朱富華 ,王生婷,成 秋,王曉萌,顏靖棠

1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710003),2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)兒科研究生(咸陽(yáng) 712046),3.陜西省寶雞市中心醫(yī)院兒科(寶雞 721000)

兒童哮喘是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，它嚴(yán)重地影響著患病兒童的生活質(zhì)量和正常學(xué)習(xí)，近年來(lái)其發(fā)病率有不斷上升之趨勢(shì)，應(yīng)引起我們的足夠重視[1]。本文探索敏咳湯對(duì)支氣管哮喘豚鼠中炎性細(xì)胞(ECP)、炎性介質(zhì)(NO)和細(xì)胞因子的影響，報(bào)告如下。

材料和方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:實(shí)驗(yàn)選擇清潔級(jí)封閉群幼齡雄性豚鼠50只，購(gòu)自西安市交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：(2015)第8號(hào)，體重(200±20)g，月齡1～2月。室溫在 20～25℃之間，相對(duì)濕度50%的環(huán)境中飼養(yǎng)兩周后，將豚鼠隨機(jī)分為5組，即哮喘模型組、中藥大劑量組、中藥小劑量組、地塞米松片對(duì)照組、正常對(duì)照組。每組各10只。用不銹鋼的鼠籠分籠飼養(yǎng)，飲用純凈水，自然采光，以常規(guī)飼料喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥品:①卵白蛋白(OVA):上海世儀生物科技有限公司生產(chǎn)(產(chǎn)品貨號(hào)：77121，規(guī)格：10g/瓶);②生理鹽水：杭州美芙醫(yī)藥科技有限公司(規(guī)格：250ml/瓶)批號(hào)：120409；③地塞米松片：廣州嘉禾制藥有限公司(規(guī)格：0.75mg/片)，批號(hào)：1102093；④敏咳湯：蜜麻黃5g，牡蠣20g， 陳皮、蟬蛻各6g，射干、茯苓、桔梗、葶藶子、蒲公英、桑白皮、連翹、當(dāng)歸、前胡各10g。(本方每劑藥131g相當(dāng)于131g中藥飲片)由廣東三九制藥廠有限公司提供。加熱濃縮成1.27g/ml之濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)用試劑：IL-3試劑盒、IL-2試劑盒、IL-4試劑盒和IL-13試劑盒以及嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(ECP)試劑盒，美國(guó)Microelisa Stripplate 公司生產(chǎn)，批號(hào)：20150502B。豚鼠一氧化氮(NO)試劑盒48T(產(chǎn)品批號(hào)YM-S2499)由上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器：電子稱；醫(yī)用超聲霧化吸入器(壓縮式霧化器，上海鹿得醫(yī)療器械貿(mào)易有限公司生產(chǎn))；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Ken-dro公司產(chǎn)品)；恒溫箱；自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品)；其他如止血鉗，手術(shù)刀，注射器，灌胃針，燒杯，微量移液器，冰箱等(陜西省中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供)。

2 方 法

2.1 造模方法：致敏階段分別對(duì)哮喘模型組、中藥大小劑量組及地塞米松組豚鼠采用腹腔注射10%卵白蛋白1ml，進(jìn)行致敏。[2]正常組豚鼠以生理鹽水1ml腹腔注射作為對(duì)照觀察。

激發(fā)階段：自注射第14天起，對(duì)哮喘模型組、中藥大劑量組、中藥小劑量組及地塞米松對(duì)照組每天上午將豚鼠置于4L霧缸內(nèi)，用1%卵白蛋白溶液超聲霧化20至30s,關(guān)閉機(jī)器后取出豚鼠觀察癥狀，激發(fā)至哮喘發(fā)作(即出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、嗆咳，身體顫抖、點(diǎn)頭及伏地現(xiàn)象)，連續(xù)1周，以建立哮喘模型。空白組以生理鹽水代替霧化。

