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化州柚SCoT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化及分類鑒別研究

2018-06-29 05:06王浩涵楊潔清歐陽小健孫楊楊黃海波
江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年11期
關(guān)鍵詞:柚類化州沙田柚

王浩涵, 楊潔清, 歐陽小健, 孫楊楊, 黃海波

(廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東廣州 510006)

化橘紅藥用歷史悠久,療效顯著,具有理氣寬中、燥濕化痰等功效,用于治療嘔惡痞悶、咳嗽痰多等病癥,為廣東十大南藥之一,主要產(chǎn)于廣東化州?;偌t基原植物為蕓香科柑橘屬化州柚(CitrusmaximaTomentosa)或柚(CitrusmaximaL. Osbeck)及其栽培變種[1],前者別稱毛橘紅,后者別稱光橘紅。在目前的研究中普遍認(rèn)為毛橘紅的質(zhì)量優(yōu)于光橘紅[2-3],而光橘紅產(chǎn)量大,成本低,品種來源廣泛,容易與毛橘紅混淆,已經(jīng)對(duì)毛橘紅市場造成了沖擊。目前市場中的毛橘紅基原也較復(fù)雜,僅文獻(xiàn)中提及的就有鳳尾、假西洋、密葉、黃龍、金錢臍等十余個(gè)品種,并且在植物形態(tài)及質(zhì)量上均有差異[4-5]。大量柚類及化州柚品種都可能被用作化橘紅藥材,而其在苗期難以區(qū)分,因此,開發(fā)一種可靠有效的方法有助于準(zhǔn)確鑒別化橘紅基原植物及其種苗。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(start codon targeted polymorphism,簡稱SCoT)是Collard等于2009年在水稻上提出的一種新型分子標(biāo)記[6]。該標(biāo)記是針對(duì)ATG起始密碼子側(cè)翼的保守序列設(shè)計(jì)的單引物,其擴(kuò)增的片段多偏向候選功能基因,目前在化州柚的種質(zhì)資源研究中尚未見報(bào)道。本研究通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)構(gòu)建SCoT-PCR的最佳反應(yīng)體系,篩選引物并優(yōu)化其最佳退火溫度,對(duì)不同品種化州柚及柚類進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析,構(gòu)建其非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,簡稱UPGMA)聚類樹,以期為化橘紅基原植物的鑒別分類提供一種有效可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料均采集自植株頂芽往下第3~5張幼嫩葉片,用吸水紙吸干表面水分后用塑封袋封口,2 d內(nèi)放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。本試?yàn)于2017年4—11月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新中藥研發(fā)公共服務(wù)平臺(tái)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,樣品由廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室主任黃海波副教授鑒定,憑證標(biāo)本保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué),樣品詳細(xì)信息見表1。

1.2 試驗(yàn)儀器和試劑

OSE-Y20電動(dòng)研磨儀,購自天根生化科技(北京)有限公司;Centrifuge 5424R冷凍離心機(jī),購自Eppendorf公司;NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計(jì)、Arktik PCR儀,購自Thermo公司;Power Pac Basic電泳儀,購自Bio-Rad公司;Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng),購自上海天能科技有限公司。

dNTPs、Mg2+、10×ExTaqBuffer(無Mg2+)、ExTaqDNA聚合酶、瓊脂糖、DL5000 maker、Goldview Ⅰ,購自TaKaRa公司;β-巰基乙醇、Tris平衡酚、Tris-乙酸電泳緩沖液(50×TAE),購自廣州瑞舒生物科技有限公司;DP305植物基因組DNA提取試劑盒、6×上樣緩沖液(loading buffer),購自天根生化科技有限公司;其余均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?6條SCoT引物序列均參照文獻(xiàn)[6],由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3 DNA提取

稱取0.1 g樣品置于經(jīng)預(yù)冷的1.5 mL離心管中,加入液氮使葉片充分冷凍,用研磨儀迅速將其研成粉末。試驗(yàn)步驟參照天根DP305植物基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行,為提取到濃度更好的DNA,增加水浴時(shí)間至1 h。

1.4 DNA質(zhì)量檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA降解情況。取1 μL DNA,在超微量分光光度計(jì)下檢測吸光度以測定其濃度及純度,并將所有樣品稀釋至50 ng/μL。

