王珂雯 尹雪 王宇 李玉花

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040）

天然產(chǎn)物作為生物體內(nèi)自身代謝合成的一種微量次生代謝物，因其具有高效的藥理活性，被人們廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健和食品等領(lǐng)域。近年來利用微生物進(jìn)行基因工程操作，實(shí)現(xiàn)天然產(chǎn)物的大量合成已成為目前的研究熱點(diǎn)，如利用大腸桿菌（Esherichia coli）或酵母合成可以預(yù)防心腦血管疾病的白藜蘆醇、具有止痛功效的嗎啡以及具備抗癌功效的人參皂苷和紫杉醇等藥物［1-3］；在鏈霉菌（Streptomyces）中實(shí)現(xiàn)了深海極端環(huán)境微生物中具有化學(xué)防御、信號(hào)傳導(dǎo)的特殊代謝產(chǎn)物的異源合成［4］。釀酒酵母作為已完成全基因組測序的真核模式生物，與其他真核生物如煙草細(xì)胞相比，它在代謝工程研究中具有生物繁殖速度快、生長周期短、易于培養(yǎng)、不易污染等特點(diǎn)［5］；而與原核生物如大腸桿菌相比，不僅可以高密度發(fā)酵，還具有其他優(yōu)點(diǎn)：含有線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，利于表達(dá)有生物活性的異源蛋白，特別是適合植物細(xì)胞色素P450類蛋白的表達(dá)［6］；DNA重組效率高，能夠一次性插入多個(gè)大片段的外源基因，并且能夠穩(wěn)定遺傳。同時(shí)，最近釀酒酵母人工染色體從頭合成的成功實(shí)現(xiàn)為未來發(fā)揮酵母巨大潛力提供可能［7］。目前研究人員利用釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成功合成了生物堿、萜類、不飽和脂肪酸及其他一些重要的化合物（表1）。

表1 利用釀酒酵母生產(chǎn)的重要化合物

目前對(duì)代謝工程的改造主要集中在通過導(dǎo)入特定的催化酶、調(diào)節(jié)蛋白來構(gòu)建新的代謝通路，或者優(yōu)化釀酒酵母自身的代謝途徑，而選擇合適的基因啟動(dòng)子可以對(duì)能量和營養(yǎng)物質(zhì)在終產(chǎn)物代謝途徑和細(xì)胞自身代謝途徑之間的供給交換進(jìn)行精細(xì)和定量地調(diào)控，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因表達(dá)強(qiáng)度的最佳組合。因此，在釀酒酵母工程菌中選擇合適的啟動(dòng)子顯得尤為重要。啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要元件，其活性的強(qiáng)弱可以顯著影響異源基因轉(zhuǎn)錄的起始、持續(xù)時(shí)間和表達(dá)的程度，進(jìn)而影響外源基因在宿主中的轉(zhuǎn)錄效率，同時(shí)也決定了細(xì)胞中mRNA的總體豐度和蛋白質(zhì)含量，最終高效地合成目標(biāo)產(chǎn)物。本文將基于如何選擇和修飾釀酒酵母啟動(dòng)子用來高效合成目標(biāo)產(chǎn)物，分別對(duì)釀酒酵母啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)、類型和優(yōu)化策略幾個(gè)部分進(jìn)行了詳細(xì)介紹。

1 釀酒酵母啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)

啟動(dòng)子位于結(jié)構(gòu)基因5′端的上游區(qū)域，直接調(diào)控基因時(shí)空特異性表達(dá)。真核生物啟動(dòng)子由核心啟動(dòng)子（Core promoter）和上游啟動(dòng)子元件（Upstream promoter element）組成（圖 1）。

1.1 核心啟動(dòng)子

核心啟動(dòng)子由TATA盒（TATA box）、TFⅡB識(shí)別元件（Transcription factor for RNA polymerase IIB recognition element，BRE）、 起 始 子（Initiator，Inr）和下游啟動(dòng)子元件（Downstream promoter element，DPE）4個(gè)元件構(gòu)成，它們位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游40 bp到下游40 bp之間（圖1）。但在釀酒酵母中，大部分元件都已退化［21］，僅有20%的釀酒酵母基因啟動(dòng)子還存在著TATA盒，共同序列為TATA（A/T）A（A/T）（A/G）［22］。并且釀酒酵母啟動(dòng)子的 TATA盒位置具有可變性，一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的40-120 bp 處［23］。

