翟逸舟 盧美雅 趙健 王富軍，3

（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2. 浙江日升昌藥業(yè)有限公司，東陽 322100；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 201203）

核糖體失活蛋白是一類存在于高等植物體內(nèi)的具有抗腫瘤活性的蛋白，如天花粉蛋白、苦瓜蛋白、白樹毒素［1-3］。其能對真核28S核糖體RNA的sarcin/ricin結(jié)構(gòu)域的特定位置（A-4324）的腺嘌呤核糖糖苷鍵切割，導(dǎo)致不可逆的核糖體失活［4］。白樹毒素（Gelonin）是一種來源于東亞熱帶森林中大戟科植物Gelonium muhiflorum種子中的蛋白，其分子量約為30 kD，屬于I型核糖體失活蛋白，具有拓?fù)洚悩?gòu)酶活、N-糖苷酶活等生物學(xué)活性［5］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，白樹毒素具有潛在的抗腫瘤活性，但是，由于Gelonin缺乏和細(xì)胞膜結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致Gelonin自身進(jìn)入細(xì)胞的效率極低，從而限制了其生物學(xué)活性的發(fā)揮［6］。因此將Gelonin高效運(yùn)送至細(xì)胞內(nèi)，提高其藥用價(jià)值顯得尤為重要［7-8］。

目前能攜帶大分子貨物（包括顯像劑、核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)等）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的載體主要有納米顆粒、脂質(zhì)體、CPP等。其中，由于CPP相對于納米顆粒和脂質(zhì)體具有安全、低毒和高效的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛研究［9-10］。CPP是一類能夠高效轉(zhuǎn)運(yùn)生物大分子進(jìn)入細(xì)胞的多肽，一般由不超過30個(gè)氨基酸組成，由于其組成中富含帶正電荷的堿性氨基酸，所以能與細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷的組成成分通過電荷作用而在細(xì)胞膜表面聚集［11］。經(jīng)典的CPP有TAT、R9等由于其具有較強(qiáng)的穿膜活性而被廣泛的研究報(bào)道［11-12］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)來源于人細(xì)胞外超氧化物歧化酶的肝素結(jié)合域HBD以及來源于人肝素結(jié)合表皮生長因子樣生長因子的（heparin binding peptide，HBP）也具有攜帶大分子蛋白藥物進(jìn)入細(xì)胞的能力［13-14］。為了提高Gelonin進(jìn)入細(xì)胞的效率以有效發(fā)揮其抗腫瘤活性，本課題首先通過熒光顯微鏡觀察4種CPP（TAT、R9、HBD、HBP）運(yùn)載EGFP進(jìn)入HeLa細(xì)胞的效率，并用FITC標(biāo)記Gelonin-CPP重組蛋白進(jìn)一步考察驗(yàn)證這四種CPP攜帶Gelonin進(jìn)入細(xì)胞的能力，隨后以MTT方法評價(jià)了四種Gelonin-CPP重組蛋白的抗腫瘤活性，從中篩選具有穿膜效率最高和抑殺腫瘤活性最強(qiáng)的Gelonin重組蛋白并進(jìn)行了該藥物抗腫瘤活性的分子機(jī)制研究。

