張夢(mèng)恬 裴娟 李國(guó) 趙輝 陳建權(quán) 祝建波 王愛(ài)英

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 石河子 832003）

棉花是世界上重要的纖維作物，由于新疆獨(dú)特的自然氣候使其成為國(guó)內(nèi)面積最大的產(chǎn)棉區(qū)。棉花黃萎病是全球范圍內(nèi)的棉花病害之一，極大影響棉花質(zhì)量及產(chǎn)量。棉花黃萎病是由輪枝菌屬（Verticillium）的病原菌引起，目前發(fā)現(xiàn)有6個(gè)種是植物病原菌，分別為大麗輪枝菌（V . dahliae Klebahn）、變黑輪枝菌（V.nigrescens Pethybridge）、三體輪枝菌（V.tricorpus Isaac）、黑白輪枝菌（Verticillium albo-atrum Reinke and Berthold）、 云狀輪枝菌（V.nubilum Pethybridge）及V.theobromae（Turconi）［1-4］。其中造成棉花黃萎病的主要病原菌為大麗輪枝菌和黑白輪枝菌。由于植棉地區(qū)生態(tài)環(huán)境發(fā)生變化，造成病菌表現(xiàn)出不同的致病類(lèi)型，從而產(chǎn)生許多致病力強(qiáng)的菌株類(lèi)型，但是變異形成的菌株類(lèi)型仍然不是太清楚。姚耀文等［5］通過(guò)致病力測(cè)定將我國(guó)棉花黃萎病分為3個(gè)生理型，分別為：生理型Ⅰ致病力極強(qiáng)，生理型Ⅱ致病力極弱，以及致病力中等介于前兩種生理型之間的生理型Ⅲ。段維軍等［6］證實(shí)新疆存在少量落葉型黃萎菌。韓宏偉等［7］通過(guò)分子手段發(fā)現(xiàn)新疆北部（北疆）落葉型黃萎菌比例占到39%。李彩紅等［8］發(fā)現(xiàn)氣候條件的改變會(huì)影響黃萎病菌產(chǎn)生遺傳變異及致病類(lèi)型差異。劉燕霞等［9］利用ISSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同地區(qū)大麗輪枝菌遺傳分化及致病力進(jìn)行分析。黃萎病菌菌株間的親緣關(guān)系可以利用分子進(jìn)化樹(shù)及營(yíng)養(yǎng)親和性技術(shù)來(lái)分析。Puhalla等［10］首次利用硝酸鹽營(yíng)養(yǎng)缺陷性突變體（nit）技術(shù)研究黃萎病菌營(yíng)養(yǎng)親和性。本研究通過(guò)現(xiàn)代分子技術(shù)檢測(cè)和菌株培養(yǎng)表型觀(guān)察相結(jié)合的方法研究新疆石河子地區(qū)棉花黃萎病菌的致病類(lèi)型及菌株的親緣關(guān)系，從而明確石河子地區(qū)棉花黃萎病菌的變異和致病力分化情況，以期為該地區(qū)篩選黃萎病的耐病或抗病棉花品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與試劑 棉花病株采自新疆石河子棉花種植區(qū)，其中SHZ-1至SHZ-9采自143團(tuán)石南農(nóng)場(chǎng)，SHZ-10至SHZ-16采自145團(tuán)清泉集七連，SHZ-17至SHZ-24采自大學(xué)試驗(yàn)場(chǎng)二連。pMD19-T克隆載體、PCR反應(yīng)液購(gòu)自TaKaRa公司，瓊脂糖購(gòu)自Biowest公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生物公司，引物合成由北京華大基因有限公司完成。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基Czapek液體培養(yǎng)基及LB固體培養(yǎng)基［11］用于真菌及細(xì)菌培養(yǎng)；BM培養(yǎng)基、MM培養(yǎng)基、KPS培養(yǎng)基、MO2培養(yǎng)基及MH培養(yǎng)基［12-13］均用于營(yíng)養(yǎng)親和性研究。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化 通過(guò)岳永亮等［14］的方法對(duì)本研究中感病棉株進(jìn)行組織分離。分離純化后菌株低溫保存。

