陶 健

0 引言

芪歸通便合劑是我院的醫(yī)院制劑，由炙黃芪、酒肉蓯蓉、白術(shù)、升麻等十味中藥材提取加工而成。方中黃芪、白術(shù)補(bǔ)肺健脾，當(dāng)歸補(bǔ)血活血為君藥；肉桂溫通血脈，肉蓯蓉、制首烏滋補(bǔ)肝腎、調(diào)和氣血、潤(rùn)腸通便為臣藥；佐以炒決明子、炒火麻仁潤(rùn)腸通便，升麻、陳皮調(diào)理氣機(jī)、健脾通便。諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)血、滋補(bǔ)肝腎、潤(rùn)腸通便的功效。中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，單一成分難以控制產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性和均一性，為確保產(chǎn)品批次間的穩(wěn)定和臨床用藥的安全有效，本文采用HPLC波長(zhǎng)切換法對(duì)芪歸通便合劑中主藥黃芪所含主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素，白術(shù)所含主要成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，酒肉蓯蓉所含主要成分松果菊苷和毛蕊花糖苷進(jìn)行同時(shí)測(cè)定研究，填補(bǔ)了芪歸通便合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在高效液相色譜法研究的空白。

1 儀器與試藥

HP-1100型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；AB104-N型電子天平(南京庚辰科學(xué)儀器有限公司)。芪歸通便合劑來源于平頂山市中醫(yī)醫(yī)院(每瓶裝500 mL，批號(hào)：20161216、20170120、20170216、20170307、20170401、20170426、20170509、20170529、20170612、20170627)；松果菊苷對(duì)照品(82854-37-3)來源于上海純優(yōu)生物科技有限公司；毛蕊花糖苷對(duì)照品(111530-201512)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(111920-201606)、芒柄花素對(duì)照品(111703-201504)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品(111978-201501)和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)照品(111975-201501)均來源于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇和乙腈為色譜純，甲酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相A：甲醇-乙腈(1∶1)，流動(dòng)相B：0.1%甲酸溶液，梯度洗脫(0～10 min，23.0%A；10～18 min，23.0%A→30.0%A；18～27 min，30.0%A→42.0%A；27～35 min，42.0%A→65.0%A；35～40 min，65.0%A→23.0%A)；0～18 min時(shí)在330 nm[1-2]波長(zhǎng)下檢測(cè)松果菊苷和毛蕊花糖苷，18～27 min在254 nm[3]波長(zhǎng)下檢測(cè)毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素，27～40 min在220 nm[4-5]波長(zhǎng)下檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ。在此系統(tǒng)條件下，理論塔板數(shù)按所測(cè)色譜峰計(jì)均不低于3 500，分離度大于1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ各適量，分別用甲醇溶解并制成單一成分的對(duì)照品儲(chǔ)備液(各成分質(zhì)量濃度分別為松果菊苷2.418 mg/mL、毛蕊花糖苷1.102 mg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.510 mg/mL、芒柄花素0.788 mg/mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 0.416 mg/mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ 0.382 mg/mL)；依次精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液松果菊苷2.5 mL、毛蕊花糖苷2.5 mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.0 mL、芒柄花素2.5 mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 2.5 mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ 2.5 mL，置同一50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成測(cè)定用混合對(duì)照品溶液(所測(cè)各成分質(zhì)量濃度分別為松果菊苷0.120 9 mg/mL、毛蕊花糖苷0.055 1 mg/mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.010 2 mg/mL、芒柄花素0.039 4 mg/mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ 0.020 8 mg/mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ 0.019 1 mg/mL)。

2.2.2 供試品溶液和陰性對(duì)照溶液的制備 精密吸取芪歸通便合劑3.0 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為芪歸通便合劑供試品溶液。依據(jù)芪歸通便合劑處方和制備工藝，分別制備不含炙黃芪的陰性樣品、不含酒肉蓯蓉的陰性樣品和不含白術(shù)的陰性樣品，再按照芪歸通便合劑供試品溶液制備方法，分別制成黃芪陰性對(duì)照溶液、肉蓯蓉陰性對(duì)照溶液和白術(shù)陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于6個(gè)20 mL容量瓶中，分別用甲醇稀釋至刻度，制成6個(gè)濃度梯度的混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)，松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表1。

2.3.2 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取黃芪陰性對(duì)照溶液、肉蓯蓉陰性對(duì)照溶液、白術(shù)陰性對(duì)照溶液、混合對(duì)照品溶液和芪歸通便合劑供試品溶液各適量，依法進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果表明，松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ相互測(cè)定均無干擾，且陰性對(duì)6個(gè)成分的測(cè)定無干擾，色譜圖見圖1。