1 材料與方法

1.1 材料

Gelonin基因由華大基因合成，構(gòu)建在表達(dá)質(zhì)粒pET28b上。所有表達(dá)宿主菌為BL21（DE3）。人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）、人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16）、人肝癌細(xì)胞（HepG2）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。EGFP-pET28a、EGFP-HBD-pET28a、EGFP-TAT-pET28a、EGFP-R9-pET28a和EGFP-HBP-pET28a均為實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá)載體構(gòu)建的相關(guān)引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）和噻唑藍(lán)（MTT）等均購自碧云天生物技術(shù)公司。序列測定由華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過PCR分別擴(kuò)增帶有酶切 位 點(diǎn) BamH I和 Xho I的 HBD、HBP、TAT、R9后，再用BamH I和Xho I雙酶切回收的PCR產(chǎn)物，與BamH I和Xho I雙酶切后的載體Gelonin-pET28b重組得到質(zhì)粒Gelonin-HBP-pET28b、Gelonin-R9-pET28b、Gelonin-HBD-pET28b、Gelonin-TAT-pET28b。以大腸桿菌DH5α為宿主菌轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒，以菌液為模板，用上述引物PCR擴(kuò)增，確定質(zhì)粒重組完成后，通過序列比對確認(rèn)重組序列的正確性。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，篩選得到陽性克隆后，接種到含50 μg/mL卡那霉素的30 mL的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h。然后將2%的菌液接種于200 mL的LB培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)，待菌液濃度OD600達(dá)到0.4-0.6時(shí)，加入1 mmol/L IPTG于16℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h。300 r/min離心20 min收集菌體，重懸于緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl、10% 甘油、0.5 mol/L NaCl、pH 8.5），然后超聲破碎，12 000 r/min離心后取上清液在Ni2+柱中親和純化。通過梯度洗脫后，用含有200 mmol/L咪唑的緩沖液收集目標(biāo)蛋白。經(jīng)過透析液（20 mmol/L Tris-HCl、10% 甘油、0.5 mol/L NaCl、pH 7.3）透析，用SDS-PAGE鑒定目標(biāo)蛋白。純化的重組蛋白經(jīng)除菌過濾后于-80℃保存。

1.2.3 體外細(xì)胞的培養(yǎng) 在37℃、5%的CO2濃度下，HeLa細(xì)胞株和B16細(xì)胞株使用RPMI-1640培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）培養(yǎng)，MCF-7細(xì)胞株和HepG2細(xì)胞株使用DMEM培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）培養(yǎng)。

1.2.4 熒光實(shí)驗(yàn)和激光共聚焦實(shí)驗(yàn) 將HeLa細(xì)胞接種在24孔板中并培養(yǎng)12 h。然后用FITC標(biāo)記1μmol/L的Gelonin融合蛋白（Gelonin，Gelonin-HBP、Gelonin-R9、Gelonin-HBD和 Gelonin-TAT）處理細(xì)胞24 h，隨后加入紅色熒光探針（Dil），孵育30 min，用PBS沖洗細(xì)胞3次，加入4%多聚甲醛（PFA）。固定30 min后，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，并用DAPI染色45 min。此后，通過激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）檢測Gelonin融合蛋白的細(xì)胞攝取。

1.2.5 流式細(xì)胞儀分析 HeLa細(xì)胞在6孔細(xì)胞板中培養(yǎng)24 h，加入融合蛋白共孵育12 h。用預(yù)冷PBS清洗兩次后用無EDTA胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀（激發(fā)波長Ex 488 nm、發(fā)射波長Em 530 nm）分析細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.2.6 Gelonin融合蛋白的生物學(xué)活性評價(jià) 將不同濃度（0.1 mg/μL和 0.5 mg/μL）的 Gelonin融合蛋白加入到20 μL反應(yīng)體系（1 g質(zhì)粒DNA、pH 8.5、20mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L MgCl2和 100 mmol/L KCl）中。在37℃下孵育4 h，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品，評價(jià)其拓?fù)洚悩?gòu)酶活性。N-糖苷酶活性按照TNT? T7/SP6 聯(lián)合兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物試劑盒（Qcbio科技公司，上海）操作。

1.2.7 藥物蛋白的體外細(xì)胞生長抑制試驗(yàn) 細(xì)胞按1×104接種于96孔細(xì)胞板中培養(yǎng)24 h，然后用不同濃度梯度的藥物分別孵育HeLa細(xì)胞（24 h）、B16細(xì)胞（24 h）、HepG2 細(xì)胞（48 h）和 MCF-7 細(xì)胞（48 h），棄去原有培養(yǎng)基，用5 mg/mL的MTT溶液在37℃孵育4 h。棄去MTT溶液后每孔加入120 μL二甲基亞砜（DMSO）。通過酶標(biāo)儀（吸收波長490 nm）測定每孔的吸光度以確定細(xì)胞存活率。藥物對腫瘤細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）通過GraphPad Prime 6軟件計(jì)算得到。

