梁玉林 劉秀 周鵬飛 周振森 尹建軍

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015）

大腸桿菌是人腸道中正常的革蘭氏陰性菌，大多數(shù)大腸桿菌沒有致病性。正常情況下這些細(xì)菌寄生在人的消化道中，并隨糞便排出體外，因此大腸桿菌廣泛存在水和土壤中［1-4］。如果人體免疫機(jī)能降低或者大腸桿菌入侵腸道外組織時(shí)，它們會成為條件致病菌從而引起人類疾病。根據(jù)不同的生物學(xué)特性將致病性大腸桿菌分為5類：致病性大腸桿菌（Enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）、腸侵襲性大腸桿菌（Enteroinvasive Escherichia coli，EIEC）、腸出血性大腸桿菌（Enterohernorrhage Escherichia coli，EHEC）和腸黏附性大腸桿菌（Enteroadhesive Escherichia coli，EAEC）。腸出血性大腸桿菌主要包括O157、O26、O111和O104等幾種血清型［5-7］。其中大腸桿菌O157是最主要的食源性致病菌之一，它除了能引起腹瀉、出血性腸炎外，還可發(fā)生溶血性尿毒綜合癥（Hemolytic uremic syndrome，HUS）、血栓性血小板減少性紫癜（Thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP）等并發(fā)癥，后者病情嚴(yán)重，病死率高［8］。感染性腹瀉是近年新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病。自1982年美國首次發(fā)現(xiàn)該病以來，在許多國家相繼爆發(fā)和流行，其流行已成為全球性公共衛(wèi)生問題之一［9］。

大腸桿菌O157檢測方法主要是傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法［10］，分離出的病原菌還要對其進(jìn)一步分型確認(rèn)。該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，當(dāng)某種致病菌的檢測需要快速出具結(jié)果時(shí)，傳統(tǒng)培養(yǎng)分離法的嚴(yán)重滯后性就會凸顯出來。近年來，致病菌分子檢測方法層出不窮，分子檢測不但省時(shí)省力而且具有比較高的特異性和靈敏度［11］。張微等［12］利用熒光定量PCR技術(shù)，建立快速、有效的檢測乳中大腸桿菌O157的方法。盡管該方法操作簡單，靈敏度達(dá)到67 CFU/mL，但需要專業(yè)人員和高精密的儀器設(shè)備，不易在基層推廣。因此，需要開發(fā)一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法來現(xiàn)場檢測大腸桿菌O157。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是一種新的核酸擴(kuò)增方法［13］，其擴(kuò)增過程中的DNA聚合酶采用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，整個(gè)DNA擴(kuò)增是在60-65℃恒溫條件下進(jìn)行的快速擴(kuò)增反應(yīng)。由于DNA雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在死菌中能長時(shí)間存在，以DNA為檢測模板容易檢出死菌中殘留的核酸而出現(xiàn)假陽性的后果，不能體現(xiàn)樣本中的活菌數(shù)量［14］。RNA易降解，不能長時(shí)間存在于死菌當(dāng)中，反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）技術(shù)是以RNA為檢測模板的擴(kuò)增反應(yīng)［15-16］，除了具有常規(guī)LAMP的優(yōu)勢外，還具有有效區(qū)分死菌和活菌的獨(dú)特優(yōu)勢。本研究以大腸桿菌O157的特異性保守基因序列設(shè)計(jì)多組引物并篩選，構(gòu)建基于RNA為檢測模板的RT-LAMP技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 大腸桿菌O157等26株細(xì)菌如表1所示；溶菌酶，天根生物科技公司；RNeasy Mini kit，QIAgen 公司；Isothermal Master Mix（IMM），英國OptiGene Limited公司；焦炭酸二乙酯（DEPC），中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA），北京路橋技術(shù)股份有限公司；One Step PrimeScript RT-PCR kit，寶生物工程（大連）有限公司。

