劉凌燕 陳志宇 曾還雄 林培彬 金小寶

（廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院 廣東省生物活性藥物研究重點實驗室，廣州 510006）

昆蟲是自然界中最大的生物種群，約占整個生物種類的85%，諸多昆蟲還具有很高的藥用價值［1-2］。蜚蠊（Blatta）是傳統(tǒng)的中藥材，俗名“蟑螂”，為節(jié)肢動物門昆蟲綱蜚蠊目昆蟲。主要分布于我國廣東、福建、云南、廣西等南部地區(qū)，大多具有家棲或半家棲習(xí)性，是一種生命力和繁衍能力都特別強的昆蟲類群，文獻(xiàn)報道其體內(nèi)也存在大量內(nèi)生微生物［3］。微桿菌（Microbacterium）大多存在于土壤、污水、乳制品中，有關(guān)昆蟲腸道內(nèi)生微桿菌的報道很少見。我們課題組從蜚蠊代表性蟲種美洲大蠊（Periplaneta Americana）腸道中分離得到了8株微桿菌，并發(fā)現(xiàn)有6株微桿菌對常見致病細(xì)菌和真菌的生長具有抑制作用，現(xiàn)對整個分離純化、分子生物學(xué)鑒定和抑菌活性實驗等過程進(jìn)行如下報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 昆蟲樣品采集 廣東省廣東藥科大學(xué)室外捕捉野生美洲大蠊，觀察其形態(tài)特征，經(jīng)廣東藥科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室老師鑒定，與美洲大蠊成蟲體貌特征相符合，鑒定為美洲大蠊（Periplaneta americana）。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌株分離采用高氏合成I號培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），為了抑制真菌和其他細(xì)菌的生長，加入了65 μg/mL的重鉻酸鉀；菌株純化和保藏采用不含抗生素的高氏合成I號培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；菌株發(fā)酵采用鏈霉菌培養(yǎng)基2號（ISP-2）：葡萄糖4 g，酵母提取物4 g，麥芽提取物10 g，無菌水1 000 mL，pH7.2-7.4；種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，酵母提取物2 g，胰蛋白胨12 g，無菌水1 000 mL，pH7.2-7.4。

1.1.3 供試菌株 包括4株細(xì)菌和4株真菌，分別為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillinresistant S.Aureus ATCC 25213）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis ATCC 6633）、肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumoniae ATCC 13883），以及白色念珠菌（Candida albicans ATCC10231）、紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum NBRC 5467）、黑曲霉（Aspergillus niger ATCC16404）和煙曲霉（Aspergillus fumigatus ATCC16404）。

