左曉利，黃紅瑩，孟祥毅

0 引言

動(dòng)脈粥樣硬化是多種心腦血管疾病的基礎(chǔ)。內(nèi)皮細(xì)胞損傷應(yīng)答學(xué)說認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化是機(jī)體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的一種慢性反應(yīng)[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷表現(xiàn)為內(nèi)皮功能障礙和紊亂，繼而引起氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝異常、脂質(zhì)物質(zhì)積聚等一系列生理病理變化，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成[2]。紅景天苷(Salidroside，SAL)是從藥用植物紅景天中分離的苯乙醇類單一中藥成分，是紅景天的主要活性成分之一。研究表明，紅景天苷能夠激活DNA修復(fù)酶poly(ADP-核糖)、聚合酶(Parp-1)，并保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[3]。近年研究表明，紅景天苷可以降低低密度脂蛋白受體缺陷小鼠的動(dòng)脈粥樣化斑塊形成[4]，但其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過高脂肪飲食誘導(dǎo)ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化，探究紅景天苷對(duì)ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響，并初步探討所涉及的相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源及藥物 8周齡雄性ApoE(-/-)小鼠50只(體重18～22 g)購自北京生命科學(xué)研究所，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(京)2015-0002。高脂肪食物(含15%脂肪、0.15%膽固醇)由北京生命科學(xué)研究所提供。紅景天苷(純度>98%)購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111575-200502。

1.2 動(dòng)物分組及處理 隨機(jī)選取10只小鼠作為正常飲食組(ND組)，接受標(biāo)準(zhǔn)飲食。另外40只小鼠接受高脂飲食(小鼠食物中含15%脂肪、0.15%膽固醇)，持續(xù)8周。造模完成后，將高脂飲食小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只：模型組(HFD組)、低劑量紅景天苷處理組(L-SAL組)、高劑量紅景天苷處理組(H-SAL)、AMPK激活劑組(AC組)。

根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行紅景天苷劑量選擇。L-SAL組和H-SAL組分別灌服紅景天苷30、50 mg/kg，1次/d，連續(xù)給藥8周。根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]，AC組腹腔注射AMPK激活劑A-769662(可直接使AMPK磷酸化) 30 mg/kg，1次/d，連續(xù)給藥8周。ND組和HFD組給予等體積蒸餾水。

1.3 血糖和血清脂質(zhì)分析 紅景天苷治療8周后，采用葡萄糖監(jiān)測(cè)儀(Life Scan，加拿大)測(cè)量小鼠空腹血糖(FBG)水平。禁食12 h后，取小鼠尾靜脈血2 mL，4 ℃ 3 500 r/min離心20 min，分離血清，-80 ℃儲(chǔ)存。采用脂肪酸和脂質(zhì)代謝試劑盒(美國Sigma-aldrich)測(cè)量血清總膽固醇(TC)、HDL-c、LDL-c和三酰甘油(TG)。

1.4 ApoE(-/-)小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮性舒張功能測(cè)定 紅景天苷治療8周后，每組隨機(jī)選取4只小鼠進(jìn)行內(nèi)皮依賴性舒張功能測(cè)定。小鼠注射60 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，經(jīng)腹部除毛、消毒后，剪開腹腔暴露臟器，經(jīng)后腔靜脈放血處死，于體視顯微鏡下取主動(dòng)脈血管鞘及周圍結(jié)締組織，浸泡于Krebs液中，剪成若干段長(zhǎng)約4 mm的主動(dòng)脈血管環(huán)。將每只小鼠各取3段血管環(huán)連接至JH-2張力換能器，采用BL-420S生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄血管張力變化作為基礎(chǔ)值。將血管環(huán)置于HV-4離體恒溫器官灌流系統(tǒng)的浴槽中，通入含5% CO2的O2，給予血管環(huán)0.5 g張力負(fù)荷，待血管環(huán)張力平衡后，加入10-6mmol/L去甲腎上腺素溶液進(jìn)行預(yù)刺激，平衡后，依次加入10-9～10-4mmol/L氯化乙酰膽堿(ACh)，記錄每一濃度下血管環(huán)張力變化，取3個(gè)血管環(huán)的平均張力，內(nèi)皮依賴性舒張度=[(最大張力-各濃度點(diǎn)張力)/(最大張力-基礎(chǔ)值)] ×100%。經(jīng)37 ℃ Krebs液灌洗2次后，換為濃度為10-9～10-4mmol/L硝普鈉(SNP)刺激血管環(huán)，非內(nèi)皮依賴性血管舒張度=(SNP誘發(fā)的血管環(huán)張力-加入ACh后的張力)/SNP誘發(fā)的血管環(huán)張力×100%。

