唐莊艷，赫東蕓，盛敏佳，齊延新，王立巖*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長春130033；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所)

宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，目前宮頸細(xì)胞學(xué)檢查及HPV檢測可以早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌，顯著降低宮頸癌的發(fā)病率及死亡率。但是我國是世界人口第一的國家，其發(fā)病率和死亡率居高不下，僅2015年，在我國就有13萬多的新發(fā)病例和5萬多的死亡病例[1-3]而晚期宮頸癌及復(fù)發(fā)性宮頸癌患者的5年生存率僅為10-20%[4]。目前手術(shù)聯(lián)合經(jīng)典的化療方案常作為一線治療方案，但是用藥過程中，比如鉑類，會出現(xiàn)骨髓抑制等嚴(yán)重副反應(yīng)[5-7]。而耐藥性的出現(xiàn)會導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)一步惡化。因此，我們需要新的化療增敏劑治療宮頸癌。二甲雙胍是作為胰島素的增敏劑，是一種公認(rèn)的治療2型糖尿病的有效藥物，近年來，研究[7]表明，二甲雙胍與經(jīng)典的化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可以增強(qiáng)化療藥物的敏感性，從而有益于腫瘤的治療。比如二甲雙胍聯(lián)合紫杉醇和順鉑聯(lián)合用藥對卵巢癌[8]和食管癌[9]的抗增殖作用，比單獨(dú)應(yīng)用化療藥物要明顯增強(qiáng)，但在國內(nèi)二甲雙胍對宮頸癌體外抗腫瘤作用研究甚少，故本文在體外通過不同濃度的二甲雙胍培養(yǎng)宮頸癌Hela細(xì)胞，探討其細(xì)胞增殖及抗腫瘤機(jī)制，以及進(jìn)一步探討二甲雙胍聯(lián)合卡鉑是否對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制有協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株和主要試劑本實(shí)驗(yàn)采用的宮頸癌Hela細(xì)胞由中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所提供。胎牛血清和MTT購自上海拜力生物科技有限公司，二甲雙胍原藥粉劑、胰蛋白酶和碘化丙啶購自美國SIGMA公司，DMED培養(yǎng)基、雙抗購自美國GIBCO公司，二甲亞砜(DMSO)購自上海源葉生物科技有限公司，吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞復(fù)蘇和細(xì)胞培養(yǎng)從液氮中取出宮頸癌Hela細(xì)胞株凍存管，用常規(guī)的方法復(fù)蘇宮頸癌Hela細(xì)胞，將宮頸癌Hela細(xì)胞加入含有10%胎牛血清的DMEMF復(fù)合培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長速度適時(shí)更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)80-90%時(shí)，用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶對貼壁的宮頸癌Hela細(xì)胞進(jìn)行消化，按1∶2進(jìn)行傳代或者接種培養(yǎng)。取對數(shù)期生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3MTT法檢測二甲雙胍抑制宮頸癌細(xì)胞的體外增殖能力取處于對數(shù)生長期的宮頸癌細(xì)胞常規(guī)消化、離心、重懸，制成單細(xì)胞懸液，按照1×104個細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。24 h后，加入含不同濃度的二甲雙胍0、0.01、0.5、1、5、10、20 mmol/L的復(fù)合培養(yǎng)基100 μl，每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)置4個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μl，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4 h后，小心吸去上清并加入150 μl DMSO溶液，震蕩混勻使形成的結(jié)晶物完全溶解。將96孔培養(yǎng)板置入酶標(biāo)儀中，檢測各孔在490 nm波長處的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4熒光顯微鏡下計(jì)算細(xì)胞凋亡數(shù)按1.3中的方法處理細(xì)胞后，按照5×105個細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板，每孔1 ml，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。第2日加入不同濃度的二甲雙胍0.01、0.5、1、5、10、20 mmol/L的復(fù)合培養(yǎng)基1 ml，培養(yǎng)24 h后，常規(guī)消化收獲作用后的細(xì)胞；3 000 rpm室溫離心5 min，棄上清；用500 μl PBS重懸細(xì)胞，3 000 rpm室溫離心5 min，棄上清；重復(fù)3次上述洗滌過程；用100 μl PBS重懸細(xì)胞，加入4 μl AO和4 μl EB，震蕩混勻；在載玻片上滴加5 μl上述細(xì)胞懸液，加蓋玻片驅(qū)盡氣泡；在熒光顯微鏡下觀察200個細(xì)胞并計(jì)數(shù),分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞(VN),核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)；早期凋亡細(xì)胞(VA)核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或碎裂狀；晚期凋亡細(xì)胞(NVA),核染色質(zhì)著橘紅色呈固縮狀或碎裂狀；壞死細(xì)胞(NVN),核染色質(zhì)著橘紅色呈正常結(jié)構(gòu);每個實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次。凋亡比例=[(VA+NVA)/(AVN+VA+NVA+NVN)]×100%;破膜比例=[(NVA+NVN)/(AVN+VA+NVA+NVN)]×100%。