表1 6個(gè)成分的回歸方程和線性范圍

圖1 混合對(duì)照品(A)、芪歸通便合劑(B)、肉蓯蓉陰性(C)、黃芪陰性(D)、白術(shù)陰性(E)色譜圖

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的峰面積，結(jié)果所測(cè)6個(gè)組分峰面積的RSD依次為0.95%、1.08%、1.36%、1.03%、0.79%、1.45%。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取芪歸通便合劑(批號(hào)：20161216)6份，按照供試品溶液制備過程分別制成重復(fù)性試驗(yàn)供試品溶液，依法進(jìn)樣檢測(cè)，分別計(jì)算松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的含量，并計(jì)算所測(cè)6個(gè)組分含量的RSD，結(jié)果所測(cè)6個(gè)組分含量的RSD依次為1.22%、0.37%、1.79%、0.53%、1.34%、1.65%。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的芪歸通便合劑(批號(hào)：20161216)適量，精密吸取9份，每份1.5 mL，分別置25 mL量瓶中，依據(jù)中國(guó)藥典2015年版四部《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》，分別加入0.834 mg/mL松果菊苷對(duì)照品溶液1.0 mL 3份、2.0 mL 3份、3.0 mL 3份，0.387 mg/mL毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液1.0 mL 3份、2.0 mL 3份、3.0 mL 3份，0.132 mg/mL毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液0.5 mL 3份、1.0 mL 3份、1.5 mL 3份，0.421 mg/mL芒柄花素對(duì)照品溶液0.5 mL 3份、1.0 mL 3份、1.5 mL 3份，0.292 mg/mL白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)照品溶液0.5 mL 3份、1.0 mL 3份、1.5 mL 3份，0.214 mg/mL白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)照品溶液0.5 mL 3份、1.0 mL 3份、1.5 mL 3份，按照芪歸通便合劑供試品溶液制備方法制成高、中、低3種濃度，每種濃度3份的加樣回收樣品溶液，依法進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算這6個(gè)組分的平均加樣回收率及RSD值，結(jié)果見表2。

2.4 樣品含量測(cè)定 取批號(hào)分別為20161216、20170120、20170216的芪歸通便合劑，按“2.2.2”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依法進(jìn)樣檢測(cè)松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

在流動(dòng)相的選擇時(shí)，本實(shí)驗(yàn)首先考察對(duì)比了甲醇-水體系[5]、乙腈-水體系、甲醇-乙腈(1∶1)與水體系[6]，結(jié)果甲醇-乙腈(1∶1)與水體系所測(cè)各成分的分離效果優(yōu)于甲醇-水體系和乙腈-水體系，但所測(cè)成分松果菊苷、毛蕊花糖苷峰形欠佳，存在拖尾現(xiàn)象；在此基礎(chǔ)上，對(duì)比考察了甲醇-乙腈(1∶1)與0.1%甲酸溶液體系[1-3]、甲醇-乙腈(1∶1)與0.2%磷酸溶液[4,7-8]、甲醇-乙腈(1∶1)與1%醋酸溶液體系[9-10]，以色譜峰基線的平穩(wěn)情況、所測(cè)各成分的峰形和分離度為綜合考察指標(biāo)，最終確定采用甲醇-乙腈(1∶1)與0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相，同時(shí)對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行摸索，最終確定了采用“2.1”項(xiàng)下的色譜條件對(duì)芪歸通便合劑中松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

表2 松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ回收率

表3 含量測(cè)定結(jié)果(n=3，mg/mL)

從試驗(yàn)結(jié)果來看，在相同的生產(chǎn)工藝和測(cè)定方法下，不同批次芪歸通便合劑所含松果菊苷、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ存在一定的差異，可能與不同批次芪歸通便合劑所用中藥材中相關(guān)成分含量的差異有關(guān)，因此，建立芪歸通便合劑中多成分同時(shí)測(cè)定方法，并對(duì)所用中藥材制定符合該制劑的內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)勢(shì)在必行，從而有效保證芪歸通便合劑質(zhì)量的穩(wěn)定性，確保臨床用藥的安全有效。根據(jù)10個(gè)批次芪歸通便合劑所測(cè)各成分含量平均值的80%，暫定芪歸通便合劑每1 mL含酒肉蓯蓉以松果菊苷計(jì)不得少于0.85 mg，以毛蕊花糖苷計(jì)不得少于0.40 mg；含炙黃芪以毛蕊異黃酮葡萄糖苷計(jì)不得少于0.07 mg，以芒柄花素計(jì)不得少于0.23 mg；含白術(shù)以白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ計(jì)不得少于0.16 mg，以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ計(jì)不得少于0.11 mg。本實(shí)驗(yàn)采用波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定芪歸通便合劑中6種成分的含量，方法靈敏度高，檢測(cè)操作方法簡(jiǎn)便，對(duì)控制芪歸通便合劑產(chǎn)品質(zhì)量的均一性和療效一致性提供了理論基礎(chǔ)及數(shù)據(jù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S] .北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:103-104,135,302-303.

[2] 田玉彪,楊廣安,黃維杰,等.HPLC測(cè)定肉蓯蓉微粉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量[J] .安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(33):171-173.

[3] 付娟,楊世海,黃林芳.超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定黃芪中6種黃酮類成分的含量[J] .中國(guó)藥學(xué)雜志,2013,48(11):916-919.

[4] 劉青青,金傳山,吳德玲,等.不同加工工藝對(duì)白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的影響[J] .安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,31(1):58-61.

[5] 許祥君,陳敏,宗露,等.不同品規(guī)白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ的含量測(cè)定[J] .中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2011,31(17):1421-1424.

[6] 紀(jì)松崗,李翔,婁子洋,等.高效液相色譜法測(cè)定黃芪中毛蕊異黃酮苷和芒柄花素的含量[J] .第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,27(1):81-84.

[7] 王波,周圍,劉小花,等.基于超高效合相色譜對(duì)黃芪中5種主要黃酮類化合物的快速檢測(cè)[J] .分析化學(xué),2016,44(5):731-739.

[8] 李志浩,瞿京紅,劉菁,等.高效液相色譜法測(cè)定固本咳喘片中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量[J] .湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,13(4):33-35.

[9] 張思巨,劉麗,于江泳,等.HPLC同時(shí)測(cè)定肉蓯蓉藥材中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量[J] .中國(guó)藥學(xué)雜志,2004,39(10):740-741.

[10] 陳敏,肖蘇萍,崔光紅,等.管花肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量測(cè)定[J] .中國(guó)中藥雜志,2005,30(11):839-841.