吳 悠，湯婷婷，朱琴華，金 亮，潘 怡

(中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南京 210009)

乳腺癌是一種發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是全世界女性中發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤。乳腺癌癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移造成的疾病是絕大多數(shù)乳腺癌患者死亡的根本原因[1]，因此尋找抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛在藥物十分必要。

微小核糖核酸(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度為18～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。miRNA與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移、血管生成、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[2]。不同的miRNA在腫瘤中的表達(dá)情況不同，對(duì)腫瘤的發(fā)生及轉(zhuǎn)移也起到不同的作用[3]。研究表明，miR-29a在乳腺癌組織中有所升高，并促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4-5]。因此，本研究考察miR-29a對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)作用，研究miR-29a調(diào)控乳腺癌轉(zhuǎn)移的新機(jī)制，為抗乳腺癌的藥物篩選提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新思路。

1 材 料

1.1 試 劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；Lipofectamine 2000、Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、胰蛋白酶、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗人GAPDH單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(美國(guó)CST公司)；兔抗人HBP1多克隆抗體(美國(guó)SAB公司)；miR-29a模擬物、miR-29a抑制劑、模擬物陰性對(duì)照、抑制劑陰性對(duì)照、miRNA實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR定量試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)公司)。

1.2 儀 器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Roche公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)；顯微圖象采集系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.3 細(xì) 胞

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、人胚腎細(xì)胞系HEK-293T由中國(guó)藥科大學(xué)生物技術(shù)中心保存。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)90%以上時(shí)，用胰蛋白酶消化，按照1∶3的比例傳代。將細(xì)胞以每孔2×105個(gè)的細(xì)胞比例種于6孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)

用Trizol法提取總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)，檢測(cè)其中miR-29a和HBP1基因mRNA水平的表達(dá)，qPCR反應(yīng)數(shù)據(jù)以循環(huán)閾值(Ct)記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，miR-29a以u(píng)6為內(nèi)參，HBP1以GAPDH為內(nèi)參，相對(duì)定量各實(shí)驗(yàn)組樣品內(nèi)miR-29a和HBP1基因的表達(dá)(miR-29a和u6的引物來(lái)自miRNA實(shí)時(shí)熒光定量 RT-qPCR 定量試劑盒；HBP1和GAPDH引物序列見(jiàn)表1)。

Table1 Primer sequences used for qPCR

Primer Sequence (5'?3')GAPDH-FGGAGCGAGATCCCTCCAAAATGAPDH-RGGCTGTTGTCATACTTCTCATGGHBP1-FTCATCACCATTGGAAGGAGGAHBP1-RTTGCACCATCCCAAATCATCA

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將miR-29a模擬物、miR-29a抑制劑、模擬物陰性對(duì)照、抑制劑陰性對(duì)照(序列見(jiàn)表2)干粉瞬時(shí)離心后，用含RNA酶抑制劑的ddH2O溶解，在避光的條件下吹打混勻，配制成終濃度為20 μmol/L的工作液(使用時(shí)的終濃度均為100 nmol/L)，-20 ℃貯存。取“2.1”項(xiàng)中所述種于6孔板的細(xì)胞，按照Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，6 h后更換為新的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 劃痕愈合遷移實(shí)驗(yàn)

將種植于6孔板中的細(xì)胞按照“2.3”項(xiàng)下方法轉(zhuǎn)染24 h后，利用1 mL槍頭在細(xì)胞層中形成劃痕，于0，48 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，隨機(jī)選取3處進(jìn)行拍照。每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

Table2 Sequences of miR-29a mimic/inhibitor and their controls

PrimerSequence (5'?3')miR-29a mimicSenseUAGCACCAUCUGAAAUCG-GUUAAntisenseACCGAUUUCAGAUGGUGC-UAUUControl mimicSenseUUCUCCGAACGUGUCACGUTTAntisenseACGUGACACGUUCG-GAGAATTmiR-29a inhibi-torUAACCGAUUUCAGAUGGUGC-UAControl inhibitorCAGUACUUUUGUGUAGUA-CAA

2.5 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)

按照“2.3”項(xiàng)下方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，將細(xì)胞進(jìn)行消化，加入無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基吹打混勻，調(diào)整細(xì)胞的濃度為每毫升5×105個(gè)，在Transwell小室的下室加入含5% FBS的DMEM培養(yǎng)基800 μL，在上室加入混勻的細(xì)胞懸液200 μL(在實(shí)驗(yàn)前4～6 h將matrigel膠儲(chǔ)液用無(wú)血清及抗生素的DMEM培養(yǎng)基按1∶6進(jìn)行稀釋，以每孔50 μL的體積加入到Transwell 侵襲小室中)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)36～48 h后，經(jīng)4%多聚甲醛固定20 min和結(jié)晶紫染色20 min后，用棉簽小心擦去膜上面的細(xì)胞，用顯微圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行觀察并隨機(jī)選取視野進(jìn)行拍照。