1.2 上游啟動(dòng)子元件

釀酒酵母核心啟動(dòng)子TATA盒上游存在一段保守的調(diào)控區(qū)被稱為上游啟動(dòng)子原件，可分為上游激活序列（Upstream activation sequences，UAS）和上游抑制序列（Upstream repression sequences，URS）［24］。轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄抑制因子可以分別與其特異性結(jié)合，從而促進(jìn)或抑制RNA聚合酶的結(jié)合效率調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄。上游激活序列最先在酵母中被發(fā)現(xiàn)，如半乳糖代謝酶基因Gal的上游激活序列由4個(gè)相連的17 bp序列組成；精氨酸酶基因Car1的上游激活序列為一段13 bp的序列［25］。上游激活序列的作用類似于增強(qiáng)子，但與增強(qiáng)子不同的是，上游激活序列一般位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的100-500 bp之間，距離過遠(yuǎn)就會(huì)失去促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的活性［26］。

圖1 啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)示意圖

2 釀酒酵母啟動(dòng)子類型

在釀酒酵母工程菌的實(shí)際應(yīng)用中，常用的天然啟動(dòng)子來源于釀酒酵母宿主本身和外源宿主。釀酒酵母宿主內(nèi)源啟動(dòng)子根據(jù)其作用方式或功能可分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和雙向啟動(dòng)子，而來源于外源宿主的啟動(dòng)子被稱為異源啟動(dòng)子。選擇合適類型的啟動(dòng)子不僅可以控制目標(biāo)基因的表達(dá)，還可以對(duì)基因的表達(dá)量進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)。

2.1 組成型啟動(dòng)子

組成型啟動(dòng)子又稱非特異性啟動(dòng)子，在其調(diào)控下，同一基因在不同生長環(huán)境及生長階段的表達(dá)無明顯差異，且始終維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平。

基因表達(dá)量與組成型啟動(dòng)子的強(qiáng)弱密切相關(guān)，因此組成型啟動(dòng)子相對(duì)強(qiáng)度的大小在實(shí)際應(yīng)用中尤為重要。當(dāng)需要提高基因的表達(dá)量時(shí)，選擇強(qiáng)啟動(dòng)子，反之則選弱啟動(dòng)子（表2），目前組成型啟動(dòng)子的相對(duì)強(qiáng)度可以采用多種報(bào)告系統(tǒng)來進(jìn)行評(píng)估。Partow等［27-28］通過檢測LacZ的活性，比較了7種組成型啟動(dòng)子的強(qiáng)度，獲得的相對(duì)強(qiáng)度大小為：pTEF1≈pPGK1≈pTDH3＞ pTPI1≈pPYK1 ＞ pADH1 ＞pHXT7。Sun等［29］從釀酒酵母中克隆了14種組成型啟動(dòng)子并通過GFP的發(fā)光強(qiáng)度和mRNA水平來檢測啟動(dòng)子的相對(duì)強(qiáng)度，其中pTEF1強(qiáng)度相對(duì)最高，pPGI1的強(qiáng)度相對(duì)最低。Blount等［31］利用流式細(xì)胞儀檢測了GFP的發(fā)光強(qiáng)度，從而確定pPFY1、pADH1、pCYC1、pBIO2、pCHO1中 pADH1的 強(qiáng) 度相對(duì)最高，pCHO1的強(qiáng)度相對(duì)最低。Monfort等［31-32］通過表達(dá)脂肪酶來比較釀酒酵母中的pACT1、pADH1、pPGK1及pTDH1的相對(duì)強(qiáng)度，最終發(fā)現(xiàn)pACT1的強(qiáng)度相對(duì)最高。

組成型啟動(dòng)子雖然能夠持續(xù)高強(qiáng)度表達(dá)目的蛋白，但基因過量表達(dá)會(huì)造成代謝紊亂，同時(shí)會(huì)引起重組蛋白在生長過程中降解［33］，并且組成型啟動(dòng)子不適用于毒蛋白的表達(dá)。