1.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期按1.4中的方法用不同濃度二甲雙胍(0、1、5 mmol/L)培養(yǎng)宮頸癌Hela細(xì)胞48 h后，常規(guī)消化收獲作用后的細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 rpm離心5 min，吸棄PBS后，用70%乙醇重懸細(xì)胞，固定過夜，第2日1 000 rpm離心5 min，吸棄固定液。PBS洗滌細(xì)胞1次，800 μl PBS 重懸細(xì)胞，加入100 μl碘化丙錠溶液和100 μl RNA 酶A，37℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測分析，分析各細(xì)胞周期的比例。

1.6MTT法檢測二甲雙胍聯(lián)合卡鉑對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖抑制率按1.3中的方法處理細(xì)胞后，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，加入含0 mmol/L、1.0 mmol/L及5.0 mmol/L 濃度的二甲雙胍和0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的卡鉑復(fù)合培養(yǎng)基各100 μl，每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)置4個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μl，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4 h后，吸去上清并加入150 μl DMSO溶液，震蕩混勻使形成的結(jié)晶物完全溶解。將96孔培養(yǎng)板置入酶標(biāo)儀中，檢測各孔在490 nm波長處的吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MTT法檢測不同濃度二甲雙胍對宮頸癌Hela細(xì)胞的抗腫瘤作用

隨著二甲雙胍濃度的增加及作用時(shí)間的延長，其對宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。作用24 h，當(dāng)二甲雙胍濃度>0.5 mmol/L，與1.0、5.0、10、20 mmol/L組宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，當(dāng)二甲雙胍濃度≤0.5 mmol/L，0.5 mmol/L與0.01 mmol/L組宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；作用48 h，當(dāng)二甲雙胍濃度>0.5 mmol/L，與1.0、5.0、10、20 mmol/L組宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，當(dāng)二甲雙胍濃度≤0.5 mmol/L，0.5 mmol/L與0.01 mmol/L組宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；作用72 h，隨著二甲雙胍濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率明顯上升，各組濃度組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)二甲雙胍濃度=0.01 mmol/L時(shí)，與作用24 h比較，作用72 h宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制率升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)二甲雙胍濃度>0.5 mmol/L，與24 h比較，隨著作用時(shí)間的延長，宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制率增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 MTT法檢測各組宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制情況

2.2二甲雙胍誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡

AO/EB染色可根據(jù)細(xì)胞著色及染色質(zhì)的形態(tài)區(qū)分出早期凋亡細(xì)胞(VA)、晚期凋亡細(xì)(NVA)、活細(xì)胞(VN)和壞死細(xì)胞(NVN)，隨著實(shí)驗(yàn)組二甲雙胍藥物濃度的增加,其凋亡率逐漸增加(如表1)，分別是4.0%、8.1%、11.0%、14.5%、30.0%、42.5%、55.0%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同濃度二甲雙胍對宮頸癌Hela細(xì)胞的凋亡影響

2.3二甲雙胍對宮頸癌Hela細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，二甲雙胍培養(yǎng)宮頸癌Hela細(xì)胞48小時(shí)后，隨著二甲雙胍的濃度增加，G0/G1期細(xì)胞比例上升，S期比例下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而G2/M期細(xì)胞比例無明顯差異(P>0.05)，表明二甲雙胍通過誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞G0/G1期阻滯而發(fā)揮增殖抑制作用的(圖2)。

圖2 二甲雙胍作用宮頸癌Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期

2.4MTT法檢測二甲雙胍聯(lián)合卡鉑對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制作用

宮頸癌Hela細(xì)胞經(jīng)不同濃度的二甲雙胍聯(lián)合卡鉑的復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，采用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果顯示：二甲雙胍聯(lián)合卡鉑用藥組的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于單獨(dú)卡鉑用藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在卡鉑濃度一定的情況下，隨著二甲雙胍濃度的增加，宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制率也明顯增加(P<0.05)，即5 mmol/L二甲雙胍聯(lián)合卡鉑用藥組的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于1 mmol/L二甲雙胍聯(lián)合卡鉑用藥組的細(xì)胞增殖抑制率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，如圖3)。