表1 RT-LAMP反應(yīng)特異性

1.1.2 儀器與設(shè)備 微量移液器，德國Eppendorf公司；高壓滅菌鍋（SX-700），日本Tomy Digital Biology公司；精密天平（CPA323S），德國Sartorius公司；超純水儀（Mili-Q Advantage A10），德國默克公司；離心機(jī)（5804R型，5424型），德國Eppendorf公司；超微量核酸蛋白分析儀（Biodrop），英國柏點(diǎn)公司；GenieⅢ，英國OptiGene Limited公司；生物安全柜，新加坡Esco公司。ABI 7900熒光PCR儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中的rfbE基因（GenBank Accession S83460.1）的序列，利用LAMP Primer Explorer 4在線軟件（http：//primer explorer.jp/elamp4.0.0/index.htm l）設(shè)計(jì)8組引物，每組引物分別包括外引物F3、B3，內(nèi)引物FIP、BIP和環(huán)引物L(fēng)oopF、LoopB。將8組引物進(jìn)行RT-LAMP實(shí)驗(yàn)，選取穩(wěn)定性強(qiáng)、擴(kuò)增時(shí)間快和熒光值相對較高的引物組進(jìn)行下一步試驗(yàn)，每組引物平行進(jìn)行3次RTLAMP測試。

1.2.2 純培養(yǎng)細(xì)菌的RNA提取 在平板上取大腸桿菌O157單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h到對數(shù)期。取1 mL菌液5 000×g離心10 min，輕輕倒掉液體。向沉淀加入10 μL蛋白酶K，100 μL TE（含終濃度15 mg/mL溶菌酶），充分混勻沉淀，在室溫下反應(yīng)30 min，接下步驟嚴(yán)格按照RNeasy Mini kit操作步驟提取。

1.2.3 rRT-PCR和RT-LAMP反應(yīng) rRT-PCR擴(kuò)增引 物 rfbE-F ：5′-TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTG-3′，rfbE-R ：5′-ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-3′，rfbE-BJP ：5′-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCT GG-3′。按照 One Step PrimeScript RT-PCR kit操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和進(jìn)一步核酸擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15s，60℃ 1 min，共45個(gè)循環(huán)。對于Ct值≤40的擴(kuò)增結(jié)果判定為陽性。

經(jīng)優(yōu)化后在 12.5 μL 體系中，包括 7.5 μL Mix、2.5 μL混合引物（外引物、內(nèi)引物和環(huán)引物含量分別為2.5 pmol、10 pmol和 5 pmol）、1.5 μL 模 板。RT-LAMP反應(yīng)溫度65℃，反應(yīng)時(shí)間30-60 min。

1.2.4 大腸桿菌O157死菌中RNA降解情況 為驗(yàn)證大腸桿菌O157死菌中RNA降解情況，避免死菌中DNA對RT-LAMP檢測結(jié)果的干擾。我們選取104、103、102、101CFU/mL 四個(gè)菌液濃度。121℃下20 min高壓蒸汽滅菌，放置一段時(shí)間，模擬死菌狀態(tài)，對死菌進(jìn)行平板培養(yǎng)，驗(yàn)證是否滅菌完全。分別對滅菌前后各濃度梯度的大腸桿菌O157菌液進(jìn)行RNA提取，并進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。

1.2.5 RT-LAMP反應(yīng)的特異性和靈敏度 提取大腸桿菌O157等26株細(xì)菌RNA，并以RNA為檢測模板進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)驗(yàn)證該方法的特異性。

將提取的大腸桿菌O157原菌液總RNA測定濃度后，對總RNA進(jìn)行稀釋，最后選取3 fg、30 fg、300 fg、3 pg、30 pg、300 pg、3 ng/μL 共 7 個(gè) 濃 度梯度，從各濃度梯度各取1.5 μL作為檢測樣本進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)檢測純培養(yǎng)大腸桿菌O157靈敏度。

1.2.6 rRT-PCR和RT-LAMP反應(yīng)在人工污染脫脂乳中的靈敏度檢測 為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，經(jīng)國標(biāo)GB/T4789.2-2016方法證實(shí)試驗(yàn)所用脫脂乳中不含大腸桿菌O157，取25 g脫脂乳置于225 mL滅菌生理鹽水中樣品。取新鮮培養(yǎng)的12 h細(xì)菌，用生理鹽水充分洗滌培養(yǎng)基，10倍梯度系列稀釋，取各稀釋度菌液1 mL加入脫脂乳勻漿中，制備人工污染脫脂乳勻漿，使人工污染脫脂乳勻漿中大腸桿菌O157含量達(dá)到10-1-105CFU/mL，充分混合，作為人工污染脫脂乳樣品。