2.2 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在某些特定的物理及化學(xué)信號(hào)的誘導(dǎo)刺激下，可以大幅度地提高或降低基因的轉(zhuǎn)錄水平，因此可以通過人為添加誘導(dǎo)劑定時(shí)定量地對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)程度進(jìn)行調(diào)控。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子又可以按照功能分為激活型啟動(dòng)子和阻遏型啟動(dòng)子（表3）。

2.2.1 激活型啟動(dòng)子 激活型啟動(dòng)子即正調(diào)控啟動(dòng)子，一般是通過招募轉(zhuǎn)錄激活因子或釋放轉(zhuǎn)錄抑制因子來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的。其優(yōu)點(diǎn)是只有當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，基因才可以正常表達(dá)，沒有誘導(dǎo)物存在時(shí)基因表達(dá)水平很低甚至沒有。

激活型啟動(dòng)子常用的誘導(dǎo)劑有碳源（半乳糖、葡萄糖）、銅離子、生物素及α1調(diào)節(jié)蛋白。目前在釀酒酵母中應(yīng)用最多的激活型啟動(dòng)子是來源于降解半乳糖代謝途徑的半乳糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子（pGAL1、pGAL7、pGAL10）。當(dāng)培養(yǎng)基中的碳源為半乳糖時(shí)，轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子Gal3p與半乳糖結(jié)合后，會(huì)與抑制因子Gal80p相互作用，轉(zhuǎn)錄激活因子Gal4p發(fā)揮活性，從而激活目標(biāo)基因的表達(dá)［34-35］。目前利用該啟動(dòng)子系統(tǒng)已經(jīng)成功在釀酒酵母中合成了青蒿酸［36］、人參皂苷［37］等物質(zhì)。

2.2.2 阻遏型啟動(dòng)子 酵母啟動(dòng)子阻遏系統(tǒng)建立在阻遏蛋白與轉(zhuǎn)錄因子在空間構(gòu)型相互作用的基礎(chǔ)之上。當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，其會(huì)與激活蛋白結(jié)合，阻遏蛋白則與啟動(dòng)子上的元件結(jié)合，抑制基因的轉(zhuǎn)錄。

阻遏型啟動(dòng)子常用的抑制劑有碳源（葡萄糖）、磷酸鹽、鐵離子、蛋氨酸、滲透壓及氧氣。釀酒酵母adh2基因編碼乙醇脫氫酶II，其轉(zhuǎn)錄起始于葡萄糖耗盡，乙醇作為碳源發(fā)酵的同時(shí)，轉(zhuǎn)錄激活因子乙醇脫氫酶調(diào)節(jié)蛋白Adr1可大量表達(dá)并起始ADH2的轉(zhuǎn)錄［38］。目前已經(jīng)有研究團(tuán)隊(duì)利用該啟動(dòng)子表達(dá)外源蛋白，在釀酒酵母工程菌中合成了聚酮化合物［39］、三醋酸內(nèi)酯［40］等物質(zhì)。

應(yīng)用誘導(dǎo)系統(tǒng)可以將細(xì)胞的生長階段與目標(biāo)蛋白的生產(chǎn)階段分開，避免了外源蛋白早期表達(dá)對(duì)自身細(xì)胞的傷害。但該類型啟動(dòng)子存在著操作繁瑣，誘導(dǎo)劑價(jià)格昂貴，添加的誘導(dǎo)劑可能會(huì)對(duì)細(xì)胞本身的生長產(chǎn)生負(fù)面影響等諸多在實(shí)際生產(chǎn)中難以解決的問題。

表2 釀酒酵母中常用的組成型啟動(dòng)子

2.3 雙向啟動(dòng)子

雙向啟動(dòng)子普遍存在于釀酒酵母的基因組中，它能以兩個(gè)相反的方向啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。目前釀酒酵母中應(yīng)用最多的雙向啟動(dòng)子載體是pESC載體，通過pGAL1-pGAL10可以在同一時(shí)間轉(zhuǎn)錄兩個(gè)不同的基因，這兩個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相距約600 bp。該系列的載體已用于人參皂苷CK的合成［37］。

