陳 玲，陳依軍，王淑珍，吳旭日

(中國藥科大學生命科學與技術學院化學生物學研究室，南京 210009)

羅漢果(Siraitiagrosvenorii)是一種葫蘆科多年生草本植物，其成熟果實是治療咽炎、咽痛和咳嗽等的傳統(tǒng)中藥，也是開發(fā)天然低熱量甜味劑的重要來源之一[1-2]。自1983年Takemoto等[3]從S.grosvenorii果實中分離出甜味化合物羅漢果苷(mogroside,MG)Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ后，已有超過30種同系列化合物被陸續(xù)分離鑒定，它們均為羅漢果苷元[10α-cucurbit-5-ene-3β,11α,24(R),25-tetraol]連接2～6個葡萄糖單元形成的四環(huán)三萜皂苷。通過對羅漢果苷結構及其甜味的構效關系研究發(fā)現(xiàn)，結構中含3個葡萄糖單元的羅漢果苷均具有較好的甜味，但口味存在一定差別[1]。例如，羅漢果苷Ⅳ、Ⅴ和賽門苷Ⅰ的甜度分別是5%蔗糖的350倍、425倍和500倍以上，且口感相對純正[4]。在全球倡導低熱量健康飲食的大背景下，羅漢果苷無疑成為各大食品和飲料生產企業(yè)開發(fā)低(無)熱量非糖類甜味劑的熱點。

羅漢果苷作為羅漢果生長成熟過程中合成的次級代謝產物，獲得性受到季節(jié)的限制，且絕大多數(shù)羅漢果苷的天然含量較低，難以通過提取分離實現(xiàn)規(guī)模化生產，嚴重阻礙了其被開發(fā)為優(yōu)質天然甜味劑的可能性[5]。據(jù)報道，羅漢果苷Ⅴ(MG V)是羅漢果苷元3位和24位羥基分別β-連接2個和3個葡萄糖單元的皂苷，在羅漢果成熟果實中含量最高，也是目前唯一可產業(yè)化提取制備的羅漢果苷類化合物[6]。研究人員利用比較轉錄組學和體外活性驗證手段初步闡釋了羅漢果苷Ⅴ的完整生物合成途徑[7-8]。從該途徑中可以看出，羅漢果苷ⅢE(MG IIIE)是羅漢果苷Ⅴ生物合成的關鍵中間體，同樣也是多種高甜度羅漢果苷Ⅳ、異羅漢果苷Ⅴ、賽門苷Ⅰ的生物合成前體，但其在羅漢果中的含量甚微，無法提取制備。如圖1所示，選擇性水解羅漢果苷Ⅴ結構中3位和24位以β-1,6-糖苷鍵連接的葡萄糖單元即可獲得羅漢果苷ⅢE。但是，目前化學方法基本無法實現(xiàn)鍵專一性地水解羅漢果苷Ⅴ的2個β-1,6-糖苷鍵，因此，采用專一性強的糖苷水解酶建立綠色化酶法合成工藝成為最佳選擇[9-11]。本研究以價低易得的羅漢果苷Ⅴ作為底物，篩選酶庫獲得了特異性合成羅漢果苷ⅢE的糖苷水解酶CPU-GH117，通過誘導表達條件和催化反應條件的系統(tǒng)優(yōu)化，建立了羅漢果苷Ⅴ選擇性水解制備羅漢果苷ⅢE的酶法合成新工藝，為其他高甜度羅漢果苷的制備和甜味劑開發(fā)提供了物質基礎。

Figure1 Enzymatic synthesis of mogroside IIIE (MG IIIE) from mogroside V (MG V)

1 材 料

1.1 藥品與試劑

羅漢果苷Ⅴ和ⅢE(成都德思特生物技術有限公司)；卡那霉素、異丙基硫肽半乳糖苷(IPTG)(上海生工生物工程有限公司)；三羥甲基胺基甲烷、丙烯酰胺、N′,N′-甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、四甲基乙二胺(南京生興生物技術有限公司)；蛋白質相對分子質量標準(美國Fermentas公司)；乙腈和甲酸(色譜純，美國Tedia公司)；蛋白質濃度測定試劑盒(江蘇凱基生物技術有限公司)；蛋白胨和酵母粉(英國Oxoid公司)；其余試劑均為市售分析純。糖苷水解酶庫(共有57種酶)由中國藥科大學化學生物學研究室前期創(chuàng)建。