1.2.2 分子生物學(xué)檢測(cè) 通過(guò)優(yōu)化的CTAB法［15］提取棉花黃萎菌DNA。以其為模板，通過(guò)真菌ITS通用引物［16］ITS1/ITS4、黃萎菌特異引物 DB19/DB22、黃萎菌致病類(lèi)型特異引物［17］D-1/D-2、ND-1/ND-2分別對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表1）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，Taq聚合酶0.5 μL、Taq酶緩沖液 2.5 μL、dNTP 2.0 μL、引物 1.0 μL、模板 1.0 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃，10 min；95℃ 45 s、56℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃，10 min。真菌ITS通用引物擴(kuò)增后獲得的陽(yáng)性克隆，連接至pMD19-T載體，測(cè)序連接成功后的質(zhì)粒，比對(duì)測(cè)序結(jié)果，下載比對(duì)后同源性較高的ITS序列，利用MEGA 5.0采用Neighbour-Joining Method構(gòu)建病原菌株分子進(jìn)化樹(shù)。

表1 黃萎病菌PCR引物

1.2.3 菌株?duì)I養(yǎng)親和性鑒定 通過(guò)景嵐等［18］的方法對(duì)本研究中分離得到的24株棉花黃萎病菌進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)親和性鑒定分析

1.2.4 菌株溫室致病力鑒定 采用無(wú)底營(yíng)養(yǎng)缽定量接菌液法［19-20］，接菌孢子濃度為 1.0×107cef/mL。供試棉株為新陸早 33號(hào)、新陸早7號(hào)、中棉35號(hào)。將單孢純化后的菌株利用Czapek液體培養(yǎng)基，26℃、180 r/min避光振蕩培養(yǎng)一周，四層紗布過(guò)濾菌絲，接種于長(zhǎng)至3片真葉的棉苗，接種15 d后，根據(jù)感病棉苗的病情指數(shù)進(jìn)行黃萎菌致病力分析。

黃萎病病級(jí)調(diào)查［19-20］：0級(jí)：健株，無(wú)病狀；1級(jí)：子葉出現(xiàn)病狀；2級(jí)：1片真葉嚴(yán)重發(fā)病；3級(jí)：2片真葉表現(xiàn)病狀；4級(jí)：植株生長(zhǎng)點(diǎn)死亡或全株枯死；病情指數(shù)計(jì)算公式如下：

致病力類(lèi)型的劃分：強(qiáng)致病力為I型：平均病指30.0以上；中致病型III型：平均病指20.1-30.0；弱致病型II型：平均病指20.0以下。

2 結(jié)果

2.1 菌落形態(tài)及顯微形態(tài)鑒定

本研究分離的24株菌株菌落形態(tài)，與孔德真［21］等描述相似，菌落表面為白色絨毛狀，周?chē)泻谏⒕水a(chǎn)生，菌落形態(tài)以圓形居多，少部分為橢圓形，進(jìn)行顯微觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)其能夠產(chǎn)生與大麗輪枝菌相似的含有2-4個(gè)分枝的輪狀分生孢子梗（圖1-A）；還能夠產(chǎn)生與大麗輪枝菌相似的黑色微菌核結(jié)構(gòu)（圖1-B），在微菌核旁側(cè)有少量無(wú)色透明孢子（圖1-C）。大部分分離菌株菌落都有同心輪紋（圖2-A），部分菌落微菌核呈現(xiàn)出由內(nèi)向外放射狀（圖2-B），綜上所述，初步判定分離菌株為棉花黃萎菌。依據(jù)菌落不同形態(tài)將供試菌株分為3種。菌核型（圖2-C）：培養(yǎng)基中央菌核較多，邊緣菌核較少，菌絲菌核周?chē)纬砂咨珗A圈，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，無(wú)凸起。絲核型（圖2-D）：產(chǎn)生較多菌核，呈現(xiàn)發(fā)散狀態(tài)，邊緣整齊，培養(yǎng)基中央有較多氣生菌絲，有灰白色菌絲凸起。菌絲型（圖2-E）：不產(chǎn)生菌核，菌絲密集且邊緣整齊，無(wú)凸起，氣生菌絲不發(fā)達(dá)。