1.1.4 實驗試劑及儀器 Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）、Taq PCR Master mix、DNA Marker（TaKaRa 公 司 ）、PCR儀（美國Bio-Rad公司）、電泳儀（北京六一儀器廠）、GelDoc凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）、臺式高速離心機（Eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 蜚蠊腸道內(nèi)生微桿菌的分離純化與形態(tài)學(xué)觀察 采用表面消毒法對美洲大蠊進(jìn)行預(yù)處理：用蒸餾水將蟲體沖洗干凈；75%乙醇將蟲體漂洗1-2 min進(jìn)行消毒；無菌水沖洗3-5次；15%次氯酸鈉漂洗3 min；無菌水沖洗3-5次。剪去足、翅、觸角等部位，將其腹部從側(cè)面切開并取出腸道，放入勻漿器中進(jìn)行充分研磨。將研磨液采用倍比稀釋的方法逐步稀釋至所需濃度（1×10-3g/mL，2×10-3g/mL，4×10-3g/mL），每個濃度3個平行試驗。取200 μL均勻涂布于平板上，放置在28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3-7 d，參照《常見細(xì)菌鑒定手冊》［4］挑取平板上的目標(biāo)菌株的單菌落接種于鋪滿高氏I號培養(yǎng)基的平板上進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。經(jīng)純化后的菌株，同時采用插片法［5］和顯微鏡觀察的方法對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察。對純化后的8株內(nèi)生微桿菌進(jìn)行革蘭氏染色，用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.2 菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及同源性BLAST比對 參照Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書中的操作步驟提取8株蜚蠊腸道內(nèi)生微桿菌的DNA，采用通用保守引物（27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492r：TACGGCTAC CTTGTTACGACTT）［6-7］進(jìn)行目標(biāo)菌株 16S rDNA 基因擴增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：Taq PCR Master mix 25 μL，ddH2O 18 μL，上游引物、下游引物各2.5μL，模板DNA 2 μL，同時設(shè)立陰性對照組。反應(yīng)條件：94℃ 4 min、94℃ 30 s、57℃ 70 s、72℃ 30 s，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸 5 min后放置4℃保存。PCR得到的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。電泳條件：120 V，200 mA，15 min。將PCR產(chǎn)物交由上海上海英濰捷基公司進(jìn)行測序，將結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知的序列進(jìn)行 BLAST同源性比對。選取種屬接近和比對指標(biāo)靠前的16S rDNA序列，利用MEGA 5.0［8］軟件的鄰接法（Neighbor-Joining）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。采用Mothur DOS［9］工具劃分操作分類單元（OTU），與其他基因序列相似度低于98%定義為一個獨立的OUT，以此其進(jìn)行聚類分析。

1.2.3 蜚蠊腸道內(nèi)生微桿菌抑菌活性的篩選 將分離得到的微桿菌接種到種子培養(yǎng)基中，置于搖床中，28℃，180 r/min培養(yǎng)2 d，然后轉(zhuǎn)接到ISP-2培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)7 d。取出發(fā)酵液，于4℃臺式離心機4 000 r/min離心20 min。上清液用乙酸乙酯（1∶1.5）萃取3次，萃取后的有機層進(jìn)行懸蒸濃縮并稱重，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用牛津杯法進(jìn)行活性測定。將濃縮的粗提物配制成20 mg/mL的甲醇溶液，置于4℃?zhèn)溆?。每個含有受試菌的平板均勻放置4-5個牛津杯，每個牛津杯加200 μL抑菌液，陽性藥物分別為環(huán)丙沙星和兩性霉素B。細(xì)菌受試菌于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12-16 h，真菌受試菌于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，觀察牛津杯周圍有無抑菌圈，平行測定3次。

1.2.4 最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）的測定 采用微量稀釋法測定6株活性菌株粗提物對8株常見致病菌的MIC值［10］。真菌按照美國CLSI制定的標(biāo)準(zhǔn)方案［11］，用無菌研磨器將真菌的菌絲研磨均勻后置于無菌生理鹽水中，用計數(shù)板計數(shù)后使得細(xì)菌菌液濃度為108CFU/mL，真菌濃度為104CFU/mL。于不同96孔板的1-10列每孔中分別加入100 μL MHB液體培養(yǎng)基/RPMI-1640液體培養(yǎng)基用于細(xì)菌及真菌的培養(yǎng)，50 μL受試細(xì)菌/真菌菌液以及50 μL倍比稀釋后的32-0.0625 mg/mL的活性菌株粗提物溶液，第11列分別加入100 μL MHB液體培養(yǎng)基/RPMI-1640液體培養(yǎng)基作為生長對照孔，第12列加入200 μL MHB液體培養(yǎng)基/RPMI-1640液體培養(yǎng)基作為空白對照空。將細(xì)菌96孔板置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24 h，真菌96孔板置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-72 h，通過肉眼觀察，以無菌生長孔定義為該粗提物的MIC值。