1.2.8 凋亡分析 將HeLa細(xì)胞接種在6孔板中孵育12 h。分別加入1 μmol/L的 Gelonin、Gelonin-HBP、Gelonin-HBD、Gelonin-TAT和 Gelonin-R9。處理 24h后，收獲細(xì)胞并用PBS洗滌兩次。然后將細(xì)胞重新懸浮于500 μL結(jié)合緩沖液中。此后，加入5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL碘化丙啶（PI），將細(xì)胞在20℃下在黑暗中孵育20 min。通過FACScan流式細(xì)胞儀對經(jīng)處理的樣品進(jìn)行分析。

1.2.9 Western blot 分 析 用 1 μmol/L 的 Gelonin、Gelonin-HBP、Gelonin-R9、Gelonin-HBD 和 Gelonin-TAT處理HeLa細(xì)胞24 h。通過裂解細(xì)胞獲得全細(xì)胞裂解物，并通過BCA蛋白測定試劑盒測量上清蛋白的濃度。用SDS加載緩沖液處理后，通過SDSPAGE分離樣品，然后將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜。轉(zhuǎn)移后，PVDF膜首先在5%的脫脂牛奶中在室溫下封閉2 h。然后將膜與特異性一抗在4℃孵育過夜。隨后，將辣根過氧化物酶綴合的抗體孵育1 h。通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對膜進(jìn)行顯像。

2 結(jié)果

2.1 CPP穿膜效率的研究

為了篩選穿膜效率高的CPP將Gelonin有效運(yùn)輸進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其活性，首先以EGFP為示蹤蛋白，考察不同CPP（HBD、HBP、TAT、R9）攜帶大分子蛋白EGFP的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率，將各種CPP與EGFP融合蛋白（5 μmol/L）分別與HeLa細(xì)胞共孵育12 h。通過熒光顯微鏡觀察各種CPP的穿膜效率，沒有連接CPP的EGFP在HeLa細(xì)胞內(nèi)沒有觀察到綠色熒光信號，而融合了CPP的EGFP在HeLa細(xì)胞內(nèi)都呈現(xiàn)了明顯的綠色熒光信號，其中EGFP-HBP在HeLa細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)的綠色熒光信號最強(qiáng)（圖1-A），表明HBP攜帶EGFP穿膜效率比經(jīng)典的CPP（TAT、R9）更強(qiáng)。采用流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果顯示，與沒有連接CPP的EGFP相比，融合了CPP的EGFP穿膜效率都有提高，EGFP-HBD、EGFP-TAT、EGFP-R9穿膜效率分別提高了5.11、2.51和3.83倍，其中EGFP-HBP的穿膜效率提升效果最顯著，提升了19.50倍（圖1-B），流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果與熒光顯微鏡觀察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖1 EGFP融合蛋白的熒光顯微鏡檢測（A）及流式細(xì)胞術(shù)檢測（B）

2.2 Gelonin重組蛋白的表達(dá)及生物活性研究

將Gelonin與不同的CPP進(jìn)行融合表達(dá)期望通過CPP將Gelonin高效轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部更好地發(fā)揮其抗腫瘤活性。按本實(shí)驗(yàn)1.2.1方法構(gòu)建獲得了帶有不同CPP的Gelonin重組表達(dá)質(zhì)粒：Gelonin-TAT-pET28b、Gelonin-R9-pET28b、Gelonin-HBD-pET28b、Gelonin-HBP-pET28b（圖2-A）。將其分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞中。按照1.2.2方法成功表達(dá)了Gelonin-CPP融合蛋白以及Gelonin蛋白，這5種重組蛋白在16℃的溫度下均為可溶形式表達(dá)，將重組蛋白通過Ni-NTA親和純化（圖2-B），獲得各目的重組蛋白 Gelonin（29.6 kD）、Gelonin-HBP（32.56 kD）、Gelonin-R9（31.47 kD）、Gelonin-TAT（31.4 kD）和Gelonin-HBD（34.23 kD）。純化的蛋白通過凝膠掃描軟件分析，純度均達(dá)到90%以上，無菌過濾后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