圖3 二甲雙胍聯(lián)合卡鉑對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制作用

3 討論

近年來，隨著宮頸癌患病人數(shù)的上升，目前宮頸癌治療過程中所面臨的巨大挑戰(zhàn)是化療耐藥和化療敏感性差，因此，需要我們尋找新的抗腫瘤藥物。而在過去的幾年中，二甲雙胍因其抗癌作用引起了更多的關(guān)注[10,11,12,13]。二甲雙胍因其療效確切，成本低，不良反應(yīng)少,已成為治療2型糖尿病的一線藥物[14,15]。最近的流行病學(xué)研究表明，接受二甲雙胍治療的糖尿病患者癌癥發(fā)病率和死亡率比未接受二甲雙胍治療明顯降低[16,17]。而且從體外和體內(nèi)研究中獲得的越來越多的證據(jù)表明二甲雙胍對許多類型的癌細(xì)胞有直接抗增殖作用，其IC50值約為50 mM[18]，其中包括口腔鱗狀細(xì)胞癌[19]、卵巢癌[20]、乳腺癌[21]、胃癌[22]等。本實(shí)驗(yàn)二甲雙胍對宮頸癌Hela細(xì)胞體外研究可以發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性，這說明二甲雙胍對宮頸癌具有抗腫瘤作用。

近兩年報(bào)道，PI3K/Akt/mTOR信號通路在癌細(xì)胞的生長，代謝，存活和運(yùn)動中發(fā)揮著核心作用，使其成為抗腫瘤藥物開發(fā)的有吸引力的靶點(diǎn)，抑制該途徑的信號傳導(dǎo)可減少細(xì)胞增殖和增加細(xì)胞死亡[23]。在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，二甲雙胍通過抑制mTOR信號途徑誘導(dǎo)G1期阻滯并引起細(xì)胞凋亡[24]。此外，二甲雙胍通過抑制PI3K / Akt / mTOR信號通路的表達(dá)，發(fā)揮對宮頸癌的保護(hù)作用，目前正在探索針對多種癌癥類型的作用機(jī)制：作為間接(即胰島素依賴性)和直接(即非胰島素依賴性)[25]。最近報(bào)道指出二甲雙胍作用宮頸癌細(xì)胞會導(dǎo)致p53蛋白表達(dá)增加，然后增強(qiáng)其下游靶基因Bax和p21的轉(zhuǎn)錄，而二甲雙胍誘導(dǎo)的p53上調(diào)是通過AMPK-mTOR信號通路[26]。例如，二甲雙胍和奈非那韋的聯(lián)合用作用于宮頸癌細(xì)胞，可以上調(diào)p53及其下游產(chǎn)物p21的表達(dá)，因此它們聯(lián)合用藥對p53和p21表達(dá)具有協(xié)同作用，起到對抑制宮頸癌細(xì)胞DNA復(fù)制和DNA損傷的作用，從而協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的作用[27]。

值得注意的是，Xiao等人發(fā)現(xiàn)二甲雙胍在宮頸癌細(xì)胞中的作用依賴于完整的LKB1[28]。這可能是臨床相關(guān)的，因?yàn)?0%的子宮頸癌有LKB1突變[29]。在宮頸癌的體外研究中發(fā)現(xiàn)的二甲雙胍作用的新分子機(jī)制包括靶向Wnt /β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)[30]，抑制FOXM1信號傳導(dǎo)[31]以及抑制血紅素加氧酶-1表達(dá)，它們能使宮頸癌細(xì)胞對紫杉醇敏感[32]。此外，最近的研究表明，具有線粒體DNA基因突變的癌細(xì)胞系對二甲雙胍的敏感性增加[33]。這樣使得二甲雙胍能夠?qū)哂芯€粒體DNA基因突變的宮頸癌細(xì)胞發(fā)揮更好的抗腫瘤作用。

綜上所述，一方面二甲雙胍能夠在體外能夠抑制宮頸癌Hela的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，另一方面二甲雙胍與卡鉑聯(lián)合應(yīng)用能夠增強(qiáng)卡鉑對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制作用,說明二甲雙胍能增加化療藥物的敏感性，這為以后二甲雙胍在臨床治療宮頸癌方面提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐價(jià)值。

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