1.2 儀 器

Agilent 1260高效液相色譜儀、Agilent 6224液質聯(lián)用色譜儀(美國Agilent科技有限公司)；YMC-Pack ODS-A C18色譜柱和C18硅膠填料(日本YMC股份有限公司)；pH計(瑞士梅特勒公司)；高壓細胞破碎儀(英國Constant Systems公司)；蛋白質電泳儀(美國Bio-Rad公司)；凍干機(上海Christ儀器有限公司)。

2 方 法

2.1 羅漢果苷Ⅴ和ⅢE的HPLC分析

色譜條件：色譜柱為Agilent C18反相柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相A為超純水(含0.1%甲酸)，流動相B為乙腈(含0.1% 甲酸)，洗脫梯度為10%～90% B，梯度洗脫時間為25 min，進樣量為10 μL，柱溫為30 ℃，檢測波長為210 nm；流速為1 mL/min。在該色譜條件下，羅漢果Ⅴ和ⅢE的保留時間分別為10.0 min和11.3 min。

2.2 糖苷水解酶庫的誘導表達和篩選

糖苷水解酶庫中所有酶采用相同條件在24孔板中進行誘導表達：0.2 mmol/L IPTG、誘導溫度15 ℃和誘導時間12 h。誘導表達完成后向菌液中加入羅漢果苷Ⅴ至0.5 mg/mL，于室溫反應12 h，然后用等體積的甲醇停止反應，12 000 r/min離心10 min，上清液過濾后進行HPLC分析，以羅漢果苷ⅢE的生成情況篩選鍵專一性水解羅漢果苷Ⅴ的糖苷水解酶。

2.3 糖苷水解酶活性測定

以羅漢果苷Ⅴ的峰面積(A)對其質量濃度 (c,mg/mL) 線性回歸制作標準曲線：A=1 212c+44.977,r2=0.999 2，線性范圍為0.1～5 mg/mL。本研究以測定反應體系中羅漢果苷Ⅴ的減少量計算糖苷水解酶的活力。含糖苷水解酶的粗酶液為重組表達菌體經高壓破碎和冷凍離心所得。酶活力測定體系為1 mL，含羅漢果苷Ⅴ 1 mg和0.1 mol/L NaOAc-HAc緩沖液(pH 7.0)。1個酶活單位(U)指在35 ℃條件下每分鐘消耗1 μmol/L羅漢果苷Ⅴ所需的酶量。比活力為每毫克總蛋白所含有的活力單位數(shù)(U/mg)。

2.4 糖苷水解酶誘導表達條件考察

在0.2 mmol/L IPTG和誘導12 h條件下，分別考察誘導溫度為15、20、25、30、35 ℃時糖苷水解酶的可溶性表達量。在15 ℃和誘導12 h條件下，分別考察IPTG用量為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mmol/L時糖苷水解酶的可溶性表達量。利用最優(yōu)誘導溫度和IPTG用量考察4～24 h誘導時間條件下的糖苷水解酶可溶性表達量。

2.5 羅漢果苷ⅢE的生物合成反應條件考察

利用單因素分析方法考察了糖苷水解酶選擇性水解羅漢果苷Ⅴ制備ⅢE的pH、溫度、酶用量和底物濃度。pH考察范圍為3.0～8.0，緩沖液種類為0.1 mol/L Tris-HCl(7.5～8.0)、0.05 mol/L NaOAc-HAc(4.5～6.0)以及0.05 mol/L Na2HPO4-檸檬酸(3.0～4.0,6.5～7.0)；反應溫度考察范圍為25～65 ℃；酶量考察范圍為0.5～5 U/mL；底物濃度范圍為1～10 mg/mL。上述所有反應的體積均為1 mL，pH和溫度考察的反應時間為8 h，酶用量和底物濃度考察的反應時間為24 h。

