周登攀， 郝小軍， 向本春

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

櫻桃種植業(yè)素有“黃金種植業(yè)”之稱，已成為我國(guó)近年來(lái)果樹(shù)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的重要樹(shù)種，櫻桃栽培面積和總產(chǎn)量逐年增長(zhǎng)，目前在山東、遼寧、河北、北京、山西、江蘇、安徽、河南、甘肅、新疆等地均有栽培種植[1]。隨著櫻桃栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大，病毒病日益加重，已成為制約櫻桃種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展及櫻桃產(chǎn)量、品質(zhì)的主要因素[2]。可以侵染櫻桃的病毒達(dá)30多種，常見(jiàn)的約有20種[3-4]，我國(guó)已報(bào)道的侵染櫻桃的病毒包括李屬壞死環(huán)斑病毒(prunus necrotic ring spot virus，簡(jiǎn)稱PNRSV)、李矮縮病毒(prune dwarf virus，簡(jiǎn)稱PDV)、櫻桃綠環(huán)斑駁病毒(cherry green ring mottle virus，簡(jiǎn)稱CGRMV)、櫻桃病毒A(cherry virus A，簡(jiǎn)稱CVA)、黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus，簡(jiǎn)稱CMV)、櫻桃壞死銹斑病毒(cherry necrotic rusty mottle virus，簡(jiǎn)稱CNRMV)、蘋果褪綠葉斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus，簡(jiǎn)稱ACLSV)等12種病毒[5-11]。PNRSV和PDV屬于雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬(Ilarvirus)，其中PNRSV是我國(guó)二類進(jìn)境檢疫性有害生物[12]；CGRMV屬于線形病毒科(Flexiviridae)凹陷病毒屬(Foveavirus)，是在我國(guó)李屬植物中發(fā)現(xiàn)的一種新病毒[8]。目前，這3種病毒已成為侵染櫻桃較為普遍的病毒，不僅單獨(dú)危害櫻桃，表現(xiàn)出一定的癥狀，同時(shí)多種病毒常常復(fù)合侵染，引起櫻桃表現(xiàn)綜合癥狀，給櫻桃種植業(yè)帶來(lái)巨大的損失。因此，建立一種同時(shí)檢測(cè)這3種病毒的檢測(cè)方法十分必要。

目前，我國(guó)在對(duì)櫻桃病毒病病原的檢測(cè)方法主要有常規(guī)單重RT-PCR技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)稱ELISA)檢測(cè)。阮小風(fēng)等利用單重 RT-PCR 技術(shù)對(duì)陜西、北京、大連、山東、河南等地區(qū)的甜櫻桃病毒病病原PNRSV、PDV、CGRMV、ACLSV、CVA、CNRMV等進(jìn)行檢測(cè)[3，13-15]；李青等利用ELISA法對(duì)北京地區(qū)櫻桃中PNRSV進(jìn)行檢測(cè)[16]。然而這些方法往往只能對(duì)特定的某一種病毒的感染情況進(jìn)行檢測(cè)，須要大量的重復(fù)工作，同時(shí)又會(huì)消耗大量的檢測(cè)試劑，單一病毒的RT-PCR檢測(cè)已經(jīng)不能滿足檢測(cè)工作的需求。多重RT-PCR技術(shù)是在單重RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)，不僅具有單重RT-PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，且多重RT-PCR反應(yīng)1次能同時(shí)快速檢測(cè)多種病原的優(yōu)點(diǎn)，能滿足生產(chǎn)上同時(shí)對(duì)多種病原進(jìn)行檢測(cè)的要求。盡管2014年宗曉娟等建立了對(duì)PNRSV、PDV、櫻桃小果病毒2(Littie cherry virus-2，簡(jiǎn)稱LChV-2)進(jìn)行多重RT-PCR檢測(cè)的方法[17]，但該方法并未對(duì)發(fā)病較為普遍的CGRMV進(jìn)行多重RT-PCR檢測(cè)。因此，本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)PNRSV、CGRMV、PDV等3種病毒多重RT-PCR檢測(cè)的方法進(jìn)行研究，建立櫻桃這3種病毒特異、高效的多重 RT-PCR 檢測(cè)方法，以期對(duì)櫻桃大量樣品快速檢測(cè)以及櫻桃病毒病的防控等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為采自新疆八師石河子地區(qū)疑似病毒病癥狀的櫻桃葉片，以健康植株葉片為陰性對(duì)照。采集的樣品分別裝在不同的采集袋中，液氮速凍后置于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA提取試劑盒(TransZolTMPlant)、TaqPCR酶及dNTPs Mix均購(gòu)自TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Thermo公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、2 000 bp DNA marker均購(gòu)自TransGen Biotech；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)試劑。PCR引物合成及測(cè)序由北京華大科技有限公司完成。大腸桿菌DH5α菌株由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物組織總RNA的提取 在單一RT-PCR中，分別稱取0.1 g感染病毒的葉片置于經(jīng)高溫滅菌處理的研缽中，加液氮磨成粉末；在多重RT-PCR中稱取等量的分別感染3種病毒的櫻桃葉片置于處理過(guò)的研缽中，加液氮研成粉末；用RNA提取試劑盒提取總RNA，最后用35 μL RNase free H2O溶解提取的總RNA。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中PNRSV(FR773524.2)、CGRMV(AJ291761)、PDV(KF718661.1)的基因組序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)3種病毒的特異性引物PNRSV-F/R、CGRMV-F/R、PDV-F/R。引物設(shè)計(jì)時(shí)盡可能保證各檢測(cè)引物退火溫度一致。引物序列的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR法擴(kuò)增病毒基因組特異性片段的引物