表1 化州柚及其近緣品種樣品信息

注:*表示未查找到拉丁名。

1.5 SCoT-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

引物選擇S32,樣品采用A6化州橘紅研究所的化州柚(鳳尾),對(duì)PCR體系的5個(gè)主要因素Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和DNA模板的用量進(jìn)行優(yōu)化,每個(gè)影響因素設(shè)置5個(gè)水平(表2)。正交試驗(yàn)共25組,每組重復(fù)3次,反應(yīng)采用20 μL體系,每個(gè)體系添加1×PCR buffer,余量以ddH2O補(bǔ)足。

1.6 PCR擴(kuò)增及電泳檢測

PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min,49 ℃ 退火1 min,72 ℃延伸2 min,36個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL loading buffer混勻,在GoldView 染色后的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳, 緩沖液為1×TAE,電壓為120 V,時(shí)間為1 h,最后于凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。

表2 L25(56)正交因素水平設(shè)計(jì)

1.7 引物篩選及退火溫度優(yōu)化

采用優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系對(duì)6個(gè)樣品(A4吳川正毛、A8清湖假西洋、A9大嶺假西洋、A11廣中醫(yī)正毛、A20紅玉香柚、A25檸檬)篩選所有引物,選擇條帶清晰、間距明顯且多態(tài)性好的引物進(jìn)行退火溫度篩選。在ArkTik PCR儀上設(shè)定溫度范圍46~55 ℃,在自動(dòng)生成的12個(gè)梯度溫度中選擇9個(gè)溫度(46.0、47.4、48.4、49.6、51.1、52.5、53.5、54.3、55.0 ℃)對(duì)條帶清晰、多態(tài)性好的引物進(jìn)行優(yōu)化。

1.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)

1.8.1 反應(yīng)體系正交分析 對(duì)正交設(shè)計(jì)的凝膠圖像采用姜小鳳等的方法[7-8]綜合打分。按條帶的清晰度、亮度及數(shù)量從低到高賦值1~25分,對(duì)3次重復(fù)進(jìn)行3次獨(dú)立計(jì)分。依據(jù)計(jì)分結(jié)果進(jìn)行直觀分析,假設(shè)各因素之間不存在交互作用,計(jì)算各因素在各水平下的平均分值,以反映因素的各個(gè)水平對(duì)體系的影響程度。

1.8.2 UPGMA聚類分析 對(duì)得到的SCoT電泳條帶圖譜應(yīng)用Tanon-2500系統(tǒng)GIS軟件進(jìn)行分析,對(duì)圖譜中同一遷移率位置清晰出現(xiàn)的條帶賦值“1”,無條帶的賦值“0”,條帶模糊或不清晰的不予統(tǒng)計(jì),構(gòu)建“0/1”表。對(duì)所得的“0/1”表應(yīng)用NTSYS-pc2.10e軟件計(jì)算其遺傳距離,對(duì)計(jì)算結(jié)果采用UPGMA算法聚類,對(duì)聚類結(jié)果構(gòu)建SAHN樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

2.1.1 電泳檢測結(jié)果 由圖1可知,所有樣品均呈現(xiàn)出1條清晰的條帶,無拖尾現(xiàn)象,且無蛋白污染,表明提取到的DNA質(zhì)量較好,適用于后續(xù)研究。

2.1.2 純度與濃度檢測 提取的所有樣品的DNA濃度范圍在70~187 ng/μL,D260 nm/D280 nm值均在1.8左右,說明試劑盒法能在柚類植物中提取到質(zhì)量優(yōu)、純度高的DNA,符合試驗(yàn)要求。

2.2 PCR正交設(shè)計(jì)結(jié)果

對(duì)凝膠圖譜(圖2)按條帶清晰程度及數(shù)量打分,3次獨(dú)立打分的平均分依次為4.00、5.33、3.67、0、0、7.67、8.67、4.67、6.37、2.00、7.00、10.00、16.33、16.67、11.67、12.00、9.00、13.67、14.67、10.33、2.67、9.67、19.33、25.00、22.33分。依據(jù)直觀分析的結(jié)果(表3),按極差R值的大小各因素對(duì)反應(yīng)體系的影響程度依次為Mg2+濃度>dNTPs濃度>引物濃度>Taq酶用量>DNA用量,其中Mg2+濃度對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響最大,而DNA濃度則對(duì)反應(yīng)結(jié)果影響最小。根據(jù)均值K,各因素各水平下均值最高的為最優(yōu)用量,則得到的最優(yōu)反應(yīng)體系為3 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、0.75 UTaq酶、0.4 μmol/L引物、50 ng DNA。