取各菌液濃度的人工污染脫脂乳樣品1 mL，提取人工污染脫脂乳樣品中的RNA，同時(shí)取不加大腸桿菌O157的脫脂乳樣品1 mL作為陰性對照平行進(jìn)行RNA提取。以提取的RNA為檢測模板分別進(jìn)行rRT-PCR和RT-LAMP反應(yīng)，比較兩種方法的檢測靈敏度。每個(gè)濃度的RNA模板分別進(jìn)行5次獨(dú)立rRTPCR和RT-LAMP試驗(yàn)，當(dāng)某個(gè)濃度梯度的RNA模板的5次試驗(yàn)中有1次無法觀察到擴(kuò)增曲線，該濃度的上一稀釋度才能被認(rèn)定為最低檢測靈敏度。

2 結(jié)果

2.1 八組大腸桿菌O157引物篩選

根據(jù)引物間距離、GC含量、引物序列Tm值、引物末端穩(wěn)定性和二級結(jié)構(gòu)5個(gè)因素，實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)了8組LAMP引物。如圖1在整個(gè)實(shí)驗(yàn)室不含大腸桿菌O157核酸樣品情況下，對8組引物進(jìn)行RTLAMP擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)現(xiàn)3號、4號和8號引物均發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，可以斷定該擴(kuò)增反應(yīng)是非特異性的，可能是由于引物間的堿基互補(bǔ)配對引起的擴(kuò)增反應(yīng)。如圖2在含有大腸桿菌O157核酸樣品情況下，對8組引物進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，2號引物出現(xiàn)擴(kuò)增曲線的時(shí)間最短。綜合3次測試結(jié)果，2號引物具有較高的穩(wěn)定性，其在反應(yīng)時(shí)間上明顯比其它引物組都快且熒光值相對較好。選取2號引物作為RT-LAMP反應(yīng)引物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，2號引物序列如表2。

圖1 大腸桿菌O157引物篩選（不含檢測模板）

圖2 大腸桿菌O157引物篩選（含檢測模板）

2.2 大腸桿菌O157死菌中RNA降解情況

在121℃下20 min高壓蒸汽滅菌處理的大腸桿菌O157，經(jīng)平板培養(yǎng)觀察未發(fā)現(xiàn)形成菌落，滅菌后的細(xì)菌均無繁殖能力。對滅菌前后不同濃度的大腸桿菌O157菌液進(jìn)行RNA提取，并經(jīng)RT-LAMP檢測。圖3為滅菌前大腸桿菌O157 RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，可以看出提取101CFU/mL菌液RNA進(jìn)行RTLAMP反應(yīng)仍能出現(xiàn)熒光擴(kuò)增，說明反應(yīng)體系中存在RNA。圖4為滅菌后大腸桿菌O157 RT-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，可以得出各菌液濃度的核酸提取物中未含有RNA。結(jié)合圖3和圖4進(jìn)一步證實(shí)104CFU/mL及其以下死菌菌液中RNA降解完全，以RNA為檢測模板進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)可以鑒別死活菌。

表2 大腸桿菌O157靶基因引物序列

圖3 活菌RNA檢測

圖4 死菌RNA檢測

2.3 RT-LAMP反應(yīng)特異性和靈敏度

本研究共對26株細(xì)菌進(jìn)行RT-LAMP試驗(yàn)，其中只有2株大腸桿菌O157產(chǎn)生特異性擴(kuò)增反應(yīng)，其他大腸桿菌血清型和非大腸桿菌菌株均未產(chǎn)生特異性擴(kuò)增反應(yīng)（表1）。說明篩選到的引物具有較高的特異性，只能特異性檢出大腸桿菌O157。

對提取的純培養(yǎng)大腸桿菌O157的總RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，驗(yàn)證建立的方法對純培養(yǎng)大腸桿菌O157的檢測靈敏度。結(jié)果如圖5所示，當(dāng)總RNA稀釋到30 fg/μL時(shí)，RT-LAMP反應(yīng)仍能產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，而繼續(xù)稀釋核酸將不會產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，表明純培養(yǎng)大腸桿菌O157檢測靈敏度達(dá)到30 fg/μL。

