單婷婷 陳曉梅 郭順星 王倩清 王愛(ài)榮

（1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2. 魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，煙臺(tái)264025）

全世界約有蘭科石斛屬（Dendrobium）植物1 500多種［1］，我國(guó)有74種2變種，其中51種可作藥用［2］。我國(guó)2015版藥典規(guī)定，中藥鐵皮石斛的來(lái)源植物為鐵皮石斛（D. officinale Kimura et Migor），中藥石斛的來(lái)源植物包括金釵石斛（D. nobile Lindl）等多種同屬近似種［3］，藥材的藥用部位均為植物的新鮮或干燥莖［4］。石斛屬植物莖多糖含量普遍較高，其中鐵皮石斛莖多糖被認(rèn)為是藥材的主要有效成分。

高質(zhì)量RNA是開(kāi)展cDNA文庫(kù)構(gòu)建、熒光定量PCR檢測(cè)、Northern雜交等分子生物學(xué)研究的必要前提［5］。對(duì)于富含多糖的植物組織，傳統(tǒng)的RNA提取方法是經(jīng)過(guò)SDS-鹽酸胍處理去除多糖，或是在高濃度Na+或K+存在條件下，利用苯酚、氯仿抽提去除多糖，最后都通過(guò)LiCl沉淀RNA［6］。傳統(tǒng)方法存在多糖去除不完全［7］，LiCl沉淀導(dǎo)致RNA丟失，提取效率低，耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)［8］。目前多用試劑盒方法提取RNA。試劑盒法主要是利用異硫氰酸胍去除多糖。異硫氰酸胍是強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)變性劑，不僅能有效解離核蛋白和核酸的復(fù)合體，還能抑制RNA酶的活性［9］，且不易發(fā)生RNA丟失。與傳統(tǒng)方法相比，試劑盒法還具有操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)［10］。

植物的不同組織和器官，由于化學(xué)成分組成的差異，導(dǎo)致提取RNA的方法有很大差別［11］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鐵皮石斛莖中次生代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量最高［12-14］，但是鐵皮石斛RNA提取方法研究中使用的材料多為葉片，鮮有關(guān)于莖RNA提取方法的報(bào)道［15-18］。目前鐵皮石斛依賴人工栽培生產(chǎn)藥材，采收生長(zhǎng)2-3年的莖入藥，這個(gè)階段多糖含量最高，通?？蛇_(dá)20%-30%［19］；葉和根的多糖含量分別為10%-14%和8%-10%［20］。鑒于此，本研究以多糖含量高的2年生鐵皮石斛莖為實(shí)驗(yàn)材料，研究建立總RNA提取的試劑盒方法，以期為石斛屬植物莖的分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，并為其他富含多糖的植物器官的RNA提取提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

用于方法學(xué)研究的鐵皮石斛樣品，采自江蘇省泰州市江蘇益草堂石斛股份有限公司（以下稱為益草堂公司），為該公司生產(chǎn)的組培苗移栽種植大棚后生長(zhǎng)兩年的莖桿。干燥莖多糖含量29.5%。每種RNA提取方法采集3份樣品，作為生物學(xué)重復(fù)。

鐵皮石斛樣品均來(lái)自益草堂公司生產(chǎn)的組培苗，生長(zhǎng)條件和生長(zhǎng)時(shí)間分別是：中國(guó)科學(xué)醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所溫室種植1年（W），益草堂公司種植大棚生長(zhǎng)3個(gè)月（S）、1年（Y）和2年（L）。金釵石斛（J）、鼓槌石斛（D. chrysotoxum Lindl，G）、球花石斛（D. thyrsiflorum Rchb. f.，Q）和重唇石斛（D.hercoglossum Rchb. f.，C）均在藥用植物研究所溫室生長(zhǎng)兩年以上。W與Y用于比較不同生長(zhǎng)條件的鐵皮石斛，S、Y和L用于比較不同生長(zhǎng)時(shí)間的鐵皮石斛，L、J、G、Q和C用于比較不同種石斛屬植物。以上每個(gè)樣品采集3份，作為生物學(xué)重復(fù)。