2.2 供試菌株分子檢測(cè)

供試菌株ITS區(qū)段通過(guò)真菌特異引物 ITS1 和ITS4 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增得到約 500 bp的目的條帶（圖3-A）。測(cè)序后，在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些序列和已知ITS 序列具有高度同源性，從分子水平鑒定證明供試菌株為大麗輪枝菌。利用PCR手段通過(guò)黃萎菌特異性引物DB19/DB22對(duì)純化的菌株進(jìn)行擴(kuò)增得到 539 bp 的特異性條帶（圖3-B），從而進(jìn)一步確定分離得到的菌株為大麗輪枝菌。對(duì)供試的棉花黃萎病菌采用落葉型（D-1/D-2）和非落葉型特異引物（ND-1/ND-2）進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，落葉性引物擴(kuò)增可得到約500 bp的目的條帶，非落葉型引物擴(kuò)增可得到約1 500 bp的目的條帶（圖3-C）。確定分離得到的黃萎菌11株為落葉型，13株為非落葉型。

圖1 分離菌株的分生孢子、孢子梗及微菌核的顯微形態(tài)

圖2 分離菌株的微菌核形態(tài)及菌落培養(yǎng)類(lèi)型

2.3 序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將分離的24株菌株ITS序列與GenBank中同源性較高的輪枝菌 ITS 序列進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖4）。這些ITS序列信息如下：KC156638.1、U82452.1、KC156640.1、KJ696553.1、KC156635.1、KM013462.1 分別來(lái)自于中國(guó)北京、美國(guó)麥迪遜、中國(guó)河南、北京、河南及重慶；分離的24株黃萎菌中SHZ-4、SHZ-5、SHZ-6、SHZ-8、SHZ-9、SHZ-11在同一進(jìn)化支，與來(lái)自北京的KJ696553.1相近；SHZ-24與來(lái)自河南KCl156635.1在同一進(jìn)化支比較相近；SHZ-17、SHZ-23在同一進(jìn)化支上，與進(jìn)化上來(lái)自美國(guó)的U82452.1和來(lái)自中國(guó)河南的KCl156640.1比較相近。

圖3 分離菌株ITS及特異性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.4 分離菌株的營(yíng)養(yǎng)親和鑒定

通過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)15 d后，分離菌株中有10株菌株可產(chǎn)生突變體菌落，菌落邊緣呈現(xiàn)擴(kuò)散性生長(zhǎng)扇形突變體菌落。而其中14株不能產(chǎn)生突變體。24株菌株共獲得53個(gè)突變體，nit1、nitM、nit3的數(shù)值分別為39、10、4，分別占總突變體的73.58%、18.87%及7.54%。nit1突變體數(shù)量最多，最易獲得；nitM次之；nit3突變體最難獲得。對(duì)分離得到的24株黃萎菌的nit1和nitM突變體進(jìn)行全組合配對(duì)，研究菌株之間的親和性。結(jié)果（表2）表明：供試菌株可分為3個(gè)不同的營(yíng)養(yǎng)親和群，其中SHZ-4、SHZ-5、SHZ-6、SHZ-8、SHZ-9、SHZ-11 屬于一個(gè)親和群，命名為VCG1。SHZ-2、SHZ-18屬于一個(gè)親和群，命名為VCG2。SHZ-13、SHZ-21屬于一個(gè)親和群，命名為VCG3。

2.5 黃萎病菌致病力測(cè)定

利用無(wú)底營(yíng)養(yǎng)缽定量接菌液法測(cè)定24株黃萎菌在3個(gè)不同的鑒別寄主上的致病力，結(jié)果顯示（表3）24株菌株表現(xiàn)出明顯的致病力差異。根據(jù)致病力不同將24株菌株劃分為強(qiáng)、中、弱3種不同類(lèi)型。強(qiáng)致病力占75%，中等致病力占8.3%，弱致病力占16.7%。其中SHZ-9菌株的致病力較強(qiáng)，SHZ-4號(hào)菌株的致病力較弱。