2.4 異源啟動(dòng)子

在實(shí)際應(yīng)用中，使用酵母內(nèi)源啟動(dòng)子可能會(huì)干擾酵母的自身代謝反應(yīng)，降低酵母的生長活性，因此可以采用外源啟動(dòng)子來構(gòu)建代謝途徑。其中常用的異源啟動(dòng)子可以來源于病毒、細(xì)菌和真菌等外源宿主。目前，在釀酒酵母中常用巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子pCMV組成型表達(dá)外源基因，它的活性受亞砷酸鹽的調(diào)控［52］。細(xì)菌中的tet操縱子，會(huì)被培養(yǎng)基中的四環(huán)素類似物多西霉素所抑制，而多西霉素并不會(huì)影響酵母的生長狀態(tài)和內(nèi)源基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平［53］。應(yīng)用棉病囊霉（Ashbya gossypii）的 pTEF1進(jìn)行特定位點(diǎn)的同源重組時(shí)，酵母內(nèi)源的pTEF1并不會(huì)影響外源基因的重組效率，同時(shí)又避免了在同源重組過程中因序列相似度高而產(chǎn)生錯(cuò)誤插入［54］。

表3 釀酒酵母中常用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子

3 釀酒酵母啟動(dòng)子優(yōu)化

根據(jù)上文所述，在代謝工程中應(yīng)用自身和異源啟動(dòng)子的方法已經(jīng)獲得了廣泛的應(yīng)用，但隨著功能基因組學(xué)和代謝組學(xué)的快速發(fā)展，科學(xué)家們通過對(duì)現(xiàn)有的啟動(dòng)子進(jìn)行突變、融合的優(yōu)化方式來獲得不同功能、不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子，以期在進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)錄能力的同時(shí)還可以對(duì)宿主代謝進(jìn)行更為精細(xì)的人工調(diào)控。以下將介紹釀酒酵母啟動(dòng)子工程的具體策略及相關(guān)的應(yīng)用實(shí)例。

3.1 天然啟動(dòng)子突變優(yōu)化

在明確天然啟動(dòng)子活性的情況下，可以通過突變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)來改變轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，直接達(dá)到改變其啟動(dòng)強(qiáng)度的目的。根據(jù)作用方式的不同，可以將突變優(yōu)化分為隨機(jī)突變優(yōu)化（易錯(cuò)PCR、飽和誘變）和定向突變優(yōu)化（直接修飾）。

易錯(cuò)PCR（Error-prone PCR）適用于整個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域，通過隨機(jī)突變可產(chǎn)生具有不同的強(qiáng)度和功能的啟動(dòng)子。Redden和Nevoigt等［55-56］使用易錯(cuò)PCR將pTEF1隨機(jī)突變并篩選出活性范圍是天然pTEF1活性 8%-120%的11個(gè)突變體，最終發(fā)現(xiàn)兩個(gè)活性中等的啟動(dòng)子可以降低副產(chǎn)物甘油的產(chǎn)量，該研究使酒精、甘油產(chǎn)量及細(xì)胞生長三者之間達(dá)到一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)。此外，也有人將pDAN1隨機(jī)突變并得到兩個(gè)對(duì)氧氣含量不敏感的突變體，使下游基因的表達(dá)量顯著增加，大大提升了終產(chǎn)物的合成量［57］。2015年，張旭等［58］利用易錯(cuò)PCR 篩選得到的具有高表達(dá)性能的pTEFV1，使GFP和人血清白蛋白的表達(dá)能力較改造前有明顯增加。

飽和誘變（Saturation mutagenesis）是指對(duì)基因的某一特定局部小區(qū)域內(nèi)的堿基進(jìn)行所有類型的突變。該技術(shù)最早應(yīng)用于細(xì)菌啟動(dòng)子系統(tǒng)，有效地改變了單基因或多基因操縱子的表達(dá)水平［59］。Jeppsson團(tuán)隊(duì)參考天然啟動(dòng)子相關(guān)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了一個(gè)名為YRP的啟動(dòng)子［60-61］，降低了葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性，進(jìn)而增加乙醇的產(chǎn)量。對(duì)pPFY1的非必需區(qū)域進(jìn)行飽和誘變可篩選得到36個(gè)有不同活性的非天然啟動(dòng)子。近年來也有人對(duì)pSUL1中的493 bp序列進(jìn)行誘變及篩選，發(fā)現(xiàn)突變后的結(jié)構(gòu)可以提高轉(zhuǎn)錄效率［62］。