2.6 反應體系的放大驗證

利用最優(yōu)反應條件將水解羅漢果苷Ⅴ制備ⅢE的反應體系擴大至500 mL，并于不同反應時間點取樣監(jiān)測反應進程。反應結束后，反應液煮沸5～10 min，離心去除變性蛋白質，上清液冷凍干燥制備羅漢果苷ⅢE粗品。利用C18反相柱(內徑2 cm，長度50 cm)分離純化羅漢果苷ⅢE，洗脫液為含45%乙腈的水溶液。HPLC監(jiān)測純化過程，收集含羅漢果苷ⅢE的洗脫液，干燥后獲得羅漢果苷ⅢE，最后利用HPLC檢測樣品純度。

3 結 果

3.1 糖苷水解酶的篩選

本課題組前期建立了由57種糖苷水解酶組成的酶庫，酶的來源涉及植物、真菌和細菌。本研究采用統(tǒng)一的誘導表達條件對所有酶進行了大腸埃希菌的異源表達，然后構建全細胞生物催化體系用于篩選鍵專一性水解羅漢果苷Ⅴ合成羅漢果苷ⅢE的糖苷水解酶。結果顯示，表達Saccharomycescerevisiae糖苷水解酶CPU-GH17的大腸埃希菌細胞在實驗條件下能夠催化羅漢果苷Ⅴ水解生成單一產物MG-X，而其他全細胞催化劑水解羅漢果苷Ⅴ所得產物多為混合物(圖2-A)。如圖2-B所示，MG-X與羅漢果苷ⅢE對照品的保留時間完全相同，且其實測相對分子質量[M-H]-m/z=961.538 0與羅漢果苷ⅢE的相對分子質量的計算值961.545 0一致。上述結果表明，MG-X即為羅漢果苷Ⅴ選擇性水解2個β-1,6糖苷鍵產生的ⅢE。因此，本研究選擇糖苷水解酶CPU-GH17作為生物催化劑，以建立綠色高效的羅漢果苷ⅢE酶法合成新工藝。

3.2 CPU-GH17的可溶性表達

為提高糖苷水解酶CPU-GH17的可溶性表達量，以便于后續(xù)的反應條件考察，本研究對影響大腸埃希菌中重組蛋白可溶性表達的主要因素如IPTG用量、誘導溫度和誘導時間進行了系統(tǒng)考察[12]。如圖3-A所示，CPU-GH17在SDS-PAGE中測定的相對分子質量約為50 kD，與計算的相對分子質量51.6 kD基本一致。IPTG作為一種高效的乳糖啟動子誘導劑，其濃度是影響重組蛋白表達的重要因素。如圖3-B所示，CPU-GH17的可溶性表達量在IPTG摩爾濃度為0.4 mmol/L時達到最高值，約占可溶性總蛋白的16.5%，并隨著IPTG用量增加逐漸降低。誘導溫度過高，重組蛋白容易錯誤折疊形成包涵體。溫度過低則會導致菌體生長緩慢，重組蛋白的總量減少[13]。從圖3-C中可以看出，低溫更利于CPU-GH17的可溶性表達，15 ℃的表達量可達到22.1%。在0.4 mmol/L IPTG和15℃條件下，CPU-GH17的表達量隨著誘導時間延長逐漸增加，并在12 h時達到最高值22.8%(圖3-D)。因此，CPU-GH17可溶性表達的最佳條件最終確定為：0.4 mmol/L IPTG、15℃和12 h。在該誘導條件下，CPU-GH27的比活力為0.049 U/mg。

Figure2 Selected CPU-GH17 for the biosynthesis of MG IIIE

A：HPLC analysis of (1) MG IIIE standard,(2) hydrolysis of MG V with CPU-GH17,(3) hydrolysis of MG V with CPU-GH24 and (4) MG V standard;B：LC/MS analysis of MG-X