1.2.3 單重RT-PCR反應(yīng) cDNA第1鏈的合成：以5 μL提取的材料總RNA為模板、1 μL Oligo(dT)18為引物、1 μL隨機(jī)六聚體引物、1 μL無(wú)核酸酶的高純水輕輕混勻，65 ℃孵育5 min，迅速在冰上冷卻2 min，加入10 μL 2×ES Reaction Mix、1 μL gDNA Remover、1 μL RT Enzyme Mix，輕輕混勻，25 ℃ 孵育10 min后42 ℃孵育30 min，85 ℃加熱5 s終止反應(yīng)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)：以合成的cDNA第1鏈為模板進(jìn)行PCR，選用表中各引物分別檢測(cè)甜櫻桃樣本中的3種病毒。25 μL反應(yīng)體系：2.5 μL cDNA、2.5 μL 10×PCR buffer、1 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、1 μL特異性引物(10 μmol/L)、0.3 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，加16.7 μL ddH2O至終體積為 25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50～64 ℃退火30 s(溫度根據(jù)引物設(shè)定)，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并照相。PCR反應(yīng)在擴(kuò)增儀上進(jìn)行。

1.2.4 多重RT-PCR 選取混合提取的3種病毒的總RNA，用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成的cDNA第1鏈作為多重 RT-PCR 反應(yīng)的模板。在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入3種病毒引物組合，進(jìn)行PCR反應(yīng)。選用50 μL反應(yīng)體系：10 μL cDNA 模板，加ddH2O至終體積為50 μL，其他條件與單重 RT-PCR 相同。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的克隆、測(cè)序及分析 PCR擴(kuò)增片段經(jīng)回收純化后，連接至pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株后，通過(guò)菌落PCR以及酶切驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆，送至北京華大科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行相似性檢索(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，序列分析采用DNAMAN軟件。

1.2.6 多重RT-PCR檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用 從新疆石河子地區(qū)采集122份櫻桃病樣葉片，按照上述多重RT-PCR方法對(duì)部分樣品進(jìn)行多重RT-PCR檢測(cè)，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7 多重RT-PCR主要影響因素的優(yōu)化 在有效的多重RT-PCR條件下，采用單一變量法考察多重RT-PCR主要影響因素，考察某一影響因素時(shí)，其他因素不變。退火溫度分別設(shè)52、54、56、58、60、62、64、66 ℃等8個(gè)處理；dNTPs用量分別設(shè)0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L等5個(gè)處理；靈敏度分別設(shè)2、22、23、24、25、26倍等6個(gè)處理；循環(huán)數(shù)分別設(shè)25、30、35、40、45個(gè)循環(huán)等5個(gè)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)

用RNA提取試劑盒可從櫻桃葉片上提取純度較高的總RNA，用微量核酸蛋白分析儀測(cè)量其D260 nm/D280 nm均在1.7～2.0之間，表明組織中蛋白質(zhì)、多糖、多酚等物質(zhì)基本去除，提取的RNA純度較理想，可用于后續(xù)研究。