2.3 引物篩選及退火溫度優(yōu)化

依據(jù)優(yōu)化的最佳反應(yīng)體系,以差距較大的6個(gè)樣品(A4吳川正毛、A8清湖假西洋、A9大嶺假西洋、A11廣中醫(yī)正毛、A20紅玉香柚、A25檸檬)DNA為模板,對(duì)36條引物進(jìn)行篩選,得到6條(S2、S14、S15、S20、S30、S32)條帶清晰、多態(tài)性高的引物,部分引物篩選結(jié)果見圖3。對(duì)篩選到的6條引物逐一進(jìn)行退火溫度篩選,在設(shè)置的9個(gè)溫度條件下選擇條帶清晰且多態(tài)性高的作為最適退火溫度。部分退火溫度篩選結(jié)果見圖4,最終得到各引物的最適退火溫度(表4)。

2.4 SCoT標(biāo)記的多態(tài)性分析

利用篩選出的6條引物以最優(yōu)退火溫度條件對(duì)25份化州柚及近緣種樣品(A25檸檬樣品不計(jì)入多態(tài)性結(jié)果)進(jìn)行擴(kuò)增,共擴(kuò)增出94條條帶,其中69條具有多態(tài)性(表4)。篩選出的每條SCoT引物平均可擴(kuò)增出條帶15.67條,多態(tài)性比例55.56%~85.00%,平均多態(tài)性73.4%,表明SCoT標(biāo)記在化州柚種質(zhì)中擴(kuò)增效率高, 化州柚及其近緣種遺傳多態(tài)性較豐富(圖5)。

表3 正交設(shè)計(jì)直觀分析結(jié)果

2.5 SCoT標(biāo)記的聚類分析

將所有引物在25份樣品得到的結(jié)果轉(zhuǎn)化為“0/1”表,利用NTSYS計(jì)算其相似系數(shù),25份試材的遺傳相似系數(shù)分布在0.600~0.992之間,以黑、灰、白3種顏色分別代表最低值、中間值、最高值,構(gòu)建遺傳相似系數(shù)熱圖(圖6)。對(duì)圖6直觀分析可知,圖中數(shù)據(jù)顏色大多數(shù)較淺,表明25份試材之間相似度較高。

用UPGMA算法構(gòu)建樹狀圖(圖7),在相似系數(shù)為0.65左右時(shí)可將檸檬(A25)與柚類樣品區(qū)分,在相似系數(shù)為0.79左右時(shí)可將柚類樣品分為2個(gè)類群。所有的化州柚(A1~A11)及1份沙田柚(A12)樣品為第1個(gè)類群,在第1個(gè)類群中不同的化州柚品種沒有各自聚為一支,且與1份沙田柚(A12)同聚為一支;第2個(gè)類群中先是將沙田柚(A13、A14)聚為一支,另一分支中云南瑞麗的本地實(shí)生種紅玉香柚(A20)獨(dú)自聚為一支,不同品種和采集地的5份琯溪蜜柚(A15~A19)先聚為一支后與云南芒市的本地柚聚為一支,瑞麗的水晶柚(A23)和優(yōu)選品種大富五號(hào)(A22)聚為一支后與光青(A24)聚為一支。

3 結(jié)論與討論

本研究通過正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了SCoT-PCR反應(yīng)體系,從36條引物中篩選出6條并優(yōu)化了其退火溫度,最終擴(kuò)增得到了55.56%~85.00%的多態(tài)比例,構(gòu)建了適用于化州柚及其近緣種的SCoT分子標(biāo)記體系。通過UPGMA聚類分析發(fā)現(xiàn),化州柚能夠較好地與琯溪蜜柚、水晶柚等其他柚類品種區(qū)分開,但可能由于嫁接因素,沙田柚顯示出與化州柚較近的親緣關(guān)系。不同品種的化州柚沒有很好地聚在一起,也表現(xiàn)出一定的差異,且這種差異不是由產(chǎn)地因素引起的,可能存在更多的化州柚品種。鳳尾與密葉親緣關(guān)系較近而與假西洋較遠(yuǎn),正毛則在鳳尾和假西洋中均有分布, 提示正毛和副毛的區(qū)分可能是因商品等級(jí)而非品種差異。

目前在化橘紅種質(zhì)資源的研究中,已有多種分子標(biāo)記顯示出較低的多態(tài)性,且不同品種的化州柚相似度高、分類困難。SCoT分子標(biāo)記較好地揭示了25份化州柚及其近緣種的遺傳差異,并且擴(kuò)增得到的片段多為候選功能基因,能夠進(jìn)行更進(jìn)一步的研究,是適用于化州柚種質(zhì)資源分析的有效手段。

