高杰清，薛 靜，程 愈，張 琪，母義明，王 瑩

0 引言

胰島素抵抗作為多種代謝性疾病的共同病理生理基礎(chǔ)，已經(jīng)被證實是一種低度慢性炎癥[1-2]。巨噬細(xì)胞在該炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，且由原來的M2型(抑炎型)為主轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型(促炎型)巨噬細(xì)胞為主[3-5]。隨后研究發(fā)現(xiàn),促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變，增加 M2型巨噬細(xì)胞的比例可以顯著改善胰島素抵抗[6-8]。地西他濱是一種表觀調(diào)控藥物，早期大劑量應(yīng)用于治療血液系統(tǒng)腫瘤；近年研究發(fā)現(xiàn),小劑量地西他濱具有免疫調(diào)節(jié)作用[9-10]。在急性肺損傷、急性心肌梗死、動脈粥樣硬化模型中發(fā)現(xiàn)，表觀調(diào)控藥物可以作用于巨噬細(xì)胞，促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞向M2極化，抑制過度炎癥發(fā)生[11-13]。前期研究中，筆者將小劑量地西他濱作用于M1型巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可抑制促炎因子的表達(dá),促使M1型巨噬細(xì)胞向M2極化[14]?；诰奘杉?xì)胞表型轉(zhuǎn)變在胰島素抵抗中的重要性，以及地西他濱對巨噬細(xì)胞極化的影響，本研究首次將地西他濱作用于高脂喂養(yǎng)的胰島素抵抗模型,探討小劑量地西他濱對小鼠胰島素抵抗的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 8周齡、雄性C57BL/6小鼠，18～20 g，SPF級，購自解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗動物中心。高脂飼料(D12492,美國);地西他濱(中國西安楊森)；胰島素試劑盒 (Ultrasensitive Rat Insulin ELISA，Mercodia)；Trizol RNA 提取試劑(invitrogen，美國)；PrimeScript?RT reagent Kit(Thermo，美國)和SYBR?Premix Ex TaqTM(TOYOBO，日本)；PCR引物由美國invitrogen合成；Q-PCR 儀器(Bio-Rad，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 胰島素抵抗模型的構(gòu)建及分組 8周齡、雄性C57BL/6小鼠普通飼料適應(yīng)喂養(yǎng)1周后,采用高脂飼料飼養(yǎng)12周,檢測小鼠空腹血糖、空腹胰島素，行IPGTT、IPITT試驗，檢測胰島素抵抗模型是否成功。選造模成功小鼠12只，隨機(jī)分為模型組(HFD組，n=6)、地西他濱組(DAC組，n=6)，另選6只同期正常飼料飼養(yǎng)小鼠作為對照組(NC組，n=6)。地西他濱組給予地西他濱0.25 mg/kg腹腔注射，1次/d，連續(xù)5 d，其余兩組同期給予等量PBS腹腔注射。所有操作均符合實驗動物保護(hù)法。

1.2.2 指標(biāo)檢測 地西他濱治療后連續(xù)監(jiān)測小鼠體重，并于治療2周后，禁食12 h，經(jīng)腹腔注射葡萄糖(2 g/kg)或胰島素(1 U/kg),行腹腔注射葡萄糖耐量試驗(IPGTT)或胰島素耐量試驗(IPITT),分別于注射前和注射后30、60、90、120 min檢測血糖。ELISA檢測空腹胰島素(FINS)水平。穩(wěn)態(tài)模型評估的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=空腹血糖(FPG,mmol/L)×FINS (mU/L)/22.5。實驗結(jié)束后，小鼠斷頸處死,收集兩側(cè)附睪脂肪并稱重，一部分附睪脂肪組織凍存于液氮中用于提取RNA，另一部分置于中性甲醛溶液中固定用于制做5 μm厚度的連續(xù)石蠟切片。

1.2.3 HE 染色 新鮮脂肪組織浸入4%中性甲醛溶液中固定48 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm切片后常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。