以上植物均經(jīng)過(guò)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭順星研究員鑒定。將新鮮石斛莖切段，迅速放入液氮中速凍，后置于-80℃保存，備用。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取方法 研究共采用了7種RNA提取方法：TRIZOL法 +去多 糖輔助劑（M1）［17］、QIAGEN試劑盒法（M2）［21］、百泰克通用試劑盒法（M3）［17］、百泰克多糖多酚試劑盒法（M4）［22］、艾德萊多糖多酚試劑盒法（M5）［23］和華越洋多糖多酚試劑盒法（M6）［24］和改良華越洋多糖多酚試劑盒法（M7）。前6種方法均按照試劑盒附帶的操作步驟提取RNA。M7在試劑盒操作步驟的基礎(chǔ)上進(jìn)行了2方面的改良：加大樣品量；延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

改良華越洋多糖多酚試劑盒法（M7）提取RNA過(guò)程如下：（1）稱取300 mg鐵皮石斛莖段，液氮充分研磨后加入3 000 μL細(xì)胞裂解液混勻，50℃孵育10 min；（2）所得混合物的液體部分轉(zhuǎn)移至離心管，加入900 μL去蛋白液和600 μL氯仿，震蕩混勻，靜置2 min，離心10 min；（3）上清液加入等體積漂洗液，顛倒混勻，混合物通過(guò)離心吸附柱，離心1 min，棄廢液；（4）用洗柱液清洗吸附柱2次，每次清洗后離心1 min，棄廢液；（5）取45 μL DNase buffer和 5 μL RNAse free DNase I混合均勻，37℃預(yù)熱1 min，加入吸附柱，靜置5 min；（6）用去酶液清洗吸附柱2次，每次清洗后離心1 min，棄廢液；（7）吸附柱加30-80 μL RNA洗脫液，靜置3-5 min，離心1 min，收集RNA溶液。以上操作均在室溫下進(jìn)行，離心速度均為12 000 r/min。

1.2.2 RNA質(zhì)量檢測(cè) RNA濃度及純度用NanoDropTM2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher，USA）檢測(cè)［25］，1.0 μL總RNA上樣，平行檢測(cè)5次，記錄總RNA濃度、OD260/OD280，計(jì)算平均值。RNA純度要求：1.8≤OD260/OD280≤2.2。RNA完整性用凝膠電泳檢測(cè)［26］，0.5×TBE Buffer電泳緩沖液，3 μL RNA 混入 0.6 μL 6×Loading Buffer（TaKaRa）點(diǎn)樣，1.0%瓊脂糖（Biowest? Regular Agarose G-10）凝膠，200 V電泳15 min。

1.2.3 M7的方法驗(yàn)證 用M7方法對(duì)各樣品莖RNA進(jìn)行提取，并檢測(cè)RNA質(zhì)量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)方法 對(duì)M2-M7的RNA濃度和純度測(cè)定值用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，比較不同方法提取的莖總RNA的質(zhì)量差異。由于方差不齊，用Dunnett’s T3進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 七種方法提取RNA過(guò)程中的現(xiàn)象

七種提取RNA的方法，除了M1需要用異丙醇沉淀并自然干燥RNA，其他6種都是用吸附柱收集RNA的試劑盒法。選取上柱前實(shí)驗(yàn)過(guò)程中現(xiàn)象變化最明顯的3個(gè)階段進(jìn)行觀察，它們分別是：加入裂解液后、水浴離心后和加入氯仿后。

