凌婷 楊樹萍 魏煜凡 張琳

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

改變微藻的培養(yǎng)條件（如氮磷硅等營養(yǎng)成分、pH、溫度、光強等）既可調(diào)控微藻的脂肪酸組成，又可調(diào)控微藻的總脂含量［1-4］。添加植物生長調(diào)節(jié)劑也是其中一種有效手段。據(jù)報道，2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-Epibrassinosteroid，EBR）、赤霉素（Gibberellin A3，GA3）、吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、水楊酸（Salicylic acid，SA）等植物生長調(diào)節(jié)劑對促進(jìn)微藻生長、優(yōu)化脂肪酸組成、增加抗逆性等有顯著功效［5］。該結(jié)論在小球藻（Chlorella sp.）、球等鞭金藻（Isochrysis galbana）等微藻中得以印證［6］。微擬球藻（Nannochloropsis sp.），屬于真眼點藻綱（Eustigmatophyceae），是一類具有巨大開發(fā)潛力的經(jīng)濟微藻。其富含多糖、蛋白和多不飽和脂肪酸（PUFAs）等高附加值產(chǎn)物，被廣泛用作水產(chǎn)餌料及心臟病、糖尿病等疾病的預(yù)防［7］。此外，微擬球藻油脂含量高，被視為最有發(fā)展前景的生物柴油原材料之一［8］。

目前，植物生長調(diào)節(jié)劑對微擬球藻產(chǎn)油率及脂肪酸組成影響的研究較少，本實驗著重分析了EBR、GA3對微擬球藻大洋種（Nannochloropsis oceanica）生長、產(chǎn)油率和脂肪酸組成的影響，擬找出最適濃度，為微擬球藻的研究和應(yīng)用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

微擬球藻藻種編號為N. oceanica LAMB0001，由中國海洋大學(xué)應(yīng)用微藻生物學(xué)實驗室提供。培養(yǎng)基選用f/2海水培養(yǎng)基［9］。培養(yǎng)溫度（24±1）℃，光 周 期（L∶D）12 h∶12 h， 光 照 強 度 60 μmol photons/（m2·s）。每天固定時間搖瓶4次，防止細(xì)胞貼壁。EBR和GA3購自美國Sigma公司，使用微孔膜過濾除菌配制成母液，低溫保存。

1.2 方法

1.2.1 實驗流程 將微擬球藻培養(yǎng)至指數(shù)生長中期，分別取60 mL接種于新鮮f/2培養(yǎng)基中至總體積300mL，并分別添加EBR和GA3至相應(yīng)的終濃度。EBR和GA3分別設(shè)置4個濃度梯度0、5、15和50 mg/L，每個濃度設(shè)置3個平行。培養(yǎng)10 d，收集細(xì)胞，測定干重、脂肪酸組成及總脂含量。期間，每天監(jiān)測藻液光密度變化。

1.2.2 光密度及干重測定 光密度測定方法：本實驗使用750 nm波長下藻液的吸光度來表示藻液光密度。光密度值代表細(xì)胞密度。干重測定方法：離心收集一定體積的藻液，冷凍干燥后稱取藻粉重量。

1.2.3 總脂含量測定分析 取30 mg冷凍干燥的藻粉至密封性良好的螺口玻璃管中，加入氯仿-甲醇（體積比2∶1）劇烈震蕩15 min，離心（4 000 r/min，10 min）后吸取上清液至新的螺口玻璃管中。重復(fù)抽提3次。向裝有上清液的玻璃管中加入適量NaCl溶液（0.9%），充分震蕩混勻，靜置30 min。吸取下層有機相至新玻璃管中，50℃水浴待氯仿全部揮發(fā)，稱重并計算總脂含量。

1.2.4 脂肪酸組成測定分析 取20 mg冷凍干燥的藻粉置于密封性良好的螺口玻璃管中，加入2 mL KOH-CH3OH溶液（2 mol/L）于75℃水浴鍋中皂化和甲酯化30 min；冷卻至室溫后加入2 mL HCl-CH3OH溶液（3 mol/L），75℃水浴酸化30 min；冷卻后再加入1 mL色譜級正己烷和適量蒸餾水，充分震蕩促進(jìn)分層；吸取正己烷相待測。

脂肪酸組成分析：采用Agilent 6890 Series GC System 氣相色譜儀（US10251016，USA），色譜柱為 HP-5毛 細(xì) 管 柱（30 m×320 μm×0.25 μm，5%Phenyl Siloxane），檢測器為氫火焰離子化檢測器（FID）。使用安捷倫化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（Agilent Chemsation）分析結(jié)果，以面積歸一化法計算脂肪酸組分的相對百分含量。