1.2.4 qRT-PCR 檢測炎癥相關(guān)因子及巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá) 脂肪組織研磨后，用Trizol法提取總RNA，微量分光光度計(美國Bio-Rad公司)檢測RNA樣品及純度。每50 μL體系各取2.5 μg總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為42 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min，-20 ℃保存。取1 μL cDNA進(jìn)行實時定量PCR，加入上下游引物各1 μL，SYBER Green mix 12.5 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)齊至總反應(yīng)體系20 μL。以β-actin作為內(nèi)參照，基因表達(dá)相對倍數(shù)變化用 2-ΔΔCt計算。

2 結(jié)果

2.1 胰島素抵抗模型建立 開始時兩組小鼠體重相當(dāng)，飼養(yǎng)4周后，高脂喂養(yǎng)組小鼠(HFD組)較對照組(NC)體重增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；飼養(yǎng)8周后，HFD組小鼠體重增長迅速，與NC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且差異越來越大(圖1A)。IPGTT、IPITT結(jié)果顯示，與NC組相比，HFD組小鼠糖耐量明顯減低(各時點P均<0.01，見圖1B)，胰島素敏感性顯著下降(各時點P均<0.01，見圖1C)，提示胰島素抵抗模型建立成功。

2.2 地西他濱對肥胖小鼠胰島素敏感性的影響 地西他濱治療后小鼠體重?zé)o明顯變化。與HFD組相比，地西他濱組(DAC組)小鼠葡萄糖調(diào)節(jié)能力得到明顯改善(P<0.01)(圖2A)，HOMA-IR明顯降低(P<0.01)。見圖2B。IPITT結(jié)果顯示，腹腔注射胰島素30 min時，DAC組和HFD組血糖分別下降到原來的88.0%±3.00%、92.7%±2.52%(P=0.092)；60 min時，DAC組和HFD組血糖分別下降到77.67%±2.51%、84.0%±3.00%(P=0.034)；90 min時，DAC組血糖下降幅度較HFD組高，達(dá)10%(P=0.004)；120 min時，DAC組血糖與HFD組差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.015，圖2C),提示小鼠胰島素抵抗得到改善。

2.3 地西他濱對小鼠脂肪組織相關(guān)慢性炎癥的影響 與HFD組相比，DAC處理后，附睪脂肪重量明顯減輕(P=0.045，圖3A)。HE染色結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)后脂肪細(xì)胞明顯增大，間質(zhì)區(qū)細(xì)胞數(shù)量增多；DAC處理后，不僅脂肪細(xì)胞減小，間質(zhì)區(qū)細(xì)胞數(shù)量也明顯減少(圖3C)。進(jìn)一步檢測脂肪組織炎癥因子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，HFD組促炎因子MCP-1、TNF-α、IL-1β的表達(dá)明顯增加，抑炎因子IL-4、IL-10的表達(dá)明顯減少(P<0.05)；經(jīng)地西他濱處理后，MCP-1、IL-1β的表達(dá)被顯著抑制 (P<0.05)，TNF-α的表達(dá)略有下降的趨勢(P=0.12)；抑炎因子IL-4、IL-10的表達(dá)得到明顯改善 (P<0.01，圖 3B)，提示地西他濱可明顯減輕脂肪組織相關(guān)的慢性炎癥。

2.4 地西他濱對巨噬細(xì)胞表型的影響 與NC組比較，HFD組M1型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物iNOS、CD11c的表達(dá)明顯增加(P<0.01)；M2 型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物Arg的表達(dá)明顯減少(P<0.05)。經(jīng)DAC處理后，iNOS、CD11c表達(dá)分別下降了31.89%、24.07% (P<0.01)；CD206、Arg的表達(dá)分別上調(diào)了144.44%、28.97%(P<0.01，圖4)，提示地西他濱對脂肪組織中巨噬細(xì)胞的表型起到調(diào)節(jié)作用。