Figure3 Optimization of expression conditions for CPU-GH17

3.3 CPU-GH17生物合成羅漢果苷ⅢE的最佳條件

3.3.1 最佳反應溫度 酶催化的反應速率與溫度密切有關，反應溫度越高越有利于反應的啟動和進行，但溫度過高會導致酶蛋白的變性失活[14]，因此溫度的選擇對CPU-GH17水解羅漢果苷Ⅴ合成羅漢果苷ⅢE至關重要。本研究考察了25～65 ℃條件下羅漢果苷ⅢE的生成效率，結果顯示，隨著反應溫度上升羅漢果苷ⅢE的生成率逐漸增加，并在45 ℃時達到最大值(圖4-A)。此外，在45 ℃條件下孵育12 h，CPU-GH17酶活力降低不超過20%。因此，最終選擇45 ℃作為最佳反應溫度進行后續(xù)反應條件的優(yōu)化。

3.3.2 最佳反應pH 反應pH的不匹配可能會導致酶變性失活以及延緩催化殘基的質子化，從而降低反應效率[14]。如圖4-B所示，糖苷水解酶CPU-GH17對反應pH變化較為敏感，其水解羅漢果苷Ⅴ的最佳pH為6.0，過高或過低都會導致反應效率的明顯降低。

3.3.3 最佳酶用量和底物濃度 由于底物抑制和產物抑制的存在，生物催化反應中的酶的用量和底物濃度一般相互關聯(lián)，互相影響[15]。為獲得CPU-GH17催化合成羅漢果苷ⅢE的最佳底物濃度，本研究在反應溫度45 ℃和pH 6.0的條件下綜合考察了底物濃度和酶用量的相互關系。如圖4-C所示，隨著酶用量的增加，底物濃度可逐漸升高，且羅漢果苷Ⅴ可完全選擇性轉化為ⅢE。但是當質量濃度超過7.5 mg/mL水平時，底物濃度的增加會造成羅漢果苷ⅢE的產率逐漸下降，這可能是由于酶失活、底物抑制以及產物抑制等影響因素中的一種或多種綜合作用所致。因此，最終確定制備羅漢果苷ⅢE的最佳條件確定為：45 ℃、pH 6.0、底物質量濃度為5 mg/mL、酶濃度為3 U/mL。

Figure4 Optimization of reaction conditions for CPU-GH17

3.4 羅漢果苷ⅢE的制備

在確定最佳反應條件后，本研究在500 mL規(guī)模(2.5 g)對其穩(wěn)定性和放大可行性進行了考察，并用HPLC監(jiān)測反應過程以確定最佳反應時間。如圖5-A所示，反應進行20 h后羅漢果苷Ⅴ即可完全水解轉化為羅漢果苷ⅢE，且隨著反應時間的推移并未出現(xiàn)羅漢果苷ⅢE的降解。在反應完成后，反應液經過加熱變性、離心去蛋白和凍干，獲得羅漢果苷ⅢE的粗品2.52 g。粗品經過C18反向柱一步純化和洗脫液濃縮凍干，最終獲得了白色粉末狀羅漢果苷ⅢE純品1.96 g，計算回收率約為77.8%，HPLC檢測純度為97.8%(圖5-B)。由此可見，本研究利用糖苷水解酶CPU-GH17建立了一種有望規(guī)模化制備羅漢果苷ⅢE的酶法合成新工藝，可為羅漢果苷甜味劑開發(fā)提供了重要合成前體。

Figure5 Bio-preparation of MG IIIE at 500 mL-scale

4 討 論

羅漢果苷ⅢE作為多種高甜度羅漢果苷化合物合成的關鍵前體，其規(guī)?；苽鋵α_漢果苷類甜味劑的開發(fā)產生重大影響[16]。在前期創(chuàng)建的糖苷水解酶酶庫基礎上，本研究利用可產業(yè)化生產的羅漢果苷Ⅴ作為底物，篩選得到能夠鍵專一性水解羅漢果苷Ⅴ制備ⅢE的糖苷水解酶CPU-GH17。以蛋白質可溶性表達量為評價指標，確定了CPU-GH17在大腸埃希菌中的最佳誘導表達條件：0.4 mmol/L IPTG、15 ℃和誘導12 h。然后，在確定CPU-GH17催化合成羅漢果苷ⅢE的最佳反應條件(45 ℃、pH 6.0、5 mg/mL底物和3 U/mL CPU-GH17)后，反應體系被放大至500 mL，驗證了工藝的穩(wěn)定性和可行性。因此，羅漢果苷ⅢE的酶法合成新工藝已基本建立，為規(guī)?；苽淦渌咛鸲攘_漢果苷提供了可能。雖然目前該工藝的底物質量濃度僅能達到5 mg/mL，但是本研究正在利用定向進化手段改造CPU-GH17，以期提高其底物和產物耐受性以及催化效率，從而大幅度提升生物合成羅漢果苷ⅢE的底物濃度并降低成本。