圖5 RT-LAMP反應(yīng)靈敏度

2.4 rRT-PCR和RT-LAMP反應(yīng)在人工污染脫脂乳中的靈敏度檢測

將提取的人工污染脫脂乳樣品RNA溶解到50 μL不含RNase的無菌水中，取其中1.5 μL作模板，分別進(jìn)行rRT-PCR和RT-LAMP反應(yīng)。同時(shí)取1 mL各濃度梯度的人工污染脫脂乳樣品進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，記錄各濃度梯度人工污染脫脂乳樣品中大腸桿菌O157的準(zhǔn)確含量。從圖6可以看出rRT-PCR檢測靈敏度達(dá)到20 CFU/mL，換算成固體脫脂乳污染樣品檢測靈敏度為200 CFU/g。從圖7可以得出RTLAMP反應(yīng)靈敏度達(dá)到2 CFU/mL，換算成固體脫脂乳污染樣品檢測靈敏度為20 CFU/g。所建立的RTLAMP方法靈敏度高，比rRT-PCR反應(yīng)靈敏度高10倍。

圖6 人工污染脫脂乳rRT-PCR反應(yīng)靈敏度

圖7 人工污染脫脂乳RT-LAMP反應(yīng)靈敏度

3 討論

目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的大腸桿菌O157的LAMP檢測方法多以stex、eae、wzy和rfbE等基因作為特異性擴(kuò)增靶基因，其中stex是編碼志賀毒素毒力因子基因［17-19］，但有些大腸桿菌O157缺失stx基因，以stex基因序列設(shè)計(jì)LAMP引物可能不會擴(kuò)增出目的基因條帶進(jìn)而造成假陰性的問題。wzy是編碼O抗原聚合酶的基因［20］，eae是編碼緊密黏附素的基因［21］，然而eae和wzy基因除了存在于大腸桿菌O157外，也少量存在于一些腸科細(xì)菌，以這兩種基因序列設(shè)計(jì)的LAMP引物可能會檢測出大腸桿菌O157以外的腸科細(xì)菌，進(jìn)而造成假陽性的后果。研究表明大腸桿菌的rfb基因作為靶基因具有很好的保守性［22］，大腸桿菌rfb基因是O抗原的編碼基因，不同序列的rfb基因編碼產(chǎn)生不同的O抗原，其中大腸桿菌O157的O抗原特異性編碼基因?yàn)閞fbE基因［23］。本研究以rfbE基因設(shè)計(jì)引物，以RNA為檢測模板進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，結(jié)果能夠證實(shí)所檢測的大腸桿菌O157是否處于活的增殖狀態(tài)［24-26］。此外實(shí)驗(yàn)依靠GenieⅢ平臺使得反轉(zhuǎn)錄過程和擴(kuò)增過程同時(shí)進(jìn)行，大大降低了反應(yīng)時(shí)間，有利于現(xiàn)場快速檢測工作的開展。

在人工污染脫脂乳樣品實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)樣品中大腸桿菌O157濃度稀釋到2 CFU/mL時(shí)，建立的實(shí)時(shí)熒光RT-LAMP方法每次均能特異性檢出，當(dāng)菌液繼續(xù)稀釋到更低時(shí)，該方法有時(shí)不能檢出。對于細(xì)菌含量很少的樣品，尤其是量少也易致病的大腸桿菌O157，如果不經(jīng)過前增菌很有可能造成漏檢的嚴(yán)重后果，為保證結(jié)果的可靠性可以適當(dāng)加上前增菌等步驟。因?yàn)槭艽竽c桿菌O157污染的食品種類很多，實(shí)驗(yàn)只進(jìn)行了人工污染脫脂乳實(shí)驗(yàn)，后期需要擴(kuò)大人工污染食品種類，驗(yàn)證方法的可靠性。

4 結(jié)論

本研究對大腸桿菌O157設(shè)計(jì)多組LAMP引物并篩選，確定反應(yīng)體系配比，從而建立了檢測大腸桿菌O157的實(shí)時(shí)熒光RT-LAMP方法。該方法只特異性檢出大腸桿菌O157，其他大腸桿菌血清型和非大腸桿菌菌株均未產(chǎn)生特異性擴(kuò)增反應(yīng)，對固體脫脂乳污染樣品檢測靈敏度達(dá)到20 CFU/g。

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