天然核糖體失活蛋白具有拓?fù)涫Щ钅芰蚇-糖苷酶活性，因此可通過超螺旋切割實(shí)驗(yàn)和體外翻譯抑制實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證融合有不同CPP（R9、TAT、HBD和HBP）的重組Gelonin蛋白的生物活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3-A）顯示，與單獨(dú)Gelonin重組蛋白相比，各種帶有CPP的Gelonin融合蛋白（Gelonin-HBP、Gelonin-R9、Gelonin-TAT和 Gelonin-HBD）都可將超螺旋雙鏈質(zhì)粒DNA切割成線性（L條帶）或切口環(huán)形（N條帶）形式，說明CPP功能域的引入沒有影響Gelonin蛋白本身的拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，且活性的高低與重組蛋白的濃度正相關(guān)。核糖體失活蛋白發(fā)揮抗腫瘤活是由于其具有N-糖苷酶活性，我們采用TNT?T7 / SP6聯(lián)合網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液系統(tǒng)檢測5種Gelonin融合蛋白（Gelonin-HBP、Gelonin-R9、Gelonin-TAT、Gelonin-HBD和Gelonin）對熒光素酶翻譯的抑制作用。結(jié)果（圖3-B）顯示所有Gelonin融合蛋白都可降低翻譯的螢光素酶的相對量，而且隨著濃度的升高N-糖苷酶活性均增強(qiáng)。因此，在Gelonin的羧基末端引入穿膜功能域R9、TAT、HBD和HBP后，仍然保留了原Gelonin蛋白本身具有的N-糖苷酶生物活性。

圖2 Gelonin融合蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建（A）及蛋白的SDSPAGE分析（B）

圖3 Gelonin融合蛋白拓?fù)洚悩?gòu)酶活性檢測（A）及N-糖苷酶活性檢測（B）

2.3 CPP運(yùn)輸Gelonin進(jìn)入細(xì)胞的穿膜效率分析

上述結(jié)果表明了CPP的引入不會影響Gelonin原有生物活性，實(shí)驗(yàn)隨后考察了4種CPP攜載Gelonin的效率是否與轉(zhuǎn)運(yùn)EGFP效率一致。以FITC標(biāo)記的各種Gelonin-CPP融合蛋白（Gelonin-HBP、Gelonin-R9、Gelonin-TAT、Gelonin-HBD 和 Gelonin）分別與HeLa細(xì)胞共孵育24 h，通過激光共聚焦掃描顯微鏡分析檢測胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖4-A所示，沒有融合CPP的Gelonin在HeLa細(xì)胞內(nèi)沒有呈現(xiàn)出明顯的FITC熒光信號，而帶有CPP 的Gelonin融合蛋白在HeLa細(xì)胞內(nèi)都可觀察到強(qiáng)烈的熒光信號，其中Gelonin-HBP在HeLa細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)的熒光信號最強(qiáng)。

采用流式細(xì)胞術(shù)定量分析結(jié)果與激光共聚焦檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致：與沒有連接CPP的Gelonin相比，融合了CPP的Gelonin穿膜效率都明顯提高，Gelonin-HBD、Gelonin-TAT、Gelonin-R9和 Gelonin-HBP穿膜效率分別提高了4.66、6.48、7.12和8.45倍，Gelonin-HBP的穿膜效率提升最顯著（圖4-B）。HBP高效運(yùn)載Gelonin進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與攜載EGFP結(jié)果一致（圖1）。