圖4 分離的24株石河子棉花棉花黃萎病菌ITS序列構(gòu)建的N-J進(jìn)化樹(shù)

表2 分離菌株得到Nit突變體的數(shù)目及其營(yíng)養(yǎng)親和群

表3 24個(gè)不同供試病株對(duì)3個(gè)棉花品種的致病性差異鑒定

3 討論

棉花黃萎病菌本身變異情況及致病力分化研究可為培育優(yōu)良抗病品種及有效的病害預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。棉花黃萎病多是由大麗輪枝菌造成的土傳病害，特點(diǎn)是分布廣、變異性強(qiáng)、造成危害大。李國(guó)英等［22］研究表明石河子地區(qū)于2001-2008年間，黃萎病發(fā)病面積成倍增加，發(fā)病率高于30%的發(fā)病面積更是增加8倍以上。韓宏偉［7］等研究表明2005-2010年間新疆北部棉花黃萎菌由以中、弱致病力為主轉(zhuǎn)變?yōu)橐詮?qiáng)致病力為主。本研究從石河子不同地區(qū)自然病圃采集感病植株，經(jīng)組織分離、分子鑒定后獲得24株大麗輪枝菌，其中強(qiáng)、中致病力類(lèi)型菌株有20株，占到83.3%，說(shuō)明石河子棉區(qū)黃萎菌以強(qiáng)、中致病力為主，同時(shí)本研究中強(qiáng)致病力菌株占到75%，這與韓宏偉等研究結(jié)果中石河子地區(qū)強(qiáng)致病力菌系占51.7%相比高出了23.3%，由此說(shuō)明，石河子棉區(qū)黃萎病情明顯加重、枯死型癥狀增多的主要原因是石河子地區(qū)黃萎菌群體致病力類(lèi)型發(fā)生較大變化，致病力強(qiáng)菌系明顯增加。

2004年，研究表明新疆僅有少量落葉型黃萎菌存在；2008年，新疆北部落葉型黃萎菌達(dá)到39%［7］；2009年新疆石河子地區(qū)落葉型黃萎菌已達(dá)到37.9%［23］。本研究分離所獲24株菌株中，落葉型黃萎菌11株，占到45.8%，這與2009年相比高出了6.8%。同時(shí)11株落葉型黃萎菌中強(qiáng)致病力類(lèi)型9株，占81.8%，由此說(shuō)明，石河子棉區(qū)在生長(zhǎng)的中后期出現(xiàn)大面積落葉致光桿的主要原因是石河子地區(qū)黃萎菌群體出現(xiàn)較多致病性強(qiáng)的落葉型菌系。同時(shí)SHZ-9是24株菌株中致病力最強(qiáng)的菌株，但是它是非落葉型菌系，這與王國(guó)寧等［24］發(fā)現(xiàn)有些非落葉型黃萎菌致病力強(qiáng)于落葉型黃萎菌相一致。

本研究發(fā)現(xiàn)SHZ-9與SHZ-4在分子進(jìn)化樹(shù)上親緣關(guān)系較近，且同屬于VCG1，分子檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)兩者均為非落葉型大麗輪枝菌，但侵染相同品種棉花后表現(xiàn)出的致病力有顯著差異，SHZ-9是24株菌株中致病力最強(qiáng)的菌株，平均病情指數(shù)為50，而SHZ-4是致病力較弱的菌株，平均病情指數(shù)僅為17.6，這表明同為非落葉型菌系接種相同品種能表現(xiàn)出完全不同的致病力，與朱荷琴等［25］研究結(jié)果相似，兩者致病力分化明顯的原因還有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究分離獲得24株石河子地區(qū)棉花黃萎病致病菌株均為大麗輪枝菌，11株落葉型黃萎菌，13株非落葉型黃萎菌。分子進(jìn)化樹(shù)顯示24株菌在系統(tǒng)進(jìn)化方式上屬于2個(gè)不同的分支。致病力結(jié)果顯示24株菌株強(qiáng)致病力占到75%，中等致病力占到8.3%，弱致病力占到16.7%，SHZ-9致病力最強(qiáng)，SHZ-4致病力較弱，菌株存在明顯致病力分化現(xiàn)象。

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