2.2 給藥方法和途徑:造模成功后(實(shí)驗(yàn)第28天)，清晨進(jìn)行最后一次霧化，霧化90min后開(kāi)始給藥，正常對(duì)照組和哮喘模型組每日2次均用2.5ml生理鹽水灌胃。其余兩組敏咳湯組(按大劑量組：小劑量組=4∶1，敏咳湯大劑量組組加熱濃縮成2.54 g/ml、小劑量組為0.635 g/ml的濃度計(jì)算)、地塞米松片對(duì)照組(地塞米松片對(duì)照組3.5mg/kg·d即給地塞米松片混懸液 0.7 mg/d)每次2.5 ml，每日2次，連續(xù)給藥7 d。

2.3 標(biāo)本采集:實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)束后，稱豚鼠體重，用乙醚麻醉成功后，將豚鼠固定，常規(guī)消毒皮膚，沿頸正中線用剪刀剪開(kāi)皮膚，鈍性分離，暴露心臟，進(jìn)行心尖部抽取全血3 ml，然后放入離心機(jī)中，以3000 r/min，離心10 min，用吸管抽吸上層血清。

豚鼠支氣管肺泡灌洗液：將豚鼠于實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)束后稱重，經(jīng)腹腔注射烏拉坦麻醉成功后固定，予以皮膚常規(guī)消毒，沿頸正中線剪開(kāi)皮膚,打開(kāi)胸腔后分離左、右支氣管，并結(jié)扎右支氣管，取5號(hào)頭皮針剪去針頭,將其插入氣管內(nèi)0.5～1.0cm，同時(shí)結(jié)扎固定，連接注射器，用0.9%氯化鈉注射液反復(fù)灌洗3次(10 ml/次),回吸率保持在80%左右,用離心管收集肺泡灌洗液(BALF),然后置于離心機(jī)中，以1000 r/min 離心10min后收集上清液。

2.4 指標(biāo)檢測(cè):支氣管哮喘豚鼠模型血清中，白介素3(IL-3)、白介素2(IL-2)、白介素13(IL-13)和一氧化氮(NO)以及嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(ECP)的含量和支氣管肺泡灌洗液中的白介素4(IL-4)含量均采用ELISA酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定。

結(jié) 果

1 一般狀況 在實(shí)驗(yàn)激發(fā)前后正常對(duì)照組豚鼠的皮毛柔順、光滑，呼吸平穩(wěn)活躍，進(jìn)食進(jìn)水量無(wú)明顯變化。哮喘激發(fā)后除正常對(duì)照組外，其余四組豚鼠皮毛沒(méi)有激發(fā)前光滑、柔順，進(jìn)食進(jìn)水量較前減少。哮喘激發(fā)時(shí),各組均出現(xiàn)呼吸急促，噴嚏或嗆咳，張口呼吸，節(jié)律不齊，身體抖動(dòng)，點(diǎn)頭、伏地，腹式呼吸較明顯，甚出現(xiàn)口鼻及尾尖輕度紫紺，躁動(dòng)不安，少部分出現(xiàn)休克、跌倒等現(xiàn)象；激發(fā)后活動(dòng)明顯減少或俯臥不動(dòng)，狀態(tài)發(fā)生改變。

2 敏咳湯對(duì)哮喘癥狀持續(xù)時(shí)間的影響 見(jiàn)表1。敏咳湯大、小劑量組與哮喘模型組相比(P<0.05)，說(shuō)明敏咳湯能縮短哮喘的發(fā)作時(shí)間；敏咳湯大劑量組與地塞米松對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)，說(shuō)明敏咳湯大劑量組與地塞米松組相比療效相當(dāng)；敏咳湯大劑量組與敏咳湯小劑量組相比有差異(P<0.05)，說(shuō)明大劑量組療效優(yōu)于小劑量組。

3 敏咳湯對(duì)哮喘豚鼠血清中IL-2、IL-3、IL-13含量的影響 見(jiàn)表2。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，哮喘模型組豚鼠血清中IL-2的含量水平比正常對(duì)照組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。敏咳湯小劑量組比哮喘模型組豚鼠血清中IL-2水平升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。敏咳湯大劑量組和地塞米松組均比哮喘模型組豚鼠血清中IL-2水平升高,而且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。敏咳湯大劑量組和敏咳湯小劑量組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。敏咳湯大劑量組和地塞米松組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

敏咳湯對(duì)哮喘豚鼠血清中IL-3含量的影響，模型組、用藥組與正常對(duì)照組相比較有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。用藥組與哮喘模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組與地塞米松、敏咳湯大劑量組相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