2.2 單重RT-PCR驗(yàn)證

以設(shè)施櫻桃病株材料的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)的模板，采用單重RT-PCR技術(shù)對(duì)表中各對(duì)引物進(jìn)行初篩。結(jié)果表明，引物PNRSV-F/R、CGRMV-F/R、PDV- F/R均能穩(wěn)定擴(kuò)增出其各自的特異性片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳觀察分別得到680、360、300 bp左右的條帶(圖1)，每種病毒特異性引物擴(kuò)增獲得的片段大小均與預(yù)期結(jié)果相同。

2.3 多重RT-PCR體系建立

將混合提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物用于多重?cái)U(kuò)增PNRSV、CGRMV、PDV，結(jié)果能夠擴(kuò)增出PNRSV(675 bp)、CGRMV(363 bp)、PDV(304 bp)目的條帶(圖2)，與單重 RT-PCR 擴(kuò)出的目的條帶一致，說(shuō)明混合提取的3種病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能夠用于多重PCR的擴(kuò)增；用相同的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及櫻桃健康葉片為樣本，對(duì)該引物組合多重RT-PCR擴(kuò)增的特異性進(jìn)行分析。由圖2可知，該引物組合均能特異性檢測(cè)出其各自的靶標(biāo)病毒，擴(kuò)出的各目的條帶與單重RT-PCR中各條帶的大小相同，而健康櫻桃樣品均未能出現(xiàn)特異性條帶，說(shuō)明這3組引物組合可用于這3種病毒的多重 RT-PCR 檢測(cè)。

2.4 多重RT-PCR檢測(cè)體系優(yōu)化

本研究對(duì)退火溫度和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以相同稀釋濃度的發(fā)病櫻桃樣品的cDNA為模板，選擇不同的退火溫度及PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)對(duì)多重RT-PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化。由圖3可知，退火溫度為52～60 ℃條件下，均能進(jìn)行特異性擴(kuò)增，在58、60 ℃時(shí)條帶最亮；當(dāng)退火溫度為62 ℃及以后時(shí)，PDV基本上不出現(xiàn)條帶，因此選擇最適退火溫度為58 ℃。由圖4可知，循環(huán)數(shù)對(duì)多重RT-PCR擴(kuò)增的影響不大，25個(gè)循環(huán)即能達(dá)到檢測(cè)目的，隨著循環(huán)數(shù)的增加，擴(kuò)增條帶的強(qiáng)度增加，但到45個(gè)循環(huán)時(shí)PDV不能擴(kuò)增出條帶。為了兼顧檢測(cè)效率與擴(kuò)增效果，實(shí)際操作時(shí)選擇35個(gè)循環(huán)。因此，多重 RT-PCR 的擴(kuò)增條件最終選擇退火溫度為58 ℃，35個(gè)循環(huán)。

由圖5可知，當(dāng)dNTPs的濃度在0.2～0.8 mmol/L時(shí)均能擴(kuò)增出較好的條帶，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大，但0.4～0.8 mmol/L dNTPs可以產(chǎn)生較清晰明亮的條帶，因此優(yōu)化體系選擇dNTPs的濃度為0.6 mmol/L。

2.5 多重RT-PCR靈敏度的分析

選取將混合提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為試驗(yàn)樣本，采用紫外吸收法測(cè)定其初始濃度為958 ng/μL，將總RNA模板依次稀釋2、22、23、24、25、26倍，對(duì)靈敏度進(jìn)行分析。由圖6可知，引物組合在稀釋24倍的cDNA中仍能特異性擴(kuò)增，但引物PNRSV-F/R擴(kuò)增出的條帶較微弱。稀釋24倍后，PNRSV、CGRMV的條帶很弱，引物組合幾乎檢測(cè)不到病毒條帶。因此，引物組合對(duì)植物cDNA的最低檢測(cè)濃度為 59.7 ng/μL。

2.6 擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果及序列分析

將多重RT-PCR擴(kuò)增的特異性條帶分別進(jìn)行凝膠回收，純化后連接至pMD18-T載體，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。結(jié)果顯示，PNRSV、CGRMV、PDV的擴(kuò)增產(chǎn)物分別由675、363、304個(gè)核苷酸組成，與預(yù)期產(chǎn)物大小相同，與GenBank中已報(bào)道的病毒分離物的核苷酸序列同源性分別為91%～99%、91%～99%、90%～99%，這證明了多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