1.5 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剩余小鼠禁食12 h后，處死。取小鼠主動(dòng)脈根部組織，一部分組織置于-80 ℃保存，用于蛋白免疫印跡檢測(cè)。另一部分組織于4%多聚甲醛中固定，行蘇丹Ⅳ染色，或經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋后，行HE染色、Masson染色、免疫組織化學(xué)分析。

1.6 ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變分析 取經(jīng)4%多聚甲醛固定的組織，用蘇丹Ⅳ染色以確定病變面積。由Sony 3-CCD攝像機(jī)采集圖像，并使用ImagePro圖像分析軟件(Media Cybernatic Inc.，美國)進(jìn)行分析。以病變(紅色)覆蓋的總主動(dòng)脈表面積的百分比表示動(dòng)脈粥樣硬化病變形成的程度。取石蠟包埋組織，用切片機(jī)(Microtome International，德國)連續(xù)切片(4 μm)，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson染色，于顯微鏡下觀察。使用Image-Pro 圖像分析軟件進(jìn)行分析。

1.7 免疫組織化學(xué)分析 石蠟包埋組織連續(xù)切片(4 μm)后，經(jīng)脫蠟、干燥后，于常溫下保存，行抗p-AMPKα(Thr172)、抗p-PI3K、抗p-Akt、抗p-eNOS(Ser1177)免疫組織化學(xué)染色。DAB顯色試劑盒購自上?；蚩萍加邢薰荆筽-AMPKα(Thr172)、抗p-PI3K、抗p-Akt、抗p-eNOS(Ser1177)單克隆抗體購自Cell Signaling Technology。免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞計(jì)算方法如下：在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇3個(gè)海馬區(qū)域視野(放大倍數(shù)×400)，拍攝數(shù)字圖像并進(jìn)行染色，根據(jù)視野內(nèi)的平均光密度值(MOD)進(jìn)行計(jì)算。

1.8 蛋白免疫印跡分析 使用補(bǔ)充有PMSF(Riche)的RIPA蛋白提取試劑(Beyotime)從組織中提取蛋白質(zhì)。4 ℃下12 000 r/min離心10 min，10% SDS-PAGE分離上清液，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Sigma)上。將膜在PBS和5%脫脂乳中封閉1 h，并用抗p-AMPKα (Thr172)、抗AMPKα、抗p-PI3K、抗p-Akt、抗Akt、抗p-eNOS (Ser1177)、抗eNOS和內(nèi)部對(duì)照GAPDH (Cell Signaling Technology)的特異性一抗與膜于4 ℃孵育過夜。將膜用HRP綴合的二抗(Cell Signaling Technology)在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑(Thermo Scientific，Waltham，MA)定量免疫復(fù)合物的量。使用Quantity One軟件(Life Technologies)評(píng)估相對(duì)蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對(duì)ApoE(-/-)小鼠血脂及血糖的影響 四組小鼠FBG、HDL-c、TG水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HFD組、L-SAL組、H-SAL組小鼠TC、LDL-c水平高于ND組(P<0.05)。AC組、L-SAL組、H-SAL組小鼠TC、LDL-c水平與HFD組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 紅景天苷對(duì)ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響

2.2.1 蘇丹Ⅳ染色 應(yīng)用蘇丹Ⅳ染色評(píng)估紅景天苷對(duì)ApoE(-/-)小鼠主動(dòng)脈病變程度的影響。與ND組相比，HFD組小鼠主動(dòng)脈根部組織經(jīng)蘇丹Ⅳ染色為紅色；與HFD組相比，AC組、L-SAL組和H-SAL組小鼠主動(dòng)脈根部蘇丹Ⅳ染色為紅色區(qū)域的面積減少。以病變覆蓋總主動(dòng)脈表面積的百分比表示動(dòng)脈粥樣硬化病變形成的程度，與HFD組相比，AC組、L-SAL組和H-SAL組小鼠病變區(qū)面積均顯著降低，且H-SAL組顯著低于L-SAL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。H-SAL組與AC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

圖1 ApoE(-/-)小鼠主動(dòng)脈根部病變面積(n=6)

注：*與ND組比較，P<0.05；#與HFD組比較，P<0.05；Δ與AC組比較，P<0.05；&與L-SAL組比較，P<0.05

表1 紅景天苷對(duì)ApoE(-/-)小鼠血脂及血糖的影響

注：與ND組相比，*P<0.05

2.2.2 HE染色 應(yīng)用HE染色評(píng)估紅景天苷對(duì)ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的影響。與ND組相比，HFD組小鼠HE染色可見主動(dòng)脈根部?jī)?nèi)膜出現(xiàn)凸向管腔的粥樣硬化斑塊，管腔面積減少，斑塊明顯增加；與HFD組小鼠相比，AC組、L-SAL組和H-SAL組主動(dòng)脈根部斑塊明顯減少。以動(dòng)脈粥樣硬化斑塊占主動(dòng)脈瓣面積的百分比表明動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積，與HFD組相比，AC組、L-SAL組和H-SAL組小鼠斑塊面積均縮小，且H-SAL組顯著低于L-SAL組(P<0.05)。H-SAL組與AC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 ApoE(-/-)小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積(n=6)