1.2.5 蜚蠊腸道內(nèi)生微桿菌抗生素合成關(guān)鍵酶基因的篩選 參照Christiansen等［12-14］方法，利用Gen-Bank數(shù)據(jù)庫檢索已知Helogenase、非核糖體多肽合成酶（Nonribosomal peptide synthetase，NRPS）及多聚酮和酶（Polyketone synthase I，PKSI）的相關(guān)序列。利用ClustalW2進(jìn)行比對，比對結(jié)果經(jīng)Primer 5.0進(jìn)行在線引物設(shè)計，利用DNAman對設(shè)計得到的引物進(jìn)行功能評估后得出3對簡并引物：Helogenase（Halo-B4-FW ：TTCCCSCGSTACCASTCGGSGAG；Halo-B7-RV：GSGGGATSWMCCAGWACCASCC）、NRPS（A3F：GCSTACSYSATSTACACSTCSGG ；A7R ：SASGTCVCCSGTSCGGTAS）、PKSI（K1F：TSAAGTCSAACATCGGBCA；M6R：CGCAGGTTSCSGTACCAGTA）。對設(shè)計好的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：Taq PCR Master mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物各 1 μL，模板DNA 1 μL，同時設(shè)立陰性對照組。反應(yīng)條件：94℃3 min、94℃ 1 min、58℃ /55℃ /59℃ 2 min（FADH2/PKSI/NRPS）、72℃ 1 min，進(jìn)行 30/35 個（FADH2/PKSI、NRPS）循環(huán)；72℃延伸 5 min。PCR 得到的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。FADH2約700 bp，PKSI約750 bp，NRPS約900 bp。

2 結(jié)果

2.1 蜚蠊腸道內(nèi)生微桿菌的分離純化與形態(tài)學(xué)觀察

從藥用蜚蠊腸道中分離并經(jīng)過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定得到了8株腸道內(nèi)生微桿菌，將8株微桿菌在高氏合成I號培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線，于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3-4 d，觀察菌落顏色及形態(tài)。將各菌株分別進(jìn)行革蘭氏染色均呈陽性，菌株的革蘭氏染色結(jié)果如圖1所示，符合微桿菌的形態(tài)特征。

圖1 分離菌株的革蘭氏染色（10×100）

2.2 菌株16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建及同源性BLAST比對

將提取的8株微桿菌的DNA進(jìn)行PCR擴增，16S rDNA基因序列擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，目的基因擴增的片段為1 000-2 000 bp之間。通過BLAST比對，選取GenBank中與目標(biāo)菌株同源性高的已知菌株，利用MEGA 5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，如圖2所示。構(gòu)建出的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，8株微桿菌與其親緣關(guān)系最近的菌株的相似性均＞98%，其中WA12-1-7與其最親緣菌株的相似性高達(dá)100%，分析結(jié)果如表1所示。發(fā)育樹的分析結(jié)果進(jìn)一步確證了8株菌均為微桿菌。

圖2 目的菌株16S rDNA基因序列N-J系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 8株微桿菌與其最相近菌株的親緣關(guān)系

2.3 分離菌株次級代謝產(chǎn)物對6種病原菌的抑菌活性測定

在相同濃度條件下，分離得到的8株蜚蠊腸道內(nèi)生微桿菌中有6株微桿菌的次級代謝產(chǎn)物對一種或多種真菌和細(xì)菌均表現(xiàn)出了不同程度的抑菌活性，活性菌株占總分離菌株的75%。如表2-3所示，其中，對金黃色葡萄球菌有活性的菌株有4株；對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性的菌株有2株；對肺炎克雷伯桿菌有活性的菌株有1株；對枯草芽孢桿菌有活性的菌株有1株；對紅色毛癬菌有活性的菌株有2株；對黑曲霉有活性的菌株有2株。

2.4 活性菌株粗提物最低抑菌濃度的測定

通過對6株活性菌株粗提物進(jìn)行最低抑菌濃度（MIC）測定，得出不同濃度的菌株粗提物對8株常見病原菌具有不同程度的抑菌活性，其中活性較強的 為 WA12-1-13、WA12-1-13、WA12-1-13及WA12-1-25（表 4）。

