蘇玉清，王 烜

0 引言

過(guò)度激活的免疫炎癥反應(yīng)與抗免疫炎癥反應(yīng)之間的失衡，是導(dǎo)致炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)炎癥持續(xù)存在的重要機(jī)制之一[1]。機(jī)體中這種對(duì)抗過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng)主要通過(guò)TGF-β1/Smad3通路實(shí)現(xiàn)[2]。但I(xiàn)BD中，該通路受損[3]：即IBD患者體內(nèi)TGF-β1較正常人升高，但由于高表達(dá)的Smad7蛋白抑制了該通路中的Smad3磷酸化為pSmad3，使得TGF-β1不能正常發(fā)揮其免疫抑制作用，導(dǎo)致炎癥持續(xù)存在[4-5]，修復(fù)該通路，理論上即可達(dá)到緩解結(jié)腸炎癥狀的目的。

全反式維甲酸能夠在炎癥狀態(tài)下維持TGF-β1對(duì)Treg形成的誘導(dǎo)，防止其向Th17轉(zhuǎn)化；同時(shí)維持Foxp3的持續(xù)表達(dá)[6]，而Treg是IBD中起免疫抑制的重要細(xì)胞之一。atRA與TGF-β1在Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)化因子Foxp3的生成上有協(xié)同作用[7]。atRA可增加Smad3基因的表達(dá)。在體外模擬的炎癥狀態(tài)下，全反式維甲酸單獨(dú)干預(yù)僅能誘導(dǎo)Smad3 mRNA的轉(zhuǎn)錄，但不改變pSmad3的含量，但加入TGF-β1，可增加pSmad3的含量[8]。因此，鑒于免疫-抗免疫失衡在IBD中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)就atRA是否能通過(guò)修復(fù)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路，達(dá)到緩解結(jié)腸炎癥狀的目的，進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SD大鼠購(gòu)自西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雄性，體重(220±20)g。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)器材及試劑 三硝基苯磺酸(5%TNBS)(美國(guó)Sigma公司)；全反式維甲酸片(山東來(lái)福制藥有限公司)，美沙拉嗪(法國(guó)愛(ài)的發(fā)制藥集團(tuán))，無(wú)水乙醇、異丙醇(國(guó)藥集團(tuán))；IL-17 ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒(北京誠(chéng)林生物有限公司)；Smad7兔抗鼠多克隆抗體(北京博奧森有限公司)；pSmad3兔抗鼠多克隆抗體(Bioworld)；PCR儀(杭州博日科技)；免疫組化染色儀(美國(guó)Ventana公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(芬蘭Thermo公司)。

1.3 方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)后，用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組：對(duì)照組(C組)，造模組(TNBS組)，美沙拉嗪組(M組)，全反式維甲酸組(A組)，全反式維甲酸+美沙拉嗪組(MA組)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，予TNBS/無(wú)水乙醇灌腸液(100 mg/kg)造模。24 h后，予不同藥物灌胃：①C組及TNBS組(2 mL生理鹽水)；③M組(30 mg/kg)；④A組(20 mg/kg)；⑤MA組(為上述二者的聯(lián)合)。

2 固定、取材、測(cè)指標(biāo)

2.1 取材 于造模后每天行DAI積分(參照Osman N等標(biāo)準(zhǔn))：①體重：不下降或升高計(jì)0分，下降1%～5%計(jì)1分，下降6%～10%計(jì)2分，11%～15%計(jì)3分，>15%計(jì)4分；②大便：正常計(jì)0分，半稀便計(jì)2分，稀便計(jì)4分；③隱血：陰性計(jì)0分，陽(yáng)性計(jì)2分，出現(xiàn)肉眼血便計(jì)4分。8 d后，心臟負(fù)壓采血5 mL，提取血清儲(chǔ)存，待用ELISA法檢測(cè)用。處死大鼠，肉眼觀察結(jié)腸大體觀。取病變明顯的結(jié)腸組織行病理切片及免疫組化實(shí)驗(yàn)及QT-PCR實(shí)驗(yàn)。