事實(shí)上，對(duì)啟動(dòng)子強(qiáng)度的調(diào)控是基于核苷酸序列響應(yīng)轉(zhuǎn)錄機(jī)制的累積效應(yīng)。直接對(duì)目標(biāo)啟動(dòng)子的上游元件進(jìn)行增加或刪除修飾就可以得到活性不同的啟動(dòng)子。將pGAL1上游激活元件UASGAl串聯(lián)加倍得到的突變啟動(dòng)子UASGal-pGAL1在半乳糖誘導(dǎo)下其活性略高于pGAL1［64］。對(duì)pADH1的5′端調(diào)控區(qū)域進(jìn)行不同程度的刪減可以顯著改變啟動(dòng)子對(duì)葡萄糖的應(yīng)答，從而改變基因的表達(dá)強(qiáng)度［64-67］。此外，通過直接優(yōu)化轉(zhuǎn)錄因子也可以達(dá)到增強(qiáng)啟動(dòng)子活性的目的。釀酒酵母pARO9在添加外源色氨酸的情況下可以組成型表達(dá)，而蛋白質(zhì)工程優(yōu)化后的轉(zhuǎn)錄因子Aro80p可增強(qiáng)與該啟動(dòng)子的結(jié)合效率，從而增強(qiáng)該啟動(dòng)子的活性［68-69］?；趐GAL的作用機(jī)制，敲除抑制因子Gal80后的啟動(dòng)子在葡萄糖中具有組成型表達(dá)的活性［70］。

3.2 人工啟動(dòng)子雜合優(yōu)化

雜合啟動(dòng)子就是將兩種或兩種以上不同來源的啟動(dòng)子元件融合構(gòu)成的一個(gè)新的啟動(dòng)子。雜合啟動(dòng)子的高強(qiáng)度和穩(wěn)定性對(duì)于精細(xì)調(diào)控細(xì)胞中的基因表達(dá)具有極其重要的意義。

釀酒酵母中的雜合啟動(dòng)子大多是將自身不同的啟動(dòng)子核心區(qū)域與調(diào)節(jié)區(qū)域融合進(jìn)而增強(qiáng)雜合啟動(dòng)子的活性。將不同比例或組合型的轉(zhuǎn)錄激活元件分別與pTDH3融合后，發(fā)現(xiàn)串聯(lián)3倍的UASCLB啟動(dòng)子可使轉(zhuǎn)錄活性提高2.5倍。因此，利用該方法可以將弱啟動(dòng)子定向轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)啟動(dòng)子。此外，與天然啟動(dòng)子相比雜合啟動(dòng)子的活性更加穩(wěn)定，將3個(gè)串聯(lián)的激活元件UASCLB與pTEF1的核心區(qū)域所組裝而成的人工雜合paTEF1在不同宿主的不同生長階段其活性均高于天然pTEF1［71］。

釀酒酵母雜合啟動(dòng)子的構(gòu)建也可以采用將不同來源的啟動(dòng)子核心區(qū)域與調(diào)節(jié)區(qū)域融合的方式。其中，在釀酒酵母中應(yīng)用最多的異源啟動(dòng)子為細(xì)菌的四環(huán)素操縱子。1997年，Gari等［72］構(gòu)建了一系列由tetO-CYC1雜合啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體，在缺乏抑制劑多西霉素的環(huán)境下，基因的表達(dá)活性可以提高1 000倍，該啟動(dòng)子可應(yīng)用于P-蛋白和羊毛甾醇脫甲基酶的表達(dá)［73-74］。而后Belli團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一個(gè)釀酒酵母四環(huán)素操縱子誘導(dǎo)基因表達(dá)的雙系統(tǒng)，將反式激活因子中的tetR進(jìn)行突變優(yōu)化并命名為tetR’，通過外源施加的四環(huán)素可快速激活下游基因表達(dá)［75-76］。

另外，也有利用雜合轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá)的可調(diào)控系統(tǒng)。例如，Shimizu-Sato等［77］通過表達(dá)兩種嵌合蛋白光敏色素的Gal4-DNA結(jié)合域和PIF3-Gal4激活域，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)光信號(hào)調(diào)控下的基因表達(dá)調(diào)控目標(biāo)，構(gòu)建了一個(gè)可精確定量的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，有利于工業(yè)生產(chǎn)的大規(guī)模應(yīng)用。也有應(yīng)用人類激素來調(diào)控啟動(dòng)子的活性，構(gòu)建含有β-雌二醇受體、Gal4結(jié)合域，以及皰疹病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的雜合轉(zhuǎn)錄激活因子，通過添加β-雌二醇可以顯著提高下游基因的表達(dá)水平［78］。2016 年，Hector等［79］利用芽孢桿菌中的DNA結(jié)合阻遏因子（XylR）與pTEF形成的新型雜合啟動(dòng)子，使pTEF的表達(dá)強(qiáng)度在木糖培養(yǎng)條件下增加25倍。