注：*與ND組比較，P<0.05；#與HFD組比較，P<0.05；Δ與AC組比較，P<0.05；&與L-SAL組比較，P<0.05

2.2.3 Masson染色 應(yīng)用Masson染色評(píng)估紅景天苷對(duì)ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膠原的影響。與ND組比較，HFD小鼠主動(dòng)脈根部病變部位Masson染色顯示，膠原藍(lán)色染色明顯減少；與HFD組小鼠比較，AC組、L-SAL組、H-SAL組小鼠斑塊內(nèi)膠原藍(lán)色染色明顯增加。以藍(lán)色陽性染色面積百分比表明斑塊內(nèi)膠原含量，與HFD組相比，AC組、L-SAL組、H-SAL組小鼠膠原含量顯著增加，且H-SAL組顯著高于L-SAL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。H-SAL組與AC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 ApoE(-/-)小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)膠原含量 (n=6)

注：*與ND組比較，P<0.05；#與HFD組比較，P<0.05；Δ與AC組比較，P<0.05；&與L-SAL組比較，P<0.05

2.3 紅景天苷對(duì)ApoE(-/-)小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響 與ND組比較，HFD組小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮依賴性舒張功能顯著降低(P<0.05)；與HFD組比較，AC組、L-SAL組、H-SAL組小鼠內(nèi)皮依賴性舒張功能均顯著增加(P<0.05)；H-SAL組與AC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。五組小鼠間非內(nèi)皮依賴性舒張功能差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

2.4 紅景天苷對(duì)ApoE(-/-)小鼠主動(dòng)脈中p-AMPKα、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS蛋白表達(dá)的影響 各組組織中均顯示p-AMPKα、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS蛋白陽性表達(dá)。與ND組相比，HFD組p-AMPKα(Thr172)、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS(Ser1177)MOD值均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HFD組相比，AC組、L-SAL組、H-SAL組p-AMPKα(Thr172)、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS(Ser1177)MOD值顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。H-SAL組與AC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

圖4 ApoE(-/-)小鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)皮依賴性舒張功能(n=4)

注：A.內(nèi)皮依賴性舒張功能測(cè)定，B.非內(nèi)皮依賴性舒張功能測(cè)定。*與ND組比較，P<0.05；#與HFD組比較，P<0.05；Δ與AC組比較，P<0.05；&與L-SAL組比較，P<0.05

圖5 ApoE(-/-)小鼠主動(dòng)脈中p-AMPKα、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS蛋白表達(dá)(n=6)

2.5 紅景天苷對(duì)ApoE(-/-)小鼠主動(dòng)脈中AMPK/PI3K/Akt/eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響 與ND組比較，HFD組p-AMPKα(Thr172)、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS(Ser1177)蛋白表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HFD組比較，AC組、L-SAL組和H-SAL組p-AMPKα(Thr172)、p-PI3K、p-Akt、p-eNOS(Ser1177)蛋白表達(dá)顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。H-SAL組與AC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖6。

圖6 ApoE(-/-)小鼠主動(dòng)脈AMPK、PI3K、Akt、eNOS磷酸化水平檢測(cè)(n=6)

3 討論

ApoE(-/-)小鼠是常用的研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制的動(dòng)物模型。本研究選用8周齡雄性ApoE(-/-)小鼠，通過高脂飲食構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型，結(jié)果顯示，與正常飲食小鼠相比，HFD組小鼠表現(xiàn)出動(dòng)脈粥樣硬化病變，主動(dòng)脈根部?jī)?nèi)膜出現(xiàn)凸向管腔的粥樣硬化斑塊，且斑塊內(nèi)膠原明顯減少，表明造模成功。

藥理學(xué)研究證實(shí)，紅景天苷對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)具有良好的保護(hù)作用，且具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[7]。國內(nèi)有關(guān)研究表明，紅景天苷可以降低低密度脂蛋白受體缺陷小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能夠改善高脂肪飲食ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變情況，使主動(dòng)脈根部的粥樣硬化斑塊減少，且增加斑塊內(nèi)膠原含量，提示紅景天苷對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化有一定的治療作用。然而，紅景天苷對(duì)ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化治療作用的相關(guān)機(jī)制尚不明確。