2.2 相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

2.2.1 HE染色及切片觀察 結(jié)腸組織經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、透明，封片，觀察病理改變，行TDI評(píng)分。0分：沒(méi)有損傷；1分：較弱的黏膜和黏膜下炎癥浸潤(rùn)和充血水腫，黏膜輕度糜爛，而黏膜肌層保持完整；2分：在1分的基礎(chǔ)上，范圍達(dá)標(biāo)本的50%以上；3分：顯著的炎癥浸潤(rùn)和充血水腫，潰瘍延伸到黏膜下層和黏膜肌層，較少的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)固有層，無(wú)肌層壞死；4分：在3分的基礎(chǔ)上，范圍達(dá)標(biāo)本的50%及以上；5分：廣泛的潰瘍形成，伴有壞死，細(xì)胞壞死達(dá)黏膜固有肌層；6分：在5分的基礎(chǔ)上，范圍達(dá)標(biāo)本的50%及以上。

2.2.2 免疫組化測(cè)定Smad7、pSmad3水平 組織脫蠟、水化，封閉，滴加羊抗大鼠Smad7、pSmad3多克隆抗體，滴加生物素化的兔抗羊抗體室溫孵育，DAB顯色，蒸餾水終止反應(yīng)，顯微鏡高倍鏡下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)視野，在相同條件下拍攝并用Image-proplus(IPP)6.0圖像分析軟件測(cè)定積分光密度(Integrated option density，IOD)。

2.2.3 ELISA檢測(cè)IL-17、TNF-α水平 按ELISA試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定各孔的吸光度(OD值)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算多項(xiàng)式二次回歸方程，計(jì)算樣品的實(shí)際濃度。

2.2.4 QT-PCR檢測(cè)TGF-β1、Smad7水平 取約100 mg組織，按RNA提取試劑盒提取RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA。使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒測(cè)定mRNA，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min,95 ℃循環(huán)(40次),溶解曲線60 ℃→95 ℃，每20 s升溫1 ℃;反應(yīng)體系為：2×qPCR Mix 5.0 μL,引物工作液1.0 μL,Template 1.0 μL,ddH2O 2.8 μL,Rox 0.2 μL(引物見(jiàn)表1)。

3 結(jié)果

3.1 模型建立及一般形態(tài)觀察 造模后所有大鼠均出現(xiàn)水樣、糊狀稀便，以及精神萎靡，懶動(dòng)，進(jìn)食少，毛色臟亂，對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍，造模后第2、3天，個(gè)別大鼠解鮮紅色血便。予以干預(yù)后，在造模后第4天M組和MA組大鼠糞便好轉(zhuǎn)，A組在造模后第5天出現(xiàn)糞便好轉(zhuǎn)。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(即造模后第8天)，模型組死亡大鼠2只，其中1只解剖后考慮腸壞死；另1只考慮炎癥過(guò)重導(dǎo)致。M組及A組各死亡1只，前者推測(cè)為灌胃時(shí)藥物誤入氣管導(dǎo)致窒息，后者則是炎癥過(guò)重所致。C組無(wú)大鼠死亡，毛色光亮，體重增加(見(jiàn)圖1)。

3.2 結(jié)腸大體觀 C組無(wú)充血、水腫、狹窄，腸壁蠕動(dòng)好，與周圍組織無(wú)黏連。模型組大鼠結(jié)腸局部嚴(yán)重狹窄、僵硬，腸段縮短，腸段可見(jiàn)多個(gè)散在表面附有臟苔之潰瘍面，周圍黏膜充血、水腫、糜爛，與周圍組織嚴(yán)重黏連，無(wú)法分離。M組及A組大鼠結(jié)腸局部有黏連、輕度狹窄，但腸蠕動(dòng)可，未見(jiàn)明顯深凹潰瘍面。MA組結(jié)腸局部黏連輕，腸段長(zhǎng)度基本正常，腸壁蠕動(dòng)好(見(jiàn)圖2)。