2.4 Gelonin重組蛋白抑制腫瘤細(xì)胞生長活性研究

在熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明連接有不同CPP的Gelonin穿膜能力都有明顯提升，隨后進(jìn)行了細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)（MTT法）來評價(jià)比較各種融合蛋白的抗腫瘤效果。將5種Gelonin融合蛋白（Gelonin、Gelonin-HBD、Gelonin-TAT、Gelonin-R9和Gelonin-HBP）通過增加劑量（0-3 μmol/L）的方式分別與腫瘤細(xì)胞共孵育來檢測對細(xì)胞生長的抑制活性。與未加重組蛋白的空白對照組相比，加入重組蛋白的不同腫瘤細(xì)胞的生長都受到了不同程度的抑制，且這種抑制作用都呈現(xiàn)出濃度依賴性。5種Gelonin融合蛋白在同樣濃度（3 μmol/L）下分別與4種腫瘤細(xì)胞共孵育，結(jié)果表明與沒有連接CPP的Gelonin相比，連接有CPP的Gelonin的抗腫瘤作用都有不同程度的提高（圖5），其中以Gelonin-HBP抑殺腫瘤細(xì)胞的效果最強(qiáng)，對于HeLa、HepG2、B16和MCF-7藥效分別可提升16.4、24.6、9.6和14.0倍（表1）。

圖4 FITC標(biāo)記Gelonin融合蛋白的激光共聚焦檢測（A）及流式細(xì)胞術(shù)檢測（B）

圖5 Gelonin融合蛋白對細(xì)胞存活率的影響

表1 Gelonin融合蛋白對不同腫瘤細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）

2.5 Gelonin重組蛋白對HeLa細(xì)胞的流式凋亡分析

由于Gelonin融合HBP后極大提高了Gelonin的抗腫瘤能力，為了闡明其對腫瘤細(xì)胞毒性影響的分子機(jī)制，我們將HeLa細(xì)胞分別與不同濃度（0.5、1.0 μmol/L）的Gelonin和Gelonin-HBP 孵育24 h后，以Annexin V-FITC/FACS法經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析測定。結(jié)果如圖6所示，隨著Gelonin和Gelonin-HBP蛋白的濃度增加，各試驗(yàn)組HeLa細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果為：Gelonin組的凋亡率依次為21.4%、23.5%；Gelonin-HBP組的凋亡率依次為41.3%、45.8%。這一結(jié)果表明，穿膜肽HBP的引入使得Gelonin-HBP蛋白引起細(xì)胞凋亡的作用顯著增強(qiáng)。

圖6 Gelonin重組融合蛋白對HeLa細(xì)胞的凋亡凋亡檢測

2.6 Gelonin重組蛋白對HeLa細(xì)胞凋亡通路的影響

為了進(jìn)一步研究Gelonin-HBP重組蛋白誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的內(nèi)在分子機(jī)制，分別將1.0 μmol/L的Gelonin和Gelonin-HBP作用HeLa細(xì)胞24 h后，通過Western blot方法對相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行分析。如圖7所示，相比于對照組，Gelonin處理組和Gelonin-HBP處理組的酶原形式（無活性）的Caspase 9、Caspase 3和Caspase 8含量均有下調(diào)，說明其被剪切，成了激活形式，其中Gelonin-HBP對Caspase 9、Caspase 3和Caspas8的激活更為顯著，并且Gelonin-HBP作用于HeLa細(xì)胞后比Gelonin本身更明顯上調(diào)Bax的表達(dá)，以及顯著下調(diào)Bcl-2的表達(dá)。

圖7 Western blot分析

3 討論

Gelonin（I型核糖體失活蛋白）由于缺乏和細(xì)胞膜結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞的效率極低，因而影響了其抗腫瘤作用［6］。因此，將Gelonin與不同的CPP進(jìn)行融合表達(dá)，從中篩選到具有高效自主穿膜運(yùn)輸能力，同時(shí)又保留Gelonin原有生物活性的重組融合蛋白，是本研究關(guān)注的重點(diǎn)。CPP已被證明為在體內(nèi)幫助生物大分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的一種有效工具，已成功開發(fā)和應(yīng)用的TAT、R9等［11-12］。在這些CPP中，人源性的CPP由于其低免疫原性已得到更多地關(guān)注和應(yīng)用［13-14］。將不同CPP與EGFP融合表達(dá)的穿膜效率檢測實(shí)驗(yàn)表明，肝素結(jié)合域HBP和HBD攜帶大分子蛋白EGFP對HeLa的穿膜效率要強(qiáng)于經(jīng)典CPP如TAT和R9。