SCoT分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)PCR反應(yīng)體系的要求較高[9],在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),體系內(nèi)各因素濃度微小的變動(dòng)都有可能影響試驗(yàn)結(jié)果,因此對(duì)SCoT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化十分必要。在化州柚種質(zhì)資源的SCoT標(biāo)記研究中,本試驗(yàn)取得了55.56%~85.00%的多態(tài)性比例。而鄧鋒等利用ISSR標(biāo)記在化橘紅種質(zhì)資源研究中則獲得的多態(tài)性不夠明顯[10],張秋鎮(zhèn)等利用AFLP標(biāo)記也僅取得了5.21%的多態(tài)性[11]。從對(duì)多態(tài)性的揭示效率來看,SCoT標(biāo)記可作為研究化州柚種質(zhì)資源的一種有效手段。

表4 SCOT引物篩選優(yōu)化結(jié)果

本試驗(yàn)所構(gòu)建的UPGMA樹狀圖能夠?qū)⒒蓁謽悠放c其他柚類樣品分開,但有1份沙田柚樣品與化州柚聚類關(guān)系較近,這可能是如今化州柚多嫁接于沙田柚上培育的結(jié)果。陳曉潁等研究發(fā)現(xiàn),化州柚與沙田柚在ITS1序列上僅有2個(gè)堿基的差異[12],譚婉菁等研究也發(fā)現(xiàn),正毛和沙田柚的相似程度高,并且認(rèn)為正毛和沙田柚有一定的關(guān)系[13]。而另外的2份沙田柚樣品均來自海南瓊海且聚為一支,它們?cè)诋?dāng)?shù)赜?5年以上的樹齡,由于海南地理位置的特殊性,生長環(huán)境的差異可能造成了這2份沙田柚與廣東沙田柚的差別。試驗(yàn)結(jié)果能夠?qū)?duì)照品種檸檬與柚類分開,且柚類品種如化州柚和琯溪蜜柚都能夠很好地聚類,體現(xiàn)出SCoT標(biāo)記在柚類植物中分類鑒別的有效性和準(zhǔn)確性。

針對(duì)不同品種化州柚的分析,本研究顯示出以下幾個(gè)特點(diǎn):(1)同一品種的化州柚樣品沒有很好地聚為一支,但其聚類結(jié)果相對(duì)集中,鳳尾與假西洋樣品沒有混在同一小分支的情況,且同一采集地的不同品種有區(qū)分(如江湖鎮(zhèn)的鳳尾和密葉),同一品種采集地不同也能聚為一支(如廣西和大嶺村的假西洋);(2)本試驗(yàn)中的假西洋樣品能夠聚為一類,而4個(gè)鳳尾樣品則相對(duì)分散,這可能由于鳳尾是比較古老的品種,在長期繁衍的過程中,其后代發(fā)生變異的可能性較大[14],趙俊生等利用單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記對(duì)不同品種化州柚的基因分型研究中也表明化橘紅種質(zhì)資源可能存在更多的品系[15];(3)筆者在化州實(shí)地采樣中了解到密葉是相對(duì)較新的品種,并且可能由鳳尾演化而來,而本試驗(yàn)結(jié)果也印證了這一觀點(diǎn);(4)本研究中正毛樣品被分為2支, 分別與鳳尾和假西洋表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。正毛、副毛、光青是依據(jù)果實(shí)表面茸毛的多寡進(jìn)行區(qū)分的,在早期是一種商品的分類方法,這種稱謂一直沿用至今。而化州柚在長時(shí)間的繁衍下,已衍生出多個(gè)品種,正毛化橘紅也可能來源于不同的品種。趙俊生等的SNP分型研究中發(fā)現(xiàn),相同來源的正毛樣品基因型不同,卻分別與另一不同來源的正毛樣品基因型相同[15],龐一波的研究中也得到了相似的結(jié)論[16]?;莓?dāng)?shù)匾灿袑<艺J(rèn)為,正毛、副毛不應(yīng)歸為化州柚的不同品種而應(yīng)作為不同的商品等級(jí),同一植株在不同環(huán)境及管理?xiàng)l件下都有可能呈現(xiàn)出果實(shí)茸毛的多寡,并且化州柚果實(shí)存在越成熟毛越少的特性[17],因此同一植株的果實(shí)也可能出現(xiàn)“正毛”或“副毛”的特性。

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