3.3 大鼠的DAI積分及體重分析 藥物干預(yù)后，各組體重比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.85，P<0.05)；組間比較提示，TNBS組下降最顯著，相較于其他各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),A組與M組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.589),MA組較A組和M組升高(P=0.006、0.02)。DAI積分顯示，藥物干預(yù)后，DAI評(píng)分較前明顯好轉(zhuǎn)，其中仍以TNBS組評(píng)分最高，各組間DAI積分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=67.7,P<0.05)；A組與M組相比，DAI積分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.585)，MA組與A組和M組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005、0.019)。提示藥物干預(yù)緩解了大鼠結(jié)腸炎癥狀，以MA組效果最明顯。見(jiàn)表2、圖3。

3.4 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 大鼠結(jié)腸組織行HE染色后10×10倍顯微鏡下觀察，可見(jiàn)C組各層結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)潰瘍形成，腺體排列有序，固有層可見(jiàn)少許炎癥細(xì)胞。TNBS組可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)結(jié)腸全層，各層結(jié)構(gòu)及腺體等消失，無(wú)法辨認(rèn)，潰瘍深達(dá)肌層。干預(yù)后，A組較M組黏膜下層仍有較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但可見(jiàn)修復(fù)的黏膜層及杯狀細(xì)胞，部分黏膜仍可見(jiàn)淺小潰瘍，各層結(jié)構(gòu)基本能辨認(rèn)。MA組各層結(jié)構(gòu)可辨識(shí)，仍可見(jiàn)到炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，個(gè)別腺體排列欠規(guī)則，黏膜層基本修復(fù)，未見(jiàn)明顯潰瘍面形成。結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分提示，各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.25，P<0.01)；組間比較，相較于TNBS組，經(jīng)處理后，各組病理評(píng)分均有所好轉(zhuǎn)(P<0.01)，M組與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.86±0.69 vs. 3.14±1.34，P>0.05),MA組緩解最明顯，相較于M組、A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002、0.009)。見(jiàn)表2、圖4。

表1 引物(由Invitrogen Biotechnology Co,LTD中國(guó)公司合成)

圖1 大鼠一般情況

表2 各組大鼠DAI積分、體重及TDI評(píng)分比較

組別處死當(dāng)日DAI積分處死當(dāng)日體重(g)TDIC組0.00±0.00240.90±7.380.25±0.46TNBS組8.33±1.21*193.82±14.52△4.67±1.03△A組3.29±1.11*209.60±10.87#△2.86±0.69#△M組3.00±1.29*212.53±9.92#△3.14±1.34#△MA組1.71±0.75*225.53±6.89#1.57±0.53#F值67.7821.8526.25P值<0.01<0.01<0.01

注：*與C組比較，P<0.05；#與TNBS組比較，P<0.05；△與MA組比較，P<0.05

3.5 結(jié)腸組織QT-PCR檢測(cè)TGF-β1及Smad7 mRNA的表達(dá) 各組TGF-β1 mRNA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 421.25，P<0.01),其中TNBS組較C組有所升高(P<0.01)，A組較M組、MA組TGF-β1 mRNA升高更明顯，聯(lián)合組為甚，A組與M組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.427),聯(lián)合組較單藥組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。多組組間分析提示，各組Smad7 mRNA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=242.25,P<0.01),TNBS組中表達(dá)最高，C組最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。干預(yù)后，相較于TNBS組，其他組Smad7 mRNA表達(dá)均下降，以聯(lián)合組下降最明顯(P<0.01)，A組與M組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.586)。提示TNBS組雖然較C組TGF-β1表達(dá)增加，但其腸道仍然有很嚴(yán)重的炎癥損害，提示在TNBS組中增加的TGF-β1并不能完全發(fā)揮其正常的免疫抑制效應(yīng)從而減輕炎癥。而在結(jié)腸炎模型組中，Smad7的轉(zhuǎn)錄水平較其他組均明顯升高，表明可能是過(guò)度表達(dá)的Smad7抑制了TGF-β1的這種保護(hù)效應(yīng)。見(jiàn)表3。