參 考 文 獻

[1] Wang L,Yang Z,Lu F,etal.Cucurbitane glycosides derived from mogroside IIE:structure-taste relationships,antioxidant activity,and acute toxicity[J].Molecules,2014,19(8):12676-12689.

[2] Akihisa T,Hayakawa Y,Tokuda H,etal.Cucurbitane glycosides from the fruits ofSiraitiagrosvenoriiand their inhibitory effects on Epstein-Barr virus activation[J].JNatProd,2007,70(5):783-788.

[3] Takemoto T,Arihara S,Nakajima T,etal.Studies on the constituents of fructus Momordicae.I.on the sweet principle[J].YakugakuZasshi,1983,103(11):1151-1154.

[4] Jia Z,Yang X.A minor,sweet cucurbitane glycoside fromSiraitiagrosvenorii[J].NatProdCommun,2009,4(6):769-772.

[5] Li D,Ikeda T,Huang Y,etal.Seasonal variation of mogrosides inLoHanKuo(Siraitiagrosvenorii) fruits[J].JNatMed,2007,61(3):307-312.

[6] Zhang M,Yang H,Zhang H,etal.Development of a process for separation of mogroside V fromSiraitiagrosvenoriiby macroporous resins[J].Molecules,2011,16(9):7288-7301.

[7] Itkin M,Davidovich-Rikanati R,Cohen S,etal.The biosynthetic pathway of the nonsugar,high-intensity sweetener mogroside V fromSiraitiagrosvenorii[J].PNatlAcadSci2016,113(47):E7619-E7628.

[8] Qi T,Ma X,Mo C,etal.An efficient approach to findingSiraitiagrosvenoriitriterpene biosynthetic genes by RNA-seq and digital gene expression analysis[J].BmcGenomics,2011,12(1):343-355.

[9] Van LJ,Faijes M,Nieto J,etal.Hydrolase and glycosynthase activity of endo-1,3-beta-glucanase from the thermophilePyrococcusfuriosus[J].Archaea,2004,1(4):285-292.

[10] Michlmayr H,Varga E,Malachova A,etal.A versatile family 3 glycoside hydrolase from bifidobacterium adolescentis hydrolyzesβ-glucosides of theFusariummycotoxins deoxynivalenol,nivalenol,and HT-2 toxin in cereal matrices[J].ApplEnvironMicrob,2015,81(15):4885-4893.

[11] Wang H,Yan Y,Lin L,etal.EngineeringSaccharomycescerevisiaewith the deletion of endogenous glucosidases for the production of flavonoid glucosides[J].MicroCellFact,2016,15(1):134.

[12] Francis DM,Page R.Strategies to optimize protein expression inE.coli[J].ProtocProteinSci,2010,5(24):1-29.

[13] Kaur J,Kumar A,Kaur J.Strategies for optimization of heterologous protein expression inE.coli:roadblocks and reinforcements[J].IntJBiolMacromol,2018,106:803-822.

[14] Vera C,Guerrero C,Wilson L,etal.Optimization of reaction conditions and the donor substrate in the synthesis of hexyl-β-d-galactoside[J].ProcessBiochem,2017,58:128-136.

[15] Prajapati VS,Trivedi UB,Patel KC.Optimization of glucoamylase production byColletotrichumsp.KCP1 using statistical methodology[J].FoodSciBiotechnol,2013,22(1):31-38.

[16] Mooradian AD,Smith M,Tokuda M.The role of artificial and natural sweeteners in reducing the consumption of table sugar:a narrative review[J].ClinNutrEspen,2017,18:1-8.