敏咳湯對(duì)哮喘豚鼠血清中IL-13含量的影響，通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，哮喘模型組豚鼠血清中IL-13的含量水平比正常對(duì)照組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。敏咳湯大劑量組、敏咳湯小劑量組比哮喘模型組豚鼠血清中IL-13水平降低,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。敏咳湯大劑量組和敏咳湯小劑量組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；敏咳湯大劑量組和地塞米松組相比,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 哮喘豚鼠血清中IL-2、IL-3、IL-13的變化(pg/L)

4 敏咳湯對(duì)哮喘支氣管中肺泡灌洗液(BALF)IL-4含量的影響 見(jiàn)表3。哮喘模型組IL-4含量明顯提高，哮喘模型組與正常對(duì)照組比較,差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。地塞米松對(duì)照組、敏咳湯小劑量組、敏咳湯大劑量組與哮喘模型組比較, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。地塞米松對(duì)照組與敏咳湯大劑量組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。敏咳湯大、小劑量組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 哮喘豚鼠BALF中IL-4的變化(ng/L)

5 敏咳湯對(duì)哮喘豚鼠血清中ECP、NO含量的影響 見(jiàn)表4。實(shí)驗(yàn)中哮喘豚鼠血清中ECP的變化，哮喘模型組、地塞米松對(duì)照組、敏咳湯大劑量組、敏咳湯小劑量組與正常對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。地塞米松對(duì)照組、敏咳湯大劑量組、敏咳湯小劑量組與哮喘模型組比較(P<0.05)。敏咳湯小劑量組與地塞米松相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。敏咳湯大劑量組與敏咳湯小劑量組相比較(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)中哮喘豚鼠血清中NO的變化，模型組與正常對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)。地塞米松對(duì)照組、敏咳湯大劑量組、敏咳湯小劑量組與哮喘模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)。地塞米松對(duì)照組與敏咳湯大劑量組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。敏咳湯大、小劑量組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 哮喘豚鼠血清中ECP、NO的變化

討 論

支氣管哮喘(Bronchial asthma，簡(jiǎn)稱支哮)是由多種炎癥細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞)、細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾患。這種慢性炎癥導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的增加，通常出現(xiàn)廣泛多變的可逆性氣流受阻，并引起反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，常在夜間發(fā)作、加劇，多數(shù)患者可自行緩解或經(jīng)治療緩解[3]。關(guān)于哮喘發(fā)病機(jī)制，目前有：變態(tài)反應(yīng)、氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、神經(jīng)機(jī)制之說(shuō)[4]。