圖3 大鼠結(jié)腸DAI及TDI直方圖

圖4 大鼠結(jié)腸組織病理切片(HE，100×)

表3 各組大鼠TGF-β1/Smad3通路蛋白mRNA水平比較

注：*與MA組比較，P<0.05；#與TNBS組比較，P<0.05

3.6 ELISA法檢測(cè)血清中的IL-17、TNF-α水平 多組組間分析提示各組IL-17比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=85.94，P<0.01),以TNBS組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，C組最低。干預(yù)后，各藥物組較TNBS組均有明顯下降(P<0.01)，相較于A組和M組，MA組下降最明顯(P=0.008、0.022)。各組間TNF-α比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=74.13，P<0.01)，以TNBS組最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，C組最低(P<0.01)，MA組下降最明顯(相較于A組及M組，P=0.001、0.002)。提示，經(jīng)藥物干預(yù)后，各組炎癥較TNBS組有緩解，MA組效果明顯，但仍未達(dá)C組水平。見(jiàn)表4。

3.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Smad7、pSmad3蛋白的表達(dá) 免疫組織化學(xué)方法提示，這2種蛋白主要表達(dá)于固有層免疫細(xì)胞，胞質(zhì)和部分細(xì)胞核表現(xiàn)為棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。IPP-6測(cè)定IOD，Smad7在TNBS組表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；干預(yù)后，各組均有所下降，以MA組下降最明顯。多組組間pSmad3蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=273.39，P<0.01)；兩兩比較提示，相較于其他各組，C組表達(dá)最高(P<0.01)，A組與M組pSmad3表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.397)，MA組較A組和M組升高(P<0.01)，TNBS組積分光密度值最低。見(jiàn)表5、圖5～圖7。

表4 各組血清炎癥因子水平比較

注：*與MA組比較，P<0.05；#與TNBS組比較，P<0.05

表5 各組大鼠Smad7、pSmad3蛋白IOD值比較

注：*與MA組比較，P<0.05；#與TNBS組比較，P<0.05

圖5 大鼠結(jié)腸組織中Smad7、pSmad3蛋白IOD直方圖

3 討論

炎癥性腸病的發(fā)病原因尚不完全清楚,在發(fā)病過(guò)程中，多種炎癥通路(NF-κB通路、MAPKs通路等)的激活，以及多種致病性免疫細(xì)胞(Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞等)的活化，釋放出大量炎癥因子，如IL-17、TNF-α、IL-6、IL-23等，引發(fā)腸道黏膜損傷，導(dǎo)致一系列臨床癥狀如腹痛、黏液血便等的出現(xiàn)[9-10]。對(duì)于一般的免疫炎癥反應(yīng)，機(jī)體存在保護(hù)性的對(duì)抗機(jī)制，即抗免疫炎癥反應(yīng)，目的是減少過(guò)度激活的炎癥反應(yīng)持續(xù)存在造成組織損傷，但是在IBD中，這種對(duì)抗機(jī)制被削弱。因此，增強(qiáng)或恢復(fù)機(jī)體本身存在的抗免疫炎癥反應(yīng)可成為一種新的治療途徑。在炎癥性腸病中，這種抑制作用主要通過(guò)TGF-β1/Smad3通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，TGF-β1與TβRⅠ-TβRⅡ異二聚體結(jié)合，活化TβRⅠ，后者吸引Smad2/Smad3結(jié)合并將其磷酸化，活化的pSmad2/Smad3與Smad4結(jié)合,共同入核，啟動(dòng)下游目的基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮免疫抑制效能。Smad7通過(guò)作用于TβRⅠ從而阻斷Smad2/Smad3磷酸化而活化，最終遏制該通路下游基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。在炎癥性腸病中，過(guò)度表達(dá)的Smad7阻斷了該通路的正常轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致抗炎因子生成減少，從而使得過(guò)度激活的炎癥反應(yīng)失去控制。