M2、M3和M4在加入裂解液后溶液比較黏稠（圖1-A）。水浴離心后7種方法都會(huì)出現(xiàn)沉淀（圖1-B），其中M2出現(xiàn)了白色絮狀沉淀；M3和M4水浴離心后上清液仍較黏稠，不易吸?。宦确碌淖饔檬菍NA與DNA和蛋白質(zhì)分離，進(jìn)入水相。加入氯仿后溶液分為3層：上層為含有RNA的水相；中層為DNA、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)；下層為有機(jī)相（圖1-C）。這個(gè)階段M4上層為黏稠的白色液體，M3實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有加入氯仿，分層出現(xiàn)在加入70%乙醇后，上清為黏稠的透明液體。由于水浴離心后已經(jīng)將M2和M5上清液轉(zhuǎn)移到過(guò)濾清除柱中，因此在這個(gè)階段M2和M5無(wú)明顯分層現(xiàn)象。

2.2 七種方法提取的總RNA的質(zhì)量檢測(cè)

2.2.1 RNA完整性 圖2為1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖，M1、M2和M3方法沒(méi)有rRNA條帶，M4和M5方法rRNA條帶不清晰，M6和M7方法有較整齊、清晰的28S和18S rRNA條帶。

2.2.2 RNA濃度和純度 測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。M1總RNA濃度異常高，紫外檢測(cè)有兩個(gè)吸收峰，表明樣品中摻雜有DNA，測(cè)定值不可靠，因此不參與統(tǒng)計(jì)。M2-M7數(shù)據(jù)的單因素方差分析結(jié)果表明，不同提取方法的總RNA濃度有顯著性差異（P＜0.05），純度沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。經(jīng)Dunnett’s T3多重比較，M7與M2和M3的總RNA濃度有顯著性差異（P＜0.05）。M7總RNA濃度最高，為139.13±22.02 ng/μL，濃度變異系數(shù)（C.V）最低，為15.83%，總RNA純度最高，OD260/OD280為2.12±0.01，表明該方法穩(wěn)定，重復(fù)性好，提取獲得的總RNA質(zhì)量符合分子生物技術(shù)要求。M7總RNA濃度較M6提高了98.6%，純度提高了79.7%，改良效果明顯。

圖1 七種方法提取RNA過(guò)程中的現(xiàn)象

圖2 七種方法提取鐵皮石斛莖總RNA的電泳圖

表1 七種方法提取鐵皮石斛莖總RNA的濃度和純度（n=3）

2.3 M7方法驗(yàn)證

2.3.1 RNA完整性 經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，M7提取的不同生長(zhǎng)條件（W和Y）和不同生長(zhǎng)時(shí)間（S、Y和L）鐵皮石斛，以及不同種石斛屬植物（L、J、G、Q和C），均有整齊、清晰的28S和18S rRNA條帶（圖3）。

2.3.2 RNA濃度和純度 M7提取的W、S、Y和L的鐵皮石斛莖總RNA濃度在50 ng/μL-140 ng/μL之間，OD260/OD280在1.8-2.2之間。M7提取的J、G、Q 和 C莖總 RNA 濃度在 60 ng/μL-110 ng/μL之間，OD260/OD280在2.0-2.1之間（表2）。以上結(jié)果均能滿足下游的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。

圖3 M7方法驗(yàn)證的莖總RNA電泳圖

3 討論

RNA提取的原理是首先將細(xì)胞破碎裂解，利用一些試劑去除多糖、酚類、蛋白和DNA的污染，再通過(guò)一系列的抽提、洗滌和沉淀，最終獲得純凈的RNA［27］。富含多糖的植物組織，由于細(xì)胞破碎后多糖常與RNA形成難溶性物質(zhì)，導(dǎo)致RNA分離困難，并造成初提時(shí)上清液黏稠，不能很好的與有機(jī)相分離，在去除多糖的同時(shí)造成RNA大量丟失，降低RNA得率［28］。因此，更高效的細(xì)胞裂解是從這類組織中獲得高質(zhì)量及高產(chǎn)量RNA的前提。