圖1 胰島素抵抗小鼠模型的鑒定

圖2 地西他濱對肥胖小鼠胰島素抵抗的改善作用

圖3 地西他濱對肥胖小鼠附睪脂肪組織及其慢性炎癥的影響(HE×50)

圖4 地西他濱對脂肪組織中巨噬細(xì)胞表型的影響

3 討論

胰島素抵抗是指機(jī)體組織對胰島素的敏感性降低的一種病理狀態(tài)，由此引起的糖、脂代謝紊亂可導(dǎo)致糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病等多種疾病，危害巨大。然而，目前有效的治療措施仍然非常有限。越來越多的研究探討胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制，目前認(rèn)為，肥胖過程中大量巨噬細(xì)胞浸潤脂肪組織，并在組織中產(chǎn)生一系列炎癥因子如TNF-α、IL-1β，導(dǎo)致機(jī)體呈現(xiàn)慢性低度炎癥狀態(tài)，進(jìn)而引起胰島素抵抗的產(chǎn)生[1-2]。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，隨著體重的增加，脂肪組織中巨噬細(xì)胞的類型也發(fā)生變化，由消瘦時的M2型巨噬細(xì)胞為主轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型巨噬細(xì)胞為主[15]。另外，促進(jìn) M1 型巨噬細(xì)胞向 M2 型極化，增加組織中M2 型巨噬細(xì)胞數(shù)量可以減輕上述炎癥反應(yīng)，顯著改善胰島素抵抗[5-8]。因此，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞異常極化狀態(tài)及其相關(guān)炎癥將成為改善胰島素抵抗的重要靶點。

地西他濱是一種表觀調(diào)控藥物，早期用于血液系統(tǒng)腫瘤的治療。2015年《cell》的1篇文獻(xiàn)報道，小劑量地西他濱的抑癌作用主要是通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)實現(xiàn)的[10]。Tsai 等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，地西他濱可以抑制促炎型T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向抑炎型的Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制過度炎癥發(fā)生。地西他濱對DC細(xì)胞、NK細(xì)胞的研究也時有報道[17-18]。近年來，有研究者將表觀調(diào)控藥物應(yīng)用于急性肺損傷、急性心肌梗死及動脈粥樣硬化的治療，發(fā)現(xiàn)其可以作用于巨噬細(xì)胞，促進(jìn)M1巨噬細(xì)胞向M2極化，抑制過度炎癥的發(fā)生[11-13]。本課題組將小劑量地西他濱直接作用于LPS誘導(dǎo)的M1型骨髓巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞的促炎能力明顯被抑制，巨噬細(xì)胞表型向M2極化[14]。關(guān)于地西他濱對巨噬細(xì)胞的這種調(diào)節(jié)作用在體內(nèi)是否同樣存在值得我們進(jìn)一步探討。

本研究首次將地西他濱作用于高脂喂養(yǎng)的胰島素抵抗小鼠模型,治療2周后，脂肪組織中M1型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物明顯下調(diào)，M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物得到明顯上調(diào)，與體外實驗相一致。同時，DAC治療組小鼠附睪脂肪含量較HFD組減少，脂肪細(xì)胞減小，促炎因子MCP-1、IL-1β的表達(dá)被顯著抑制，抑炎因子IL-4、IL-10的表達(dá)得到明顯改善，提示脂肪組織相關(guān)慢性炎癥減輕。同時，與HFD組相比，DAC組小鼠的糖耐量明顯改善、胰島素敏感性明顯提高。該結(jié)果提示，地西他濱在體內(nèi)同樣可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型，進(jìn)而減輕巨噬細(xì)胞相關(guān)慢性炎癥，改善胰島素抵抗。

綜上所述，地西他濱不僅可以在體外促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞向M2極化，抑制M1型巨噬細(xì)胞的促炎能力，而且在胰島素抵抗模型中同樣可以減少肥胖小鼠脂肪組織中M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量，增加M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量，減輕脂肪組織相關(guān)的慢性炎癥，改善胰島素抵抗。這些特點在一定程度上為探索新型改善胰島素抵抗的藥物提供基礎(chǔ)。但是，本研究沒有揭示地西他濱調(diào)控巨噬細(xì)胞極化、改善胰島素抵抗的具體機(jī)制。因此，下一步研究將聚焦地西他濱調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的信號通路，這可能為胰島素抵抗的治療提供新的靶點。

參考文獻(xiàn)：

[1] Ferrante AW.Macrophages,fat,and the emergence of immunometabolism[J] .J Clin Invest,2013,123(12):4992-4993.