圖6 大鼠結(jié)腸組織中Smad7蛋白(免疫組化，400×)

圖7 大鼠結(jié)腸組織中Smad3蛋白(免疫組化，400×)

在本實(shí)驗(yàn)中，TNBS組TGF-β1高于C組，TGF-β1是體內(nèi)免疫抑制作用最強(qiáng)的因子，但是在如此高表達(dá)水平下，TNBS組仍出現(xiàn)不可控的炎癥反應(yīng)，說(shuō)明TNBS組大鼠體內(nèi)的TGF-β1并沒(méi)有完全發(fā)揮其免疫抑制作用。隨后，我們研究了TGF-β1最重要的通路TGF-β1/Smad3；QT-PCR結(jié)果顯示，C組的Smad7 mRNA較TNBS組下降。進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)了Smad7、pSmad3的表達(dá)，結(jié)果提示，C組Smad7遠(yuǎn)低于模型組，而pSmad3遠(yuǎn)高于TNBS組，提示TNBS結(jié)腸炎模型中存在TGF-β1/Smad3的受損。這與之前的研究結(jié)果一致[3]。

經(jīng)全反式維甲酸干預(yù)后，與TNBS組比較，在癥狀、病理等方面均得到改善，提示全反式維甲酸對(duì)結(jié)腸炎有治療作用。進(jìn)一步的結(jié)果提示，與TNBS組比較，QT-PCR顯示，全反式維甲酸可以抑制Smad mRNA水平，免疫組織化學(xué)結(jié)果提示，Smad7蛋白在atRA組明顯減少，這種減少可能是通過(guò)基因轉(zhuǎn)錄層面實(shí)現(xiàn)的。Smad7的減少間接引發(fā)pSmad3的表達(dá)量顯著上調(diào)，這提示全反式維甲酸可能通過(guò)修復(fù)TGF-β1/Smad3通路發(fā)揮緩解作用。進(jìn)一步檢測(cè)該通路下游的炎癥因子水平也支持這種推測(cè)。

將A組與目前用于治療炎癥性腸病的一線藥物美沙拉嗪比較，兩者的治療效果大體相似，包括DAI、結(jié)腸大體外觀及TDI積分在內(nèi)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，TGF-β1/Smad3通路的蛋白轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，以及該通路下游的炎癥因子的濃度，兩者差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是Rousseaux等[11]已經(jīng)證實(shí)，美沙拉嗪是已經(jīng)明確了的PPARγ新型配體，其作用靶點(diǎn)并不是TGF-β1/Smad3通路。因此，推測(cè)出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是：TGF-β1/Smad3通路中的Smad蛋白(包括Smad7和Smad3在內(nèi))作為體內(nèi)多種炎癥通路(JNK通路、NF-κB通路等)的交匯點(diǎn)，通過(guò)其可以影響各炎癥通路的表達(dá)水平，各炎癥通路也可以反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3通路，包括上調(diào)或下調(diào)Smad蛋白表達(dá)量[12]。因此，美沙拉嗪作用于PPARγ-NF-κB通路，使得炎癥反應(yīng)減輕，下調(diào)了Smad7蛋白的表達(dá)。

與單用藥組比較，MA組的治療效果更好。MA組Smad7 mRNA、Smad7蛋白的表達(dá)明顯少于單一用藥組，而pSmad3則較高。既往研究證明，美沙拉嗪的作用靶點(diǎn)是PPARγ。PPARγ被配體激活后,必須先與視黃酸X受體α(RXRα)結(jié)合形成PPARγ/RXRα異二聚體,然后才能與靶基因的特異性DNA序列結(jié)合，激活并介導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄。atRA擁有與9-cis-RA相似的RXRα激活特性，PPARγ配體(美沙拉嗪)和RXRα配體(atRA)的雙重激活能使異二聚體發(fā)揮更強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子活性[13-14]。因此，聯(lián)合使用美沙拉嗪+全反式維甲酸這兩種作用靶點(diǎn)不同但又具有協(xié)同作用的藥物，可能是治療效果更好的原因。

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