼠主動脈血管中eNOS mRNA表達減少，與此同時血清中的NO含量減低，而給予高劑量Rb1能夠提高eNOS mRNA合成并增加老年小鼠血清中NO的濃度(圖4)。

*P<0.05 vs.Young group；#P<0.05 vs.PBS old group

3 討論

人參自古以來就被認為是一種增強機體抵抗力的中藥。隨著科技的發(fā)展，目前已有超過30余種的人參皂苷成分從人參中分離出來。人參皂苷已被證實具有減輕炎癥的作用。但是人參中一些已知和未知的成分所帶來的不良作用限制了人參在臨床實踐中的應(yīng)用。為更明確每種皂苷的性能和功效，分離出來的皂苷單體能夠規(guī)避人參成分復(fù)雜難以研究的困境。同時，人參皂苷Rb1是諸多皂苷中含量最多的一種[1]。我們既往研究也已證實人參皂苷Rb1能夠通過Sirt1/eNOS/NO途徑以及抑制氧化應(yīng)激等方面逆轉(zhuǎn)人臍靜脈內(nèi)皮細胞衰老[2,3]。本研究結(jié)果表明對于老年小鼠，人參皂苷Rb1具有減輕年齡相關(guān)性炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平的作用，促進主動脈組織eNOS/NO表達改善內(nèi)皮功能。

在老年人群體內(nèi)存在著長期持續(xù)的低水平炎癥反應(yīng)，一些炎癥標(biāo)志物如IL-1、ICAM-1和MCP-1都是隨著年齡的增長而不斷增加[4]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，老年小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)較年輕小鼠明顯升高。而年齡相關(guān)性炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的原因，目前有兩種解釋：一是隨著年紀(jì)的增加，免疫系統(tǒng)功能的不斷下降；二是隨著年齡增加，氧化還原狀態(tài)的變化。我們的研究證實了第二個因素，老年小鼠體內(nèi)氧化水平增高，進一步導(dǎo)致炎癥反應(yīng)增加。

從低等的秀麗線蟲到高等的人類，隨著年齡的增長氧化損傷都是逐漸加重的[5]。氧自由基、脂質(zhì)代謝產(chǎn)物MDA在老齡化動物和人群中都是明顯增加的，而抗氧化系統(tǒng)SOD等酶的活性卻隨著年齡的增長逐漸減弱[6]。我們的研究與這些結(jié)果一致，在老年小鼠體內(nèi)SOD1活性減弱，MDA含量增加。然而，給予6周的人參皂苷Rb1處理后，老年小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平有所減輕。

眾所周知， NO是一個廣泛存在于心血管系統(tǒng)內(nèi)的氣體信號分子，它在調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能方面具有重要作用[7]。NO產(chǎn)生主要受到eNOS的調(diào)控。與年輕人(20歲左右)相比，健康老年人(65歲以上)體內(nèi)eNOS的活性明顯減低[8]。在體外細胞衰老模型中，eNOS的活性降低，NO合成減少，而提高eNOS的活性可以減緩和減少內(nèi)皮細胞的衰老[9]。我們的研究結(jié)果提示老年小鼠主動脈組織eNOS mRNA表達減少，血清中NO含量降低，這些結(jié)果與既往報道一致。人參皂苷Rb1能夠增加eNOS mRNA表達，進而促進NO合成。

總之，本課題證實人參皂苷Rb1能夠改善老年小鼠體內(nèi)炎癥水平，減輕氧化應(yīng)激，增加NO合成，從而在一定程度上改善血管內(nèi)皮功能。

作者簡介：宋志明，32歲，男，博士，講師，主要從事衰老與動脈硬化關(guān)系的研究；錢孝賢，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為冠狀動脈疾病及動脈粥樣硬化。

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