血管內(nèi)皮損傷及功能紊亂是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程的關(guān)鍵影響因素之一，主要表現(xiàn)為一氧化氮(NO)合成減少。NO在內(nèi)皮生物學(xué)中起重要作用，參與多種內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)，包括血管舒張、細(xì)胞增殖、衰老和凋亡等[9]。本研究通過測(cè)定內(nèi)皮依賴性舒張功能來評(píng)估內(nèi)皮功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ND組和HFD組小鼠非內(nèi)皮依賴性舒張功能差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而內(nèi)皮依賴性舒張功能差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)血管舒張反應(yīng)差異是由內(nèi)皮功能異常引起的。HFD組小鼠內(nèi)皮依賴性舒張功能顯著下降，然而，經(jīng)紅景天苷處理后，小鼠內(nèi)皮依賴性舒張功能顯著改善，提示紅景天苷可能通過保護(hù)血管內(nèi)皮功能來改善ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化。

內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)是合成NO的關(guān)鍵酶，其活化能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO，NO進(jìn)一步發(fā)揮舒張血管效應(yīng)，從而對(duì)抗內(nèi)皮功能失調(diào)。eNOS活性受eNOS-Ser1177和eNOS-Thr495磷酸化的影響[10]。腺苷-磷酸蛋白激酶(AMPK)是由α、β、γ亞基組成的異源三聚體絲氨酸/蘇氨酸激酶，其級(jí)聯(lián)活化能夠增加細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的保護(hù)作用[11]。已證實(shí)，在營養(yǎng)過度和肥胖模型中，AMPK信號(hào)通路的失調(diào)能夠?qū)е麓x紊亂，并促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙的發(fā)展[12]。在心血管系統(tǒng)中，AMPK活化能夠使eNOS Ser1177位點(diǎn)磷酸化，磷酸化的eNOS進(jìn)一步與熱休克蛋白(HSP)-90結(jié)合，增加eNOS含量，使NO釋放增加，從而改善內(nèi)皮功能[13-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中，AMPK激活通過Akt-eNOS和/或PI3K/Akt/eNOS刺激eNOS Ser1177位點(diǎn)磷酸化，促進(jìn)NO產(chǎn)生[15]。上述研究表明，AMPK及其下游級(jí)聯(lián)PI3K-Akt-eNOS在內(nèi)皮功能中起重要調(diào)控作用。近年研究表明，高脂肪飲食能夠減少內(nèi)皮AMPK磷酸化，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的PI3K-Akt-eNOS通路的下調(diào)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，HFD組ApoE(-/-)小鼠p-AMPKα(Thr172)、p-Akt、p-PI3Kα-110、p-eNOS(Ser1177)蛋白表達(dá)水平均顯著降低，提示動(dòng)脈硬化小鼠中AMPK/PI3K/Akt/eNOS信號(hào)級(jí)聯(lián)的抑制。既往研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷通過激活eNOS來緩解同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙[17]。與此一致，本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能夠活化Ser1177位點(diǎn)，增加eNOS的磷酸化。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能夠激活A(yù)MPKα(Thr172)、Akt、PI3Kα-110蛋白的磷酸化，且與AMPK激活劑A-769662作用效果一致。提示紅景天苷能夠促使動(dòng)脈硬化小鼠中AMPK/PI3K/Akt/eNOS信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活。結(jié)合相關(guān)研究結(jié)果，推測(cè)紅景天苷使動(dòng)脈硬化ApoE(-/-)小鼠內(nèi)皮AMPKα-Thr172的磷酸化水平增加，其下游級(jí)聯(lián)的PI3K/Akt信號(hào)通路被激活，使eNOS(Ser1177)磷酸化水平增加，促進(jìn)NO釋放，從而緩解血管內(nèi)皮功能障礙，改善ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變。

血脂異常與血管內(nèi)皮損傷往往并存，也是引起動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因之一[18]，血清TC和LDL-c升高是動(dòng)脈硬化的危險(xiǎn)因素之一[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，HFD組小鼠血清TC和LDL-c水平顯著增加，提示血脂異常可能參與高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化過程。紅景天苷處理雖然改善了小鼠動(dòng)脈粥樣硬化，然而對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化ApoE(-/-)小鼠血清TC和LDL-c水平無明顯影響，表明紅景天苷對(duì)ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的影響與血脂水平的改變無明顯關(guān)系。

綜上所述，紅景天苷能夠通過激活A(yù)MPK/PI3K/Akt/eNOS信號(hào)級(jí)聯(lián)，改善與eNOS活化相關(guān)的血管內(nèi)皮功能，從而減輕ApoE(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變。

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