2.6 靶基因預(yù)測(cè)和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

通過(guò)生物信息預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan7.1對(duì)miR-29a進(jìn)行檢索，預(yù)測(cè)其靶基因，然后將預(yù)測(cè)到的靶基因HBP1作為研究對(duì)象。人工合成野生型片段(HBP1-WF/WR)，并引入SpeⅠ和HindⅢ 限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)；在野生序列基礎(chǔ)上，另外設(shè)計(jì)合成了種子序列互補(bǔ)序列的突變位點(diǎn)，合成突變型片段(HBP1-MF/MR)(具體序列見(jiàn)表3，粗體表示酶切位點(diǎn))。包含目標(biāo)基因的片段經(jīng)退火后導(dǎo)入pMIR-REPORT質(zhì)粒。將生長(zhǎng)良好的HEK-293T細(xì)胞種于24孔板中，于24孔板的每一孔中，分別共轉(zhuǎn)染熒光素酶質(zhì)粒(或相對(duì)應(yīng)的突變質(zhì)粒)1 μg、海腎熒光素酶質(zhì)粒0.3 μg以及相應(yīng)量的miR-29a模擬物或miR-29a抑制劑或各自對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染48 h后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)熒光水平以及進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算。

Table3 Primer sequences used for luciferase report assay

2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞裂解提取蛋白，加入上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，再轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，將膜置于含50 g/L脫脂牛奶的TBST室溫封閉1 h;再分別加入相應(yīng)的兔抗人HBP1抗體及兔抗人GAPDH 抗體，4 ℃過(guò)夜，次日以TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL顯色系統(tǒng)定影顯色，觀察條帶并進(jìn)行灰度掃描。以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié) 果

3.1 miR-29a在不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

MDA-MB-231屬于高轉(zhuǎn)移性惡性乳腺癌細(xì)胞系，MCF-7為原位ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系，惡性程度較MDA-MB-231低，本研究比較了不同乳腺癌細(xì)胞系中miR-29a的表達(dá)水平。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，miR-29a在MDA-MB-231中的表達(dá)明顯高于在MCF-7中，miR-29a在惡性程度更高的MDA-MB-231中表達(dá)較高提示miR-29a的潛在促腫瘤作用。

***P<0.001vsMCF-7 group

3.2 過(guò)表達(dá)和敲除miR-29a的轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證

將miR-29a模擬物、miR-29a抑制劑及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，與模擬物陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-29a模擬物的細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與抑制劑陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-29a抑制劑的細(xì)胞中miR-29a的表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傊?，以上結(jié)果說(shuō)明有效地實(shí)現(xiàn)了miR-29a的過(guò)表達(dá)和敲除。

***P<0.001vscontrol mimic group;*P<0.05vscontrol inhibitor group

3.3 miR-29a對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的體外侵襲和遷移的促進(jìn)作用

體外遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模擬物陰性對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-29a的細(xì)胞劃痕間隙變化顯著升高(圖3-A)；與抑制劑陰性對(duì)照組相比，敲除miR-29a的細(xì)胞劃痕間隙變化顯著降低(圖3-B)。體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-29a的細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)增多(圖4-A)；相應(yīng)的，敲除miR-29a的細(xì)胞侵襲數(shù)減少(圖4-B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.4 靶基因預(yù)測(cè)及HBP1的熒光素酶驗(yàn)證

通過(guò)預(yù)測(cè)分析，miR-29a序列與HBP1 3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)存在一個(gè)互補(bǔ)結(jié)合區(qū)，HBP1可能為miR-29a的特異性靶基因。本研究進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)表明HBP1為miR-29a的直接靶基因，miR-29a與HBP1的3′-UTR區(qū)存在直接靶向作用。

3.5 Western blot和RT-qCR檢測(cè)HBP1蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)

Western blot結(jié)果(圖6)顯示，過(guò)表達(dá)和敲除miR-29a分別可下調(diào)和上調(diào)HBP1在蛋白水平的表達(dá)。然而，RT-qPCR結(jié)果(圖7)顯示，miR-29a的過(guò)表達(dá)和敲除對(duì)HBP1的mRNA水平?jīng)]有影響。

Figure3 Effects of miR-29a mimic (A) and inhibitor (B) on the migration of MCF-7 cells

Figure4 Effects of miR-29a mimic (A,36 h) and inhibitor (B,48 h) on the invasion of MCF-7 cells

**P<0.01vscontrol mimic/WT group;*P<0.05vscontrol inhibitor/WT group

Figure6 Effects of miR-29a mimic (A) and inhibitor (B) on the protein expression of HBP1 in MCF-7 cells