2 結(jié)果

2.1 EBR和GA3對生長的影響

添加不同濃度EBR的微擬球藻生長狀況如圖1所示。曲線使用Origin 7.0軟件非線性擬合得到，光密度值代表細(xì)胞密度，曲線斜率變化代表生長速率。當(dāng)EBR濃度小于15 mg/L時，隨著EBR濃度升高，微擬球藻對數(shù)生長期不斷延長。培養(yǎng)至第10天，15 mg/L EBR處理組光密度較5 mg/L處理組和對照組分別提高了6.44%和17.45%。由此可見，15 mg/L EBR對其生長促進(jìn)最明顯。而50 mg/L EBR對微擬球藻生長產(chǎn)生了抑制作用，培養(yǎng)僅至第4天，光密度就下降至初始值的47%，顯微觀察發(fā)現(xiàn)藻細(xì)胞已裂解。

與EBR不同，較對照組，本實驗中所設(shè)3種濃度的GA3均能促進(jìn)微擬球藻生長，對數(shù)生長期延長（圖2）。培養(yǎng)10 d后，添加了5、15和50 mg/L GA3的處理組光密度分別比對照組高出 14.54%，17.51%和29.28%；50 mg/L GA3處理下光密度達(dá)到最大。說明GA3對微擬球藻的細(xì)胞增殖十分有效。

圖1 不同濃度EBR對微擬球藻藻液光密度的影響

2.2 EBR和GA3對生物量、總脂含量及產(chǎn)油率的影響

本實驗所設(shè)50 mg/L EBR顯著抑制微擬球藻生長，藻液濃度過低，以致無法收集測定后續(xù)指標(biāo)。如表1所示，添加較低濃度（5、15 mg/L）的EBR后，該藻生物量較對照組顯著增加，分別增加了9.19%、13.97%，而總脂含量并未發(fā)生顯著變化。綜合生物量和總脂含量來看，添加5和15 mg/L EBR后該藻產(chǎn)油率較對照組分別增加了7.85%和13.97%。生物量增幅與產(chǎn)油率增幅相近，由此推測EBR對微擬球藻產(chǎn)油率的提高主要歸功于其對該藻生物量積累的促進(jìn)，并不影響單位質(zhì)量藻細(xì)胞的總脂含量。

圖2 不同濃度GA3對微擬球藻液光密度的影響

表1 EBR和GA3對微擬球藻生物量及總脂含量的影響

由表1可知，在實驗濃度范圍內(nèi)，GA3處理組微擬球藻生物量較對照組顯著提高，且隨GA3濃度增加而增加；當(dāng)GA3為50 mg/L時，生物量最高達(dá)0.337 g/L。而總脂含量與之不同，5、15、50 mg/L處理組較對照組均沒有顯著變化。綜合生物量和總脂含量分析，產(chǎn)油率在GA3為15 mg/L時達(dá)到最大值（8.184 mg/（L·d）），顯著高于對照組及5和50mg/L處理組。以上結(jié)果表明，實驗所設(shè)濃度GA3均顯著促進(jìn)了微擬球藻生物量的積累，而對總脂含量影響不大。產(chǎn)油率的差異主要是來自GA3對微擬球藻生長的影響?？傮w來看，15 mg/L GA3對產(chǎn)油率提高效果最顯著。

2.3 EBR和GA3對脂肪酸組成的影響

不同濃度EBR和GA3對微擬球藻脂肪酸組成的影響如表2和表3所示。與對照相比，不同濃度的EBR和GA3對14∶0（十四烷酸，其中14代表脂肪酸碳鏈長度，0代表雙鍵的數(shù)量；以此類推）所占比例基本無影響，16∶0、16∶1、18∶1所占比例隨著EBR和GA3濃度升高而顯著降低，而18∶2、20∶4、20∶5（EPA）所占比例顯著提高。特別是EPA含量顯著提高，培養(yǎng)僅10 d，15和50 mg/L GA3處理組中其含量即分別達(dá)到了34.96%和36.34%。

表2 EBR濃度對微擬球藻脂肪酸組成的影響

表3 GA3濃度對微擬球藻脂肪酸組成的影響

3 討論

3.1 EBR和GA3對微擬球藻生長的影響

EBR是一種廣譜、無毒的高活性植物激素，其最突出的作用是促進(jìn)細(xì)胞伸長與分裂、促進(jìn)植物光合作用及增加植物抗逆性［10-12］。范新照等［13］認(rèn)為2 μmol/L EBR即可顯著促進(jìn)微茫藻（Micractinium sp.）生長；而10 μmol/L EBR則顯著抑制其生長，最大生物量較對照組減少了72.83%。王小飛等［14］研究表明，在0-0.2 mg/L范圍內(nèi)，隨EBR濃度升高，三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）生物量呈先增后減之趨勢。本實驗發(fā)現(xiàn)，在5、15 mg/L時，EBR顯著促進(jìn)微擬球藻生長；而50 mg/L EBR則會抑制該藻生長。這與前人研究結(jié)果相似，但因不同藻種對EBR敏感性有差異，其最適作用濃度也不同。

