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(1.上海市奉賢區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 奉賢 201400； 2.上海欣灝珍禽育種有限公司，上海 奉賢 201403)

0 引言

禽白血病(AL)是由反轉(zhuǎn)錄病毒科α反轉(zhuǎn)錄病毒屬的禽白血病病毒(ALV)引起的一種可垂直傳播的病毒性腫瘤性疾病。本病在世界各地廣泛存在，幾乎所有的商品雞群都存在感染的可能，其病毒(ALV)即可引起感染雞群免疫抑制、生產(chǎn)性能下降等亞臨床致病作用，又能誘發(fā)各種急性或慢性的不同紅細(xì)胞類型的腫瘤。臨床上AL主要以成年雞產(chǎn)生淋巴樣腫瘤和產(chǎn)蛋量降低為主要特征，對(duì)全世界家禽產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重影響。

我國(guó)也不例外，過(guò)去20多年，AL給我國(guó)各類雞群造成了嚴(yán)重危害，雖然經(jīng)過(guò)各級(jí)獸醫(yī)防疫部門及相關(guān)單位連續(xù)多年的檢疫凈化，目前蛋雞和白羽肉雞的AL得到了有效控制，但在黃羽肉雞和一些地方品種種雞中，ALV還在繼續(xù)流行與蔓延，并造成一定程序的危害。為此《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)病疫病防治規(guī)劃(2012-2020)》把AL列為必須凈化的疫病之一。

1 凈化背景

山雞，學(xué)名雉，俗稱野雞，其外觀華麗、肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，既是一種不可多得的美味佳肴和觀賞動(dòng)物，又是一種具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的珍禽品種。我國(guó)是全世界野生山雞資源最豐富的國(guó)家，在目前全世界已知的近30個(gè)山雞亞種中，我國(guó)就分布著其中的19個(gè)亞種，占所有亞種的近2/3；而且在我國(guó)廣袤的地域中，除海南和新疆羌塘地區(qū)外，遍布著山雞的蹤跡；我國(guó)又是世界上最早開(kāi)始狩獵和利用山雞的國(guó)家之一，考古發(fā)現(xiàn)，早在4千多年前的商周時(shí)期，我國(guó)就有狩獵和利用山雞的痕跡與記錄。但世界上最早開(kāi)展山雞規(guī)模人工養(yǎng)殖的國(guó)家是歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，但他們養(yǎng)殖山雞的目的主要是滿足人們狩獵的需求，特別是美國(guó)，像麥克法蘭等世界知名山雞育種公司，在廣泛收集世界各地山雞品種資源后，經(jīng)數(shù)十年的人工選育，成功培育了如七彩山雞等具有優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)特性的山雞品種。

我國(guó)在20世紀(jì)80年代初期由中國(guó)農(nóng)科院農(nóng)林特產(chǎn)研究所以資源交換形式引進(jìn)美國(guó)七彩山雞這一優(yōu)良品種。進(jìn)行試養(yǎng)并經(jīng)小范圍推廣后，由于七彩山雞所具有的突出生產(chǎn)性狀和優(yōu)秀經(jīng)濟(jì)價(jià)值，受到了市場(chǎng)熱捧，并由此掀起了國(guó)內(nèi)山雞人工養(yǎng)殖的熱潮，形成了目前規(guī)模達(dá)億羽的山雞人工養(yǎng)殖與銷售市場(chǎng)，產(chǎn)生了具大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

美國(guó)七彩山雞這一優(yōu)秀山雞品種在我國(guó)剛從美國(guó)引入進(jìn)行規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖時(shí)，其群體中的ALV檢測(cè)結(jié)果均為陰性，雞群健康狀況良好，生產(chǎn)性能較高。但由于山雞是ALV的易感群體，因此在經(jīng)過(guò)多個(gè)代次的擴(kuò)繁后，眾多群體中先后表現(xiàn)了AL的癥狀，嚴(yán)重影響了山雞養(yǎng)殖的生產(chǎn)水平和經(jīng)濟(jì)效益。因此，在原種山雞群中開(kāi)展AL凈化工作，并制定有效的綜合防控措施，對(duì)防控該病具有尤為迫切的意義。

上海欣灝珍禽育種有限公司目前保有7個(gè)品種的山雞遺傳資源，是國(guó)家特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物種質(zhì)遺傳資源共享平臺(tái)唯一的山雞保種場(chǎng)。為加快國(guó)內(nèi)禽白血病凈化進(jìn)程，推動(dòng)國(guó)內(nèi)山雞產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，該公司從2015年開(kāi)始，在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)和市區(qū)二級(jí)動(dòng)物防疫部門的大力支持下，組織開(kāi)展了原種山雞AL凈化技術(shù)的探索，并取得了明顯成效。