本研究進(jìn)一步將Gelonin與經(jīng)典CPP如TAT、R9以及我們實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的HBD和HBP兩種人源性CPP融合后，都保留了原有的N-糖苷酶活性和拓?fù)洚悩?gòu)酶活性。以FITC標(biāo)記的不同Gelonin重組蛋白的穿膜效率檢測實(shí)驗(yàn)表明，CPP可大大增強(qiáng)Gelonin的內(nèi)化效率，且與經(jīng)典的CPP如R9和TAT相比，HBP攜帶Gelonin的穿膜效率更高，而Gelonin-HBD的穿膜效率大幅度的降低，這表明Gelonin和肝素結(jié)合域之間的相互匹配將影響重組蛋白的穿膜效率，從而導(dǎo)致其抗腫瘤活性下降。HBD的引入雖然沒有影響Gelonin的生物活性，但可能由于結(jié)構(gòu)域之間的影響導(dǎo)致Gelonin-HBD的內(nèi)化能力降低，說明CPP攜載藥物時(shí)需要考慮結(jié)構(gòu)域之間的相互作用。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相比于Gelonin（1 μmol/L）對HeLa細(xì) 胞 的 殺 傷 為6.9%，Gelonin-HBP（1 μmol/L）抑殺HeLa細(xì)胞的效果可提升7.82倍，達(dá)到了54%。同樣實(shí)驗(yàn)條件下流式細(xì)胞術(shù)定量分析表明Gelonin-HBP比單獨(dú)Gelonin的穿膜效果提升8.45倍，推測Gelonin融合蛋白抑殺毒性的增強(qiáng)主要是由于CPP的引入促進(jìn)了Gelonin重組蛋白對癌細(xì)胞穿膜滲透作用，其中HBP對Gelonin的穿膜運(yùn)輸能力最強(qiáng)，導(dǎo)致其對腫瘤細(xì)胞的抑殺作用也最明顯。

流式凋亡分析實(shí)驗(yàn)表明HBP的引入是通過加強(qiáng)Gelonin在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)凋亡的過程來實(shí)現(xiàn)的。線粒體途徑和死亡受體途徑是激活凋亡的兩個(gè)主要信號通路［15］。在線粒體途徑中，處于該通路上游酶原形式的Caspase 9的激活會促使通路下游酶原形式的Caspase 3被剪切成分子量小的激活形式，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，作為死亡受體途徑的發(fā)起者，Caspas 8的激活會導(dǎo)致細(xì)胞通過外在的凋亡通路發(fā)生凋亡。本研究表明，相比于Gelonin，Gelonin-HBP能更顯著的激活Caspase3、Caspase-9和Caspase-8。此外，屬于Bcl-2蛋白家族的Bax和Bcl-2在線粒體凋亡通路中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，Bax/Bcl-2比率的增加會促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放，進(jìn)而激活凋亡途徑［16-17］。免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察到Gelonin-HBP重組蛋白處理組的Bax/Bcl-2比率的上調(diào)均比單獨(dú)的Gelonin蛋白更明顯。以上結(jié)果表明了Gelonin融合蛋白誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡與線粒體信號通路和死亡受體信號通路相關(guān)，當(dāng)融合HBP后，可顯著激活Gelonin蛋白通過激活線粒體介導(dǎo)的和死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號通路誘導(dǎo)更多的HeLa細(xì)胞凋亡。本研究提出了對Gelonin引入與之相互匹配且能高效攜帶其穿膜的肝素結(jié)合域HBP的策略，可以顯著提高Gelonin的抗腫瘤治療效果，并第一次闡明了帶有CPP的Gelonin誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制，對推動(dòng)Gelonin的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過重組表達(dá)和篩選，獲得了具有高穿膜效率的Gelonin-HBP重組蛋白。腫瘤細(xì)胞生長的抑制實(shí)驗(yàn)表明，Gelonin-HBP在多種腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)出最好的抑殺腫瘤活性。對HeLa細(xì)胞中凋亡信號通路的分析顯示這種活性的提高是通過激活線粒體和死亡受體所介導(dǎo)的。

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