表2 M7方法驗(yàn)證的莖總RNA（n=3）

裂解細(xì)胞的方法分為物理方法（液氮研磨破碎法）、生物方法（酶方法：蛋白酶K、溶菌酶）和化學(xué)方法（CTAB、SDS、NaI、KI、蛋白質(zhì)變性劑）。本研究所采取的7種方法，M1、M2、M4和M5主要是利用異硫氰酸胍變性劑來(lái)破碎細(xì)胞壁和去除RNA酶［29］，M3和M6所使用的裂解液試劑公司保密。M1、M2和M3為通用試劑盒。李清等［21］報(bào)道用M2提取金釵石斛莖RNA可獲得滿意的結(jié)果。用M3提取鐵皮石斛［17］、福建山櫻花［30］、草珊瑚［31］等植物材料的RNA均出現(xiàn)DNA污染、RNA完整性差的現(xiàn)象。本研究結(jié)果與這些文獻(xiàn)的報(bào)道一致。M4、M5和M6為多糖多酚試劑盒。據(jù)報(bào)道，M6多用于提取富含多糖多酚類植物的RNA。如甘薯［24］、番茄［32］、芒果等［33］，提取結(jié)果能滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。M7在M6的基礎(chǔ)上采取延長(zhǎng)孵育時(shí)間和加大樣品量的措施。延長(zhǎng)孵育時(shí)間可以增加裂解液與細(xì)胞的接觸，使其充分裂解，徹底釋放RNA［23］。由于石斛屬植物富含多糖，在加入裂解液之后會(huì)產(chǎn)生大量沉淀，上清液體積小，不易吸取。加大樣品量可以獲得足夠的上清液，減少蛋白質(zhì)等的污染。采取以上改良措施后，M7達(dá)到了去除雜質(zhì)污染和提高RNA濃度的目的，獲得了比M6更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 結(jié)論

改良華越洋多糖多酚試劑盒法（M7）既能有效去除多糖，也能滿足后續(xù)分子生物研究對(duì)RNA質(zhì)量的要求，可用于提取石斛屬植物莖RNA，也可為富含酚類和多糖等物質(zhì)的其他植物材料的RNA提取提供參考。

［1］陳心啟, 吉占和. 中國(guó)蘭花全書［M］. 第2版. 北京：中國(guó)林業(yè)出版社, 2003.

［2］包雪聲, 順慶生, 張申洪, 等. 中國(guó)藥用石斛圖志［M］. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社, 2005.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典. 一部［S］. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015：282-283.

［4］江蘇新中醫(yī)學(xué)院. 中藥大藥典［M］. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1985：586.

［5］Tong ZG, Qu SC, Zhang JY, et al. Amodified protocol for RNA extraction from different peach tissues suitable for gene isolation and real-time PCR analysis［J］. Mol Biotechnol, 2012, 3：229-236.

［6］Fan G, Hammars G. A quick and inexpensive method for removing polysaccarids from plant genomic DNA［J］. Bio Techniques, 1992,13（1）：52-56.

［7］郭翠英, 王躍進(jìn), 等. 富含多糖葡萄風(fēng)信子花瓣總RNA提取方法研究［J］. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2007, 16（3）：188-191.

［8］阮孟斌, 等. 一種適用于多糖多酚植物的高質(zhì)量RNA快速提取方法［J］. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2011, 32（9）：1704-1707.

［9］陳星, 潘迎捷, 孫曉紅, 等. 細(xì)菌總RNA提取方法的研究進(jìn)展［J］. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 1（5）：9-11.

［10］馬敬, 趙洪東, 康寧, 等. 番茄葉片RNA提取方法比較研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2015, 1（3）：69-70.

［11］Ainsworth C. Isolation of RNA from floral tissue of Rumex acetosa（sorrel）［J］. Plant Mol Biol Reptr, 1994, 12（3）：198-203.

［12］孟衡玲, 張薇, 盧丙越, 等. 鐵皮石斛查爾酮合酶基因克隆與表達(dá)分析［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 47（12）：2015-2019.