2 凈化方案

在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)及上海市和奉賢區(qū)等市區(qū)二級(jí)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心等單位的鼎力支持下，公司根據(jù)現(xiàn)保有的7個(gè)原種山雞核心種群開(kāi)產(chǎn)日齡大(200～220日齡)、產(chǎn)蛋周期短(6個(gè)月左右)的特點(diǎn)，結(jié)合家禽AL凈化技術(shù)要點(diǎn)，制定了原種山雞AL凈化程序(見(jiàn)表1)。其中注意事項(xiàng)如下。

表1 原種山雞AL凈化程序表

(1)原種山雞種蛋采用家系孵化，種雛按家系單籠育雛、育成。

(2)孵化、育雛、育成、產(chǎn)蛋種雞等階段的雞舍內(nèi)環(huán)境、免疫、人工授精、公母鑒別、標(biāo)識(shí)佩戴、轉(zhuǎn)群等各環(huán)節(jié)及各種飼養(yǎng)設(shè)施、器具和外環(huán)境等必須嚴(yán)格實(shí)行生物安全控制措施。

(3)各類疫苗必須嚴(yán)格實(shí)行外源病毒檢測(cè)，免疫時(shí)注意注射器針頭的消毒，操作人員應(yīng)按家系更換手套或洗手。

(4)實(shí)行全進(jìn)全出飼養(yǎng)方式。

3 檢測(cè)技術(shù)

3.1 采樣

(1)血液樣品。按照全群普查或抽樣檢測(cè)的不同比例，采用一次性采樣器對(duì)原種山雞核心群種山雞逐羽或隨機(jī)采取血液樣品1mL，編號(hào)待檢。

(2)胎糞樣品。嚴(yán)格按照生物安全控制要求，對(duì)采用家系孵化法孵化的原種山雞核心群0日齡種雛，按每個(gè)家系50%的采樣比例，將胎糞擠入盛有1mL PBS液的離心管中，編號(hào)待檢。

(3)初產(chǎn)蛋清樣品。種雞開(kāi)產(chǎn)后，選取每羽種母雞的頭3枚初產(chǎn)蛋，采用同一套一次性采樣器吸取每枚初產(chǎn)蛋清0.5～1 mL，并移入同一只離心管中，編號(hào)待檢。

(4)精液樣品。初選留種公山雞，每羽采取精液樣品不少于50 μL，移入離心管中，編號(hào)待檢。

(5)抗凝全血樣品。用一次性采樣器對(duì)P27抗原檢測(cè)陽(yáng)性或其他待檢種山雞采取2 mL全血，并快速將采樣器中全血沿管壁緩慢注入預(yù)置有肝素鈉的抗凝管中，編號(hào)后須在最短時(shí)間內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室作細(xì)胞培養(yǎng)和病毒分離。

3.2 檢測(cè)試劑盒

AL P27抗原檢測(cè)試劑盒：美國(guó)IDXXX公司生產(chǎn)。

3.3 檢測(cè)方法

3.3.1 AL抗原捕獲ELISA檢測(cè)法

(1)樣品處理。①蛋清樣品：無(wú)需稀釋，反復(fù)凍融3次以上，取上清液。②胎糞樣品：將加有1 mL培養(yǎng)液或樣品稀釋液的胎糞樣品反復(fù)凍融3次以上，取上清液。③血清樣品：無(wú)需稀釋，可直接使用。

(2)設(shè)置陰陽(yáng)對(duì)照：試劑盒回溫，取出包被板，記錄加樣位置，加入陰陽(yáng)對(duì)照各100 μL，復(fù)孔。

(3)加樣，孵育：其他孔加入100 μL樣品(蛋清或血清、胎糞上清液)，無(wú)需稀釋；蓋板，在18℃～26℃條件下孵育60±5 min。

(4)洗滌，拍干：去離子水洗滌(蛋清使用專用洗液)3～5次，拍干。

(5)加酶標(biāo)抗體，孵育：每孔加入100 μL酶標(biāo)抗體，蓋板孵育60±5 min。

(6)洗滌，拍干：去離子水洗滌(蛋清使用專用洗液)3～5次，拍干。

(7)加底物、孵育：每孔加入100 μLTMB底物液，蓋板孵育15±1 min。

(8)加終止液、酶標(biāo)儀讀數(shù)：加入終止液100 μL，酶標(biāo)儀讀數(shù)字。

(9)數(shù)據(jù)分析：使用xchek軟件分析結(jié)果。

3.3.2 病毒分離法

抗凝全血、精液用此方法檢測(cè)。

(1)材料準(zhǔn)備：DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、胰酶(0.25%)、雙抗(100×)、兩性霉素、PBS(0.01M)、DF1細(xì)胞、肝素鈉采血管、細(xì)胞培養(yǎng)皿(10CM)、24孔細(xì)胞版、吸管、一次性移液管(10 mL)等。