GA3是重要的植物激素之一，其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂。Falkowska等［15］研究了GA3對鎘鉛脅迫條件下普通小球藻（Chlorella vulgaris）的影響，結(jié)果表明，GA3可促進(jìn)細(xì)胞增殖和光合色素及單糖的積累。Park等［16］發(fā)現(xiàn)，1 mg/L GA3對萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）生長促進(jìn)效果最顯著。范新照等［13］使用GA3處理微茫藻后發(fā)現(xiàn)，1 μmol/L GA3對藻株生長有明顯促進(jìn)作用；增加GA3濃度至5 μmol/L 則會顯著抑制該藻生長，其最大生物量比對照組減少了60.70%。據(jù)報道，在一定濃度范圍（0.01-10 mg/L）內(nèi)，隨GA3濃度升高，其對銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）生長促進(jìn)越明顯；濃度過高則會抑制其生長［17］。在本實驗濃度范圍內(nèi)，GA3對微擬球藻生長促進(jìn)效果也隨GA3濃度增大而增強，這與低濃度EBR在其他藻中的作用效果相似。但本實驗中濃度尚未達(dá)到抑制微擬球藻生長的臨界值，更高濃度GA3的作用效果有待后期探索。

3.2 EBR和GA3對微擬球藻總脂含量及產(chǎn)油率的影響

除調(diào)節(jié)微藻生長外，適宜濃度EBR和GA3對其總脂含量也有顯著影響。郝宗娣等［6］研究表明，EBR能顯著提高原始小球藻（Chlorella protothecoides）的總脂含量。王小飛等［14］認(rèn)為0.1 mg/L EBR能顯著提高三角褐指藻的產(chǎn)量和總脂含量。本實驗發(fā)現(xiàn)，EBR處理下的微擬球藻產(chǎn)油率和生物量是同步增加的，而單位質(zhì)量藻細(xì)胞的總脂百分含量并未發(fā)生明顯改變，推測EBR提高微擬球藻產(chǎn)油率是通過促進(jìn)其細(xì)胞增殖實現(xiàn)的。

目前，GA3對微藻總脂含量影響的研究較少。據(jù)報道，1.0 μmol/L GA3處理下，微茫藻油脂含量較對照組有所降低；GA3濃度為5.0 μmol/L 時，其生物量降低但油脂含量卻顯著提高［13］。在本研究中，50 mg/L GA3雖促進(jìn)了微擬球藻生物量積累，但顯著抑制了單位質(zhì)量藻細(xì)胞的總脂含量，而15 mg/L GA3處理下總脂含量和產(chǎn)油率達(dá)到最高，效果較好，且優(yōu)于EBR處理組的效果。綜上，適宜濃度GA3對于促進(jìn)該藻生長、總脂積累作用顯著。

3.3 EBR和GA3對微擬球藻脂肪酸組成的影響

多不飽和脂肪酸是形成生物膜的必備條件之一，在維持生物膜流動性中起關(guān)鍵作用［18］。此外，參與多個重要生理過程，如物質(zhì)轉(zhuǎn)運［19］和葉綠體形成［20］等。本實驗中，添加EBR（5和15 mg/L）和GA3（5、15和50 mg/L）后，微擬球藻中飽和及單不飽和脂肪酸（16∶0、16∶1、18∶1）占比隨濃度升高而逐漸下降，多不飽和脂肪酸（18∶2、20∶4、20∶5）占比則顯著提高。培養(yǎng)10 d后，15和50 mg/L GA3處理組中EPA含量即分別達(dá)到了34.96%和36.34%。結(jié)果表明，一定濃度EBR和GA3可促進(jìn)微擬球藻生長和油脂積累并優(yōu)化其脂肪酸組成。EPA屬于ω3系長鏈多不飽和脂肪酸，具有維持生物膜的結(jié)構(gòu)和功能、預(yù)防心腦血管疾病、提高機體免疫力和改善視力等功效［21］。作為EPA主要來源，現(xiàn)有魚油難以滿足人們的持續(xù)需求［22］，微擬球藻作為一類重要的經(jīng)濟微藻，在EPA生產(chǎn)上潛力巨大。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，5、15 mg/L EBR能顯著促進(jìn)微擬球藻生長和提高其產(chǎn)油率，但對單位質(zhì)量藻細(xì)胞總脂含量影響不大。50 mg/L EBR則顯著抑制該藻生長。5、15和50 mg/L GA3均顯著促進(jìn)微擬球藻生物量積累。15 mg/L GA3對微擬球藻產(chǎn)油率提升效果最顯著。50 mg/L GA3處理組生物量最高，但總脂積累受到一定抑制。添加EBR和GA3濃度后，飽和和單不飽和脂肪酸占比下降，多不飽和脂肪酸占比顯著提高。

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