[2] McNelis JC,Olefsky JM.Macrophages,immunity,and metabolic disease[J] .Immunity,2014,41(1):36-48.

[3] Lumeng CN,DelProposto JB,Westcott DJ,et al.Phenotypic switching of adipose tissue macrophages with obesity is generated by spatiotemporal differences in macrophage subtypes[J] .Diabetes,2008,57(12):3239-3246.

[4] Chawla A,Nguyen KD,Goh YP.Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease[J] .Nat Rev Immunol,2011,11(11):738-749.

[6] Murray PJ,Wynn TA.Protective and pathogenic functions of macrophage subsets[J] .Nat Rev Immunol,2011,11(11):723-737.

[7] Ji Y,Sun S,Xu A,et al.Activation of natural killer T cells promotes M2 Macrophage polarization in adipose tissue and improves systemic glucose tolerance via interleukin-4 (IL-4)/STAT6 protein signaling axis in obesity[J] .J Biol Chem,2012,287(17):13561-13571.

[8] Xie Z,Hao H,Tong C,et al.Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells elicit macrophages into an anti-inflammatory phenotype to alleviate insulin resistance in type 2 diabetic rats[J] .Stem Cells,2016,34(3):627-639.

[9] Sánchez-Abarca LI,Gutierrez-Cosio S,Santamaría C,et al.Immunomodulatory effect of 5-azacytidine (5-azaC):potential role in the transplantation setting[J] .Blood,2010,115(1):107-121.

[10] Chiappinelli KB,Strissel PL,Desrichard A,et al.Inhibiting DNA methylation causes an interferon response in cancer via dsRNA including endogenous retroviruses[J] .Cell,2015,162(5):974-986.

[11] Thangavel J,Samanta S,Rajasingh S,et al.Epigenetic modifiers reduce inflammation and modulate macrophage phenotype during endotoxemia-induced acute lung injury[J] .J Cell Sci,2015,128(16):3094-3105.

[12] Kim YS,Kang WS,Kwon JS,et al.Protective role of 5-azacytidine on myocardial infarction is associated with modulation of macrophage phenotype and inhibition of fibrosis[J] .J Cell Mol Med,2014,18(6):1018-1027.

[13] Cao Q,Wang X,Jia L,et al.Inhibiting DNA Methylation by 5-Aza-2'-deoxycytidine ameliorates atherosclerosis through suppressing macrophage inflammation[J] .Endocrinology,2014,155(12):4925-4938.

[14] 高杰清,張琪,尹雅琪,等.低劑量地西他濱對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用[J] .解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2017,38(8):793-797.

[15] Shu CJ,Benoist C,Marhis D.The immune system′s involvement in obesity-driven type 2 diabetes[J] .Semin Immunol,2012,24(6):436-442.

[16] Tsai HC,Li H,Van Neste L,et al.Transient low doses of DNA-demethylating agents exert durable antitumor effects on hematological and epithelial tumor cells[J] .Cancer Cell,2012,21(3):430-446.

[17] Kopp LM,Ray A,Denman CJ,et al.Decitabine has a biphasic effect on natural killer cell viability,phenotype,and function under proliferative conditions[J] .Mol Immunol,2013,54(3-4):296-301.

[18] Zhang X,Ulm A,Somineni HK,et al.DNA methylation dynamics during ex vivo differentiation and maturation of human dendritic cells[J] .Epigenetics Chromatin,2014,7:21.