［13］張琳, 蔡茜, 張大為, 等. 鐵皮石斛丙酮酸激酶基因的克隆與表達(dá)分析［J］. 中草藥, 2014, 45（7）：990-995.

［14］王翔, 吳林松, 吳秋菊, 等. 鐵皮石斛HDS基因的克隆與初步表達(dá)分析［J］. 中草藥, 2016, 47（5）：803-809.

［15］容天聚, 文國(guó)松, 錢雄, 等. 兩種鐵皮石斛總RNA提取方法的比較研究［J］. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 27（5）：703-707.

［16］張志勇, 陽(yáng)靜, 齊澤民. 鐵皮石斛總RNA提取方法的比較研究［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 45（4）：33-35.

［17］孟衡玲, 楊生超, 文國(guó)松, 等. 三種提取鐵皮石斛葉片總RNA方法的比較［J］. 分子植物育種, 2011, 9（5）：1603-1607.

［18］李標(biāo), 王伯初, 唐坤, 等. 鐵皮石斛RNA提取及RT-PCR檢測(cè)［J］. 中草藥 , 2006, 37（4）：585-588.

［19］Chen XM, Wang FF, Wang YQ, et al. Discrimination of the rare medicinal plant Dendrobium officinale based on naringenin,bibenzyl, and polysaccharides［J］. Science China Life Sciences,2012, 55（12）：1092-1099.

［20］吳佳雯, 項(xiàng)麗, 等. 浙江樂(lè)清人工種植鐵皮石斛不同部位的多糖含量分析［J］. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2011（12）：68-69.

［21］李清, 等. 金釵石斛中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因的克隆及特征分析［J］. 中草藥, 2017（12）：2502-2508.

［22］余乃通, 周啟林, 羅志文, 等. 仙人掌總RNA提取方法的改進(jìn)與分析［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 44（3）：75-79.

［23］侯曉婉, 等. 多年生白木香莖干不同部位總RNA提取方法的改良［J］. 熱帶生物學(xué)報(bào), 2016, 7（3）：376-380.

［24］李霞, 王欣, 后猛, 等. 紫肉甘薯塊根總RNA提取方法的評(píng)價(jià)［J］. 分子植物育種, 2015, 13（13）：165-170.

［25］郝雪英, 豐震, 呂傳青. ‘魯紅一號(hào)’元寶楓葉片總RNA提取方法的比較研究［J］. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 47（3）：5-8.

［26］張小林, 韓麗君, 李 龍, 等. RNA甲醛瓊脂糖凝膠電泳的優(yōu)化及探討［J］. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2011, 11（2）：351-353.

［27］鄒曉蕾, 劉禮崔, 羅立新. 細(xì)菌總RNA提取方法的比較［J］.現(xiàn)代食品科技, 2013, 29（8）：1948-1954.

［28］Lewinsohn E, Steele CL, Croteau R. Simple isolation of functional RNA from woody stems of gymnosperms［J］. Plant Mol Biol Reptr, 1994, 12（1）：20-25.

［29］朱玉野, 朱繼孝, 羅光明, 等. 梔子高質(zhì)量總RNA的提?。跩］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2012, 28（27）：194-198.

［30］榮俊冬, 張迎輝, 薛藝敏, 等. 福建山櫻花總RNA提取方法比較分析［J］. 福建林業(yè)科技, 2015, 42（1）：73-76.

［31］沈少炎, 謝德金, 吳玉香, 等. 草珊瑚葉片總RNA提取方法及效果的比較研究［J］. 浙江林業(yè)科技, 2016, 36（5）：40-44.

［32］楊榮超, 章月琴, 豐鋒, 等. 番茄種子RNA提取及快速檢測(cè)qRT-PCR模板純度的方法優(yōu)化［J］. 種子, 2016, 35（5）：27-30.

［33］殷德松, 宋靜武, 齊貝貝, 等. β-巰基乙醇對(duì)不同時(shí)期芒果剪口芽總RNA質(zhì)量的影響［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2017, 33（10）：83-86.