2.5 部分抗生素合成關(guān)鍵酶基因篩選結(jié)果

經(jīng)過篩選得出8株蜚蠊腸道內(nèi)生微桿菌中有6株具有鹵化酶的陽性菌株，并且這6株菌菌對NRPS（約900 bp）及PKSI（約750 bp）表達(dá)為陽性（表5），表明這些菌株具有良好的合成聚酮類物質(zhì)或多肽類物質(zhì)的潛力。

表2 菌株粗提物抗細(xì)菌活性的篩選

表3 菌株粗提物抗真菌活性的篩選

表4 菌株粗提物MIC值的測定/（mg·mL-1）

表5 部分抗生素合成關(guān)鍵酶基因篩選結(jié)果

3 討論

近年來，有關(guān)昆蟲腸道微生物的研究報道逐漸增多，國內(nèi)外研究學(xué)者陸續(xù)從蜜蜂、甲殼蟲、白蟻等昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了具有抗菌活性的內(nèi)生菌［15-17］。本研究從藥用昆蟲蜚蠊腸道中分離得到了8株內(nèi)生微桿菌，微桿菌是一種稀有的放線菌，諸多文獻(xiàn)報道微桿菌主要用于修復(fù)被油污染的地表水［18］、印染廢水的處理［19］及有機脫硫［20］等，未見其有關(guān)其抗菌活性的報道。本實驗發(fā)現(xiàn)，有6株至少對其中一種病原菌具有抑菌活性，有5株對其中2種或2種以上的病原菌具有抑制活性，MIC值測定的結(jié)果也表明活性菌株粗提物對8株常見致病菌具有不同程度的抑菌活性，體現(xiàn)出了蜚蠊腸道內(nèi)生微桿菌次級代謝產(chǎn)物的廣譜抗菌活性。不同的抗菌譜也表明蜚蠊腸道內(nèi)生微桿菌能產(chǎn)生多種抗菌成分，而不是只有單一的活性成分。

目前，已發(fā)現(xiàn)且結(jié)構(gòu)明確的微生物次級低些產(chǎn)物高達(dá)50 000多個，具有活性的有20 000多個。其中，絕大多數(shù)為具有抗菌或抗腫瘤的鹵化次級代謝產(chǎn)物［21-22］。FADH2依賴性鹵化酶被認(rèn)為是鹵化次級代謝產(chǎn)物中最重要的鹵化酶［23］。本研究對8株微桿菌進(jìn)行FADH2依賴性鹵化酶基因篩選發(fā)現(xiàn)有6株呈陽性，為進(jìn)一步評估菌株產(chǎn)生鹵化次級代謝產(chǎn)物的潛力，以非核糖體多肽合成酶及I型聚酮合酶為例，進(jìn)一步進(jìn)行其他關(guān)鍵代謝酶基因的篩選，發(fā)現(xiàn)8株微桿菌全部對PKSI基因表達(dá)為陽性，3株對NRPS基因表達(dá)呈陽性，結(jié)合活性測定結(jié)果，進(jìn)一步證實菌株產(chǎn)生活性鹵化代謝產(chǎn)物的能力。本研究結(jié)果表明，蜚蠊腸道內(nèi)生微桿菌的次級代謝產(chǎn)物對細(xì)菌及真菌均有不同程度的抑菌活性，說明從微桿菌次級代謝產(chǎn)物中尋找新型活性化合物具有可行性。下一步擬采用柱層析、高效液相、質(zhì)譜、核磁共振等現(xiàn)代波譜技術(shù)對微桿菌抗菌活性物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實驗以8株美洲大蠊腸道內(nèi)生微桿菌為研究對象，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)6株微桿菌次級代謝產(chǎn)物對8種常見致病病原菌具有不同程度的抑制作用并從基因水平分析了其產(chǎn)生活性次級代謝產(chǎn)物的潛力。

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