4 討 論

miRNA參與細(xì)胞增殖、遷移、分化和細(xì)胞周期等多種生物過(guò)程。miRNA主要通過(guò)結(jié)合靶基因的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)來(lái)控制其靶mRNA的表達(dá)，單個(gè)基因的UTR區(qū)可以具有多個(gè)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)或者某一個(gè)miRNA的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，這表明由這些miRNA通過(guò)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響基因表達(dá)[6]。

miR-29a位于染色體7q32.3負(fù)鏈的普通型脆性位點(diǎn)FRA7H內(nèi)，可能與腫瘤密切相關(guān)[7]。miR-29a被報(bào)道在多種腫瘤中低表達(dá)且是抑癌因子，如胃癌[8]、胰腺癌[9]、宮頸癌[10]、前列腺癌[11]、食管癌[12]等；然而miR-29a也被報(bào)道在乳腺癌[4]、結(jié)腸癌[13]中表達(dá)上調(diào)，作為促癌基因促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。本研究首先通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT-qPCR檢測(cè)了乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中miR-29a的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與MCF-7細(xì)胞相比，miR-29a在MDA-MB-231中的表達(dá)上調(diào)，因?yàn)橄啾萂CF-7細(xì)胞，MDA-MB-231轉(zhuǎn)移性和惡性程度更高，這提示miR-29a在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中可能起促進(jìn)的作用。為了進(jìn)一步明確miR-29a在乳腺癌中的作用，本研究以MCF-7細(xì)胞作為研究對(duì)象，通過(guò)脂質(zhì)體法將miR-29a mimic及miR-29a inhibitor及其相應(yīng)的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比較，轉(zhuǎn)染miR-29a mimic后細(xì)胞的遷移和侵襲的能力增加，而轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitor后細(xì)胞的遷移和侵襲的能力減少，這表明miR-29a對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力具有正向調(diào)控作用。

此外，為了進(jìn)一步研究miR-29a調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，本研究用目前常用的miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件Targetscan 7.1對(duì)miR-29a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)HBP1的3′-UTR區(qū)域存在與miR-29a不完全配對(duì)的序列，這說(shuō)明HBP1有可能是miR-29a的靶基因。HBP1(HMG盒轉(zhuǎn)錄因子1)，是一種核蛋白，人體多種組織中均有表達(dá)[14]，如大腦、子宮、睪丸、肺以及心臟等。HBP1是一種重要的腫瘤抑制因子，其抑制腫瘤機(jī)制有多種[15]：HBP1抑制轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的活性及表達(dá)；通過(guò)與p38-MAPK通路作用調(diào)控細(xì)胞周期的阻滯;參與Ras介導(dǎo)的早衰；HBP1還可阻滯Wnt-β連環(huán)蛋白信號(hào)通路從而抑制G1進(jìn)程，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。一些臨床研究表明，在浸潤(rùn)性乳腺癌中發(fā)生HBP1的突變或表達(dá)減少，并且HBP1可能調(diào)節(jié)幾種類型的乳腺癌的增殖和侵襲[16-17]。HBP1是通過(guò)抑制LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子抑制Wnt/b-catenin信號(hào)傳導(dǎo)[18]，而Wnt信號(hào)通路是會(huì)進(jìn)一步影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的[19-20]。綜合以上幾點(diǎn)推測(cè)，HBP1通過(guò)Wnt信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，因此選擇HBP1基因作為下一步研究的對(duì)象。

為了驗(yàn)證miR-29a與HBP1之間是否存在調(diào)控的關(guān)系，本研究先進(jìn)行了熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-29a直接與HBP1基因的3′-UTR區(qū)域相結(jié)合，然后又檢測(cè)了miR-29a變化后HBP1的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比較，當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29a mimic后，HBP1蛋白質(zhì)的表達(dá)下調(diào)，而細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29a inhibitor后，HBP1蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明miR-29a可負(fù)向調(diào)控HBP1蛋白的表達(dá)。然而，RT-qPCR的結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)或敲除miR-29a后，HBP1在mRNA水平上的表達(dá)沒(méi)有變化，說(shuō)明miR-29a調(diào)控HBP1的表達(dá)是通過(guò)結(jié)合HBP1的mRNA抑制其蛋白水平表達(dá)，而非使其mRNA降解，這符合miRNA調(diào)控靶基因的一般規(guī)律。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究推測(cè)，在乳腺癌中高表達(dá)的miR-29a通過(guò)下調(diào)HBP1，從而使乳腺癌細(xì)胞獲得高的遷移和侵襲能力，促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移，其具體機(jī)制可能是通過(guò)Wnt信號(hào)通路，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究確認(rèn)。

參 考 文 獻(xiàn)

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