2.7 應(yīng)用多重RT-PCR技術(shù)檢測(cè)新疆石河子地區(qū)櫻桃?guī)Ф厩闆r

利用優(yōu)化后的多重RT-PCR體系對(duì)采集的櫻桃田間樣品進(jìn)行檢測(cè)。由圖7可知，10個(gè)樣品均呈陽(yáng)性，且多存在復(fù)合侵染；其中有3個(gè)樣品只感染1種病毒，樣品2感染CGRMV，樣品6感染PNRSV，樣品8感染PDV；有5個(gè)樣品感染2種病毒，樣品1、樣品3均感染CGRMV、PDV，樣品5、樣品10均感染PNRSV、CGRMV，樣品7感染PNRSV、PDV；樣品4和樣品9復(fù)合感染3種病毒。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)櫻桃栽培在我國(guó)發(fā)展較快，栽培面積不斷擴(kuò)大以及栽培中的苗木引種和調(diào)運(yùn)、無(wú)性繁殖代數(shù)增多等因素，加快了櫻桃病毒病的傳播。目前，櫻桃病毒病在我國(guó)已廣泛發(fā)生。苗木引種、病毒的檢測(cè)一直是檢疫系統(tǒng)的難點(diǎn)。由于病毒在木本植株體內(nèi)的含量低、分布不均且具有復(fù)合侵染的特性[12]，在檢疫工作中會(huì)出現(xiàn)漏檢、誤檢等現(xiàn)象。分子生物學(xué)可以有效解決這一難題，PCR方法靈敏度高，對(duì)含量較低的靶標(biāo)病毒一般也不會(huì)出現(xiàn)漏檢情況，且對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，又能有效避免錯(cuò)檢發(fā)生。多重RT-PCR在單一RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏的特點(diǎn)。自1988年Chamberlain等首先將多重RT-PCR技術(shù)用以診斷杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良征[18]以來(lái)，多重RT-PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于煙草[19]、菊花[20]、葡萄[21]等作物及園藝植物的病毒檢測(cè)中。雖然宗曉娟等利用多重RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了PNRSV、LChV-2、PDV等3種甜櫻桃病毒[17]，但新疆地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)用多重 RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)櫻桃病毒。PNRSV是一種世界范圍內(nèi)分布的病毒，是我國(guó)二類進(jìn)境檢疫性有害生物[12]。PDV、CGRMV雖未列入其中，但在我國(guó)多地均有檢出，且常伴有復(fù)合侵染，嚴(yán)重影響了設(shè)施櫻桃的產(chǎn)量和品質(zhì)，危害嚴(yán)重。因此，本研究通過(guò)單一RT-PCR進(jìn)行引物特異性篩選，確定出適合多重RT-PCR反應(yīng)的引物組合，即PNRSV-F/R、CGRMV-F/R、PDV-F/R，特異性、靈敏度及克隆測(cè)序分析結(jié)果證明，該方法可應(yīng)用于櫻桃的樣品檢測(cè)。并通過(guò)多重 RT-PCR 條件的優(yōu)化，確定出最佳RT-PCR反應(yīng)條件：退火溫度為58 ℃、35個(gè)循環(huán)、dNTPs濃度為0.6 mmol/L、最低檢測(cè)濃度為59.7 ng/μL。通過(guò)最適反應(yīng)條件對(duì)新疆石河子周圍團(tuán)場(chǎng)及葡萄研究所采集的部分櫻桃樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該地區(qū)櫻桃?guī)Ф韭瘦^高，且多為復(fù)合侵染。該方法與常規(guī)的單一RT-PCR檢測(cè)方法相比，成本低、操作簡(jiǎn)便、快速、適用于3種病毒單一或復(fù)合感染樣品的檢測(cè)。

本研究經(jīng)過(guò)多次優(yōu)化試驗(yàn)條件建立了可同時(shí)檢測(cè)PNRSV、CGRMV、PDV的多重RT-PCR方法，該方法穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確、靈敏、檢測(cè)成本低，可應(yīng)用于櫻桃毒害單一或復(fù)合侵染的同步檢測(cè)。對(duì)控制我國(guó)櫻桃病毒病的傳播、櫻桃病毒病的檢測(cè)和及時(shí)防治具有重要意義。

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