敏咳湯是我院名老中醫(yī)龔老師的經(jīng)驗(yàn)方。龔老根據(jù)張仲景《金匱要略》曰：“咳而上氣，喉中水雞聲，射干麻黃湯主之”。[5]此方是原為治療寒證哮喘。龔老在射干麻黃湯方的啟發(fā)下，別出心裁，根據(jù)兒童哮喘的病理特點(diǎn)化裁而來(lái)的，方中炙麻黃辛溫宣肺平喘，外散風(fēng)寒；連翹辛涼清熱解毒，透邪外出，以炙麻黃辛溫與連翹辛涼合用，體現(xiàn)寒溫并治，針對(duì)邪易化熱，共為君藥。陳皮、茯苓、前胡、桔梗化痰止咳，以杜絕生痰之源；葶藶子，桑白皮，泄肺平喘，兩者合用擅泄肺中痰水，以除“伏痰”之根，共達(dá)化痰止咳平喘之功，共為臣藥。射干利咽祛痰散結(jié)；蒲公英既可清解火熱毒邪，防止外邪入里化熱化火，又可泄降滯氣，以降肺之痰氣壅滯；蟬衣息風(fēng)抗敏，解痙平喘，緩解氣管攣急，縮短病程，提高療效；牡蠣重鎮(zhèn)平喘，既能重鎮(zhèn)潛陽(yáng)，又可治煩躁失眠，并能拮抗長(zhǎng)期使用中藥麻黃、西藥氨茶堿和β受體激動(dòng)劑所引起的心臟毒性(心動(dòng)過(guò)速、心律失常)等副作用；當(dāng)歸既能活血化瘀，改善肺部的血液循環(huán)；又可潤(rùn)腸通便,肺與大腸相表里,腑氣通則肺氣利，共為佐藥。甘草調(diào)和主藥，為使藥。全方配伍得當(dāng)，寒溫并用，宣降協(xié)調(diào)，使風(fēng)邪得解，伏痰以除，血活瘀化，肺氣通暢，咳止痙解，哮癥自平[6]。組方思想也反應(yīng)了中醫(yī)對(duì)哮喘治療的不斷延伸，從痰從瘀[7]，從風(fēng)論治[8]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：哮喘激發(fā)后除正常對(duì)照組外，其余四組豚鼠皮毛沒(méi)有激發(fā)前光滑、柔順，進(jìn)食進(jìn)水量較前減少。哮喘激發(fā)時(shí),各組均出現(xiàn)呼吸急促，噴嚏或嗆咳，張口呼吸，節(jié)律不齊，身體抖動(dòng)，點(diǎn)頭、伏地，腹式呼吸較明顯，甚出現(xiàn)口鼻及尾尖輕度紫紺，躁動(dòng)不安，少部分出現(xiàn)休克、跌倒等現(xiàn)象；激發(fā)后活動(dòng)明顯減少或俯臥不動(dòng)，狀態(tài)發(fā)生改變。模型建立成功。豚鼠血清中NO、ECP、IL-3、IL-13的含量和支氣管肺泡灌洗液中IL-4的含量降低；血清IL-2的含量升高。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果敏咳湯湯有降低血清中NO、ECP、IL-3、IL-13的含量、降低支氣管肺泡灌洗液中IL-4的含量；提高血清IL-2、的含量。IL-3增進(jìn)嗜酸性細(xì)胞分化、成熟、內(nèi)皮細(xì)胞黏附、激活和脫顆粒，增進(jìn)肥大細(xì)胞分化、成熟。IL-4和IL-13促進(jìn)B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)IgE生成，促進(jìn)肥大細(xì)胞成熟、分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子生成。一氧化氮(NO)高濃度時(shí)具有上皮細(xì)胞毒性作用，可以加重氣道的炎性反應(yīng)。嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(ECP)大量研究證實(shí)嗜酸粒細(xì)胞及其釋放的細(xì)胞介質(zhì)。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，可知敏咳湯從哮喘發(fā)病多個(gè)環(huán)節(jié)阻滯哮喘的發(fā)生。①?gòu)谋?可知敏咳湯可縮短哮喘發(fā)生癥狀的持續(xù)時(shí)間。②哮喘患兒常常表現(xiàn)為T(mén)h1/Th2細(xì)胞因子免疫應(yīng)答失衡，Th1分泌受到抑制，導(dǎo)致IFN-γ、IL-2等水平下降[9]。敏咳湯可升高IL-2的含量，恢復(fù)Th1/Th2類細(xì)胞因子免疫應(yīng)答失衡，從而減少哮喘的發(fā)生。③敏咳湯可降低IL4和IL-13的含量，減少LgE合成的細(xì)胞因子，阻滯哮喘的發(fā)生。④IL-3在支氣管哮喘發(fā)病中，一則阻滯嗜堿、肥大細(xì)胞增值和活性，二則減少嗜酸細(xì)胞活性[4]。敏咳湯可減少IL-3的含量，較少哮喘的發(fā)作。⑤敏咳湯可降低NO的含量。減少氣道的炎癥。這種機(jī)制在于NO能阻斷嗜酸性粒細(xì)胞凋亡，從而間接加重或促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)。同時(shí)作為信使的NO可抑制TH1細(xì)胞，促進(jìn)TH2細(xì)胞的激活,致使激活炎性細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-4生成過(guò)多，加重氣道炎癥反應(yīng)，有研究表明,哮喘病人呼出氣中NO含量較正常人高2～3倍，提示哮喘的呼吸道炎癥與NO的大量生成有關(guān)。臨床通過(guò)測(cè)定其含量，作為診斷和檢測(cè)哮喘的一種指標(biāo)[10]。⑥降低ECP可以減少哮喘季節(jié)性的發(fā)作，如花粉的誘發(fā),減少氣道的炎癥反應(yīng)。

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