釀酒酵母啟動(dòng)子的優(yōu)化在代謝工程精細(xì)調(diào)節(jié)方面擁有巨大的潛能，為了突出比較上述4種啟動(dòng)子優(yōu)化策略的特點(diǎn)，現(xiàn)將其優(yōu)缺點(diǎn)總結(jié)如下（表4）。

表4 釀酒酵母啟動(dòng)子優(yōu)化類型的優(yōu)缺點(diǎn)

4 總結(jié)和展望

釀酒酵母是一種食品級(jí)、基因組結(jié)構(gòu)最為簡單的真核微生物，具備安全、遺傳操作便捷、培養(yǎng)簡單和繁殖迅速等優(yōu)勢，是生產(chǎn)重組蛋白較理想的表達(dá)系統(tǒng)之一。啟動(dòng)子是代謝工程中最基本的功能元件，是最有效的調(diào)節(jié)代謝途徑的工具。通過改造釀酒酵母啟動(dòng)子從而改變其自身的代謝途徑來高效地獲取目標(biāo)天然產(chǎn)物已成為一種極具前景的策略。本文梳理了當(dāng)前利用釀酒酵母合成天然產(chǎn)物過程中的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)和在釀酒酵母工程菌中使用的4類天然啟動(dòng)子，總結(jié)概括了每一類別的特點(diǎn)。此外，為了提高釀酒酵母啟動(dòng)子活性達(dá)到能夠更加高效的合成目標(biāo)天然產(chǎn)物的目的，歸納了釀酒酵母啟動(dòng)子突變和雜合的兩種優(yōu)化策略，以及該技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中的一些應(yīng)用。

近年來，隨著合成生物學(xué)的發(fā)展和技術(shù)手段的更新，越來越多的研究人員在探索原核啟動(dòng)子模型中做出了巨大貢獻(xiàn)，如通過在原核啟動(dòng)子上采用“絕緣化”和“非門”（NOT gate）功能基因網(wǎng)絡(luò)預(yù)測的方法，表明該方法可以顯著提高它們的模塊化屬性和組裝過程的可預(yù)測性［84］。此外，Rohlhill等［85］采用熒光激活細(xì)胞分類術(shù)（FACS）和高通量篩選對(duì)大腸桿菌甲醛誘導(dǎo)啟動(dòng)子進(jìn)行精確地定量分析，確定了單核苷酸分辨率，從而更高效的協(xié)調(diào)基因表達(dá)，并在合成生物學(xué)和代謝工程中建立了可預(yù)測的基因電路。基于當(dāng)前的研究，越來越多的研究者也會(huì)對(duì)真核啟動(dòng)子進(jìn)行深入探索，有望提高啟動(dòng)子控制基因的表達(dá)效率。

未來，通過啟動(dòng)子工程技術(shù)，釀酒酵母啟動(dòng)子將朝著以下幾個(gè)方向進(jìn)行改進(jìn)：（1）研發(fā)基因表達(dá)量可控的組成型啟動(dòng)子；（2）研發(fā)培養(yǎng)條件溫和、操作簡單、誘導(dǎo)劑成本低廉的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；（3）具有高效轉(zhuǎn)錄效率的異源啟動(dòng)子并在發(fā)酵培養(yǎng)過程中得到有效控制；（4）研發(fā)能夠更加高效、穩(wěn)定、可控、成本低廉、可工業(yè)化的釀酒酵母啟動(dòng)子將是未來啟動(dòng)子工程技術(shù)突破的關(guān)鍵。這些研究成果的推廣與應(yīng)用，將有力地推進(jìn)人工構(gòu)建生命系統(tǒng)的研究進(jìn)程，從而滿足人們?cè)诮】?、醫(yī)療、環(huán)境、食品等領(lǐng)域的高層次需求。

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