(2)試劑配置：兩性霉素試劑、精液稀釋液試劑、細(xì)胞生長(zhǎng)液、細(xì)胞維持液等配置，DF1細(xì)胞復(fù)蘇與傳代，24孔細(xì)胞板制備。

(3)樣品處理。①血漿：用肝素鈉抗凝管靜脈采集1 mL血液，顛倒混勻3次，2 000 rpm離心2 min備用。血漿樣品稀釋比例為6倍稀釋。②公雞精液：無(wú)菌采集公雞精液50 μL以上，取40 μL加入到160 μL的精液稀釋液中，振蕩混勻，3000 rpm離心2 min備用。精液樣品稀釋比例為28～56倍，正常取30倍稀釋。

(4)病毒分離。①將處理好的樣品100 μL加入到24孔細(xì)胞板中，置于培養(yǎng)箱中吸附2～4 h。②完成后傾去上清，在每個(gè)孔中加入PBS 0.5 mL，將細(xì)胞清洗一遍。③棄去洗液，加入維持液0.5 mL，將24孔細(xì)胞板維持生長(zhǎng)至第9天進(jìn)行病毒鑒定。

(5)病毒鑒定。P27抗原測(cè)定；間接免疫熒光；測(cè)序；斑點(diǎn)雜交。

3.3.3 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)注意事項(xiàng)

(1)把所有的生物材料當(dāng)作潛在的傳染源來(lái)處理。

(2)在處理樣品時(shí)須佩戴防護(hù)手套、穿防護(hù)服、戴防護(hù)眼鏡及防護(hù)面罩。

4 凈化結(jié)果

按照預(yù)定的凈化方案，相關(guān)單位通力合作，對(duì)公司存欄原種山雞第四、第五、第六等三個(gè)世代核心種群進(jìn)行了系統(tǒng)的P27抗原檢測(cè)，并采用嚴(yán)格的凈化處置措施，對(duì)胎糞檢測(cè)陽(yáng)性者淘汰整個(gè)家系(含種母雞和所有種雛)；對(duì)血液、蛋清等P27抗原檢測(cè)陽(yáng)性個(gè)體，采取抗凝全血采用病毒分離法復(fù)檢；對(duì)精液、抗凝全血等采用病毒分離法檢測(cè)陽(yáng)性樣品直接淘汰陽(yáng)性個(gè)體。相關(guān)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 原種山雞AL P27抗原檢測(cè)結(jié)果匯總表

5 結(jié)語(yǔ)

(1)表2結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)連續(xù)三個(gè)世代的凈化檢測(cè)和規(guī)范處置，原種山雞核心種群AL各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到了國(guó)家AL凈化創(chuàng)建場(chǎng)的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。

(2)在總結(jié)國(guó)內(nèi)其他家禽養(yǎng)殖企業(yè)成功開(kāi)展禽白血病凈化經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)原種山雞生理特性和飼養(yǎng)特點(diǎn)，研究制訂了采用抗原捕獲ELISA檢測(cè)P27抗原、并對(duì)陽(yáng)性個(gè)體進(jìn)行直接淘汰或采用細(xì)胞培養(yǎng)分離AL的凈化技術(shù)路線，為其他家禽養(yǎng)殖企業(yè)AL的凈化探索了一條可行之路。

(3)委托市、區(qū)等動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心對(duì)各類樣品進(jìn)行檢測(cè)，可充分發(fā)揮各方專業(yè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)的作用，減輕凈化企業(yè)壓力，加快了原種山雞AL的凈化進(jìn)程。

崔治中.禽白血病[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2015.

[2] 崔治中.我國(guó)雞群白血病流行病學(xué)和防控技術(shù)研究現(xiàn)狀[C].中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十六次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集,2012.

[3] 段倫濤,趙鵬,董宣,等.對(duì)雞群A/B亞群禽白血病病毒抗體ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率的可靠性評